一種用于細胞核成像的新型雙光子熒光探針

1、Vol .30高等學?；瘜W學報No .32009年3月CHE M I CAL JOURNAL OF CH I N ESE UN I V ERSI TI ES 465467研究快報一種用于細胞核成像的新型雙光子熒光探針劉鑫1,劉恒1,賈鵬飛1,張波1,王軍杰2,趙寧2,張元紅2,于曉強2(1.蘭州大學生命科學學院,蘭州730000;2.山東大學晶體材料國家重點實驗室,濟南250100關鍵詞雙光子熒光探針;雙光子熒光成像;核酸中圖分類號O657文獻標識碼A 文章編號025120790(20090320465203 收稿日期:2008212202.基金項目:國家自然科學基金(批準號:50673053

2、,NSFC /RGC 50218001,50173015和30771091資助.聯(lián)系人簡介:劉恒,男,博士,副教授,主要從事細胞生物學研究.E 2mail:hengliulzu .edu .cn于曉強,男,博士,教授,主要從事雙光子材料研究.E 2mail:yuxqsdu .edu .cn與共焦顯微鏡相比,雙光子熒光顯微鏡(TP M 在生命科學研究中具有較大的優(yōu)勢1.其表現(xiàn)在避免了生物樣品的紫外光損傷、光漂白和焦平面外的熒光干擾等.檢測光路中不采用小孔光柵,對成像多自發(fā)熒光和高散射樣品也有獨特的優(yōu)勢2,因此被認為是生物成像領域革命性的發(fā)展3.然而,雙光子熒光顯微鏡的進一步應用卻因缺乏具有優(yōu)良雙

3、光子熒光探針而受到制約4,5.單光子和雙光子的吸收過程遵循不同的選擇規(guī)則6,因此傳統(tǒng)探針的雙光子熒光活性吸收截面(×較小,量子產(chǎn)率偏低7.大雙光子熒光活性吸收截面的探針分子的缺乏制約了雙光子熒光顯微鏡對激光共焦顯微鏡的競爭力.目前,雙光子熒光探針的設計和合成已經(jīng)引起廣泛的關注8.核酸是與生命活動和疾病密切相關的生命大分子,但針對核成像的雙光子核酸熒光探針的研究卻鮮有報道9.一些利用雙光子顯微鏡的研究仍使用小吸收截面的Hochest 和DAP I 等傳統(tǒng)探針10.本文報道了具有大雙光子活性吸收截面的DNA 探針BMVEC,同時首次利用雙光子顯微鏡完成了與DAP I 的復染實驗,實驗結果

4、證實了BMVEC 對細胞核的選擇性標記能力.1實驗部分1.1探針的合成首先,用N 2乙基咔唑通過V ils meier 反應合成中間體92乙基23,62二甲?；沁?同時利用碘甲烷合成中間體42甲基2N 2甲基碘鹽.然后在哌啶的催化下以甲醇為溶劑用2個中間體合成最終產(chǎn)物3,62雙(12甲基242乙烯基吡啶292乙基咔唑碘鹽(BMVEC (Sche me 1,經(jīng)過核磁、質譜和元素分析證明其為目標產(chǎn)物.Sche m e 1Syn theti c routes of B M VEC1.2光譜性質的測定吸收光譜和熒光光譜用Perkin El m er La mbda 235和H I T ACH F 2

5、4500測定;雙光子熒光用Spectr oPr o300i 記錄,泵浦光源為CoherentM ira9002D 飛秒脈沖激光.1.3細胞培養(yǎng)及染色采用人宮頸癌Hela 細胞,DME M 培養(yǎng)基培養(yǎng).染色后用Zeiss LS M (Laser Sca 2ning M icr oscopy,德國510成像.2結果與討論2.1探針與DNA 相互作用的吸收光譜為了闡明探針和雙鏈DNA 的作用機理,進行了紫外光譜監(jiān)控下DNA 對探針的滴定實驗(見圖1.由圖1可見,隨著DNA 的加入,探針的線性吸收光譜明顯改F i g .1D NA concen tra ti on dependen t absorpt

6、i on property1.UV 2V is s pectra of free BMVEC;針分子完全結合時的吸收光譜.在自由狀態(tài)下,吸收峰在444n m 處的吸光度為011359,隨著DNA 的不斷加入,吸收峰逐漸紅移,也出現(xiàn)了明顯的增色效應.當DNA 的加入量達到飽和時,吸收峰和吸光度不再變化,峰位和吸光度分別為466n m 和012127.說明探針分子和DNA 之間存在著相互作用,一般認為這種相互作用體現(xiàn)為探針分子插入了DNA 分子的溝渠中,這是DNA 分子光開關的常見現(xiàn)象11,實驗中的探針分子先發(fā)生減色效應,隨后發(fā)生增色效應,這在DNA 探針的研究中尚未見報道.2.2溶劑和DNA 對

7、探針熒光量子效率的影響表1給出了探針的一系列光譜測試數(shù)據(jù),其中,1和2是線性吸收和單光子熒光的峰位,A 是吸光度,是摩爾消光系數(shù),是量子產(chǎn)率,和×分別是雙光子吸收截面和活性吸收截面.表1中的數(shù)據(jù)說明,探針分子存在明顯的溶劑化效應.在水相中,BMVEC 只有很低的熒光量子效率,在有機相中,探針的值有很大增加,當探針分子完全結合到DNA 中時,其量子效率達到3018%,與水相中相比增加了181倍.完全達到了DNA 分子光開關的要求.可以認為這是由以下兩個因素所致:(1當BM 2VEC 插入到DNA 的溝渠中后,周圍不再有猝滅熒光的水分子12;(2結合作用使探針的分子內扭曲運動受阻,分子的

8、剛性增加,提高了BMVEC 輻射躍遷的比例13.Table 1Spectroscop i c da t a of B M VEC i n var i ous env i ronm en ts Solvent1/nm 2/nm A /a .u ./(L mol -1c m -1(%/G M ×/G M Ethanolspectra w ith the add iti on of D NA i n to aqueous soluti on s of B M VEC Excited wavelength:800nm.這是BMVEC 能夠成為雙光子熒光探針的基本因素.當DNA 堿基對與探針分

9、子的摩爾比14達到151251時,雙光子熒光增加達到飽和.與探針分子在水相中的雙光子熒光強度相比,飽和DNA條件的雙光子熒光放大了37倍.根據(jù)表1中的實驗結果,BMVEC 也有較大的雙光子吸收截面和雙光子活性吸收截面.傳統(tǒng)的DNA 熒光探針,如DAP I 的雙光子吸收和活性截面分別為7和0116G M 4.文獻報道的兩個雙光子熒光探針的吸收截面分別為350和700G M ,活性截面則未見報道9.2.4雙光子熒光顯微鏡下的雙染實驗鑒于細胞環(huán)境中有許多生物大分子的干擾,為了驗證BM 2VEC 作為雙光子生物熒光探針的潛力,以固定后的人體宮頸癌Hela 細胞為觀測樣品,進行雙染試驗.首先用011mo

10、l/L 的BMVEC 染色30m in,然后再用1mol/L 的DAP I 復染5m in .經(jīng)實驗證實兩者的成像光路互不交叉,然后分別選用它們各自的光路成像,BMVEC 和DAP I 的成像光路分別為535590nm 和435485nm ,激發(fā)光波長均為800n m ,功率分別為總功率的3%(BMVEC 和8%(DAP I .做圖片疊加,實驗結果如圖3所示.圖3(A 為BMVEC 的熒光圖像,圖3(B 是DAP I 的熒光圖像,兩者熒光成像的位置、形態(tài)和數(shù)量完全一致,說明664高等學?；瘜W學報Vol .30 F i g .3Cost a i n i n g photos of B M VEC

11、 and DAP IBMVEC 具備與DAP I 相同的細胞核定位能力.圖3(C 為藍色(代表DAP I 和紅色(代表BMVEC 的疊加圖,進一步證實了兩者的一致性,充分證明BMVEC 是極具有潛力的核成像的雙光子熒光探針.參考文獻1Hel m chen F .,Denk W.Nat .MethodsJ ,2005,2(12:9329402Denk W.,Strickler J.H.,W ebb W.W.ScienceJ ,1990,248:73763Masters B.R.,So P .T .C .M icr osc .Res .Tech .J ,2004,63(1:3114So P .T

12、.C .,Dong C .Y .,Masters B.R.,et al .Annu .Rev .B i omed .Eng .J ,2000,2:3994295Y U Xiao 2Q iang (于曉強,T AO Xu 2Tang (陶緒堂,J I A NG M in 2Hua (蔣民華.University Che m istry (大學化學J ,2008,23(1:176Goppert 2MayerM.Ann .Phys .(Lei pzig J ,1931,9:2732947Xu C .,W ebb W.W.J.Op t .Soc .Am.B J ,1996,13:4814918Ki m

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14、Fluorescence Probe for Nuclear D NA I mag i n gL I U Xin 1,L I U Heng 13,J I A Peng 2Fei 1,ZHANG Bo 1,WANG Jun 2J ie 2,ZHAO N ing 2,ZHANG Yuan 2Hong 2,Y U Xiao 2Q iang 23(1.School of L ife Science,L anzhou U niversity,L anzhou 730000,China;2.S tate Key L ab of C rystal M aterials,Shandong U niversit

15、y,J inan 250100,China Abstract A ne w t w o 2phot on fluorescence DNA p r obe,BMVEC,with bigger ×(1437G M was synthe 2sized .The abs or p ti on titrati on shows that there is an interacti on bet w een BMVEC and DNA because the p r obe can intercalate the gr ooves in the double helix of DNA ,whi

16、ch enhances its t w o 2phot on fluorescent intensity .Mean while the double 2staining results in cancer cells by means of TP M de monstrate the exclusive nucleic labe 2ling ability of BMVEC,and the positi ons and a mounts of nuclei labeled by BMVEC are wholly the identical as those by DAP I .Moreover,the incident po wer of BMVE