豬繁殖與呼吸綜合征疫苗研究進展 (1).docx

1、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗研究進展谷元興，王猛，劉永生，張杰（中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室農業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，農業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室，甘肅蘭州730046）摘要：豬繁殖與呼吸障礙徐合征（PRRS）是一種危害養(yǎng)豬業(yè)的璃毒性傳染疾病，具有很高的傳染姓和致死率.目詢還沒有根除該病的有效方法，主要以預防為主.疫苗免疫在預防疾病的發(fā)生和流行中發(fā)揮了巨大作用，因而受到充分至視并迅速發(fā)展.名,者將對近年來PRRS疫苗包括常規(guī)疫苗（滅活疫苗、弱毒疫苗）和新型基因工程疫苗（DNA疫苗、亞單位疫苗、活我體疫苗）的研究進展作一綜述.收稿日期：2009-12-30基

2、金項目：甘肅省科技重大專項（0801NKDA034）作者簡介：谷元興（1983-）,男，碩士，山東A南人，主要從事病毒分子生物學和免疫學研究.通訊作者：劉永生.關鍵詞：指繁殖與呼吸綜合征；預防；常規(guī)疫苗；新型疫苗豬的呼吸系統疾病、繁殖障礙性疾病、腹瀉病是目前公認的制約我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的三大疾病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經濟損失。豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）俗稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種主要以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為臨床特征，各日齡豬只均可感染的接觸性傳染病，同時也是日前導致

3、我國養(yǎng)豬業(yè)三大疾病的主要元兇之一。1987年在美國首次發(fā)現PRRS臨床病例，隨后幾年時間該病便席卷了北美洲和歐洲大陸。1991年，荷蘭Lelystad中央獸醫(yī)研究所WensvoortG等利用肺泡巨噬細胞（PAMs）分離到病毒，并命名為Lelystad病毒（LV）,這是科學家首次分離到PRRSV。】。1996年，郭寶清等首次從豬流產胎兒中分離到PRRSV,證實豬繁殖與呼吸綜合征也存在于我國2006年5月份至2007年底，我國暴發(fā)了變異美洲型高致病性藍耳病，全國養(yǎng)豬業(yè)遭到重創(chuàng)，直接經濟損失達到12億元“F。根據國際動物衛(wèi)生組織（OIE）的公布情況，目前世界上除澳大利亞、新西蘭等極少數國家外，其他大

4、部分國家和地區(qū)都存在PRRS3J。雖然世界各國都對該病的致病機理及流行傳播方式進行了多方面研究，但至今還未找到根除的有效方法。利用疫苗免疫不僅能夠減少抗生素的濫用，降低藥物殘留，從而保證食品安全，而且能夠降低養(yǎng)殖成本，使用也更為簡捷。為此各國相關專家對PRRS疫苗做了大批的研究，力圖有所突破，給養(yǎng)豬業(yè)帶來福音。1常規(guī)疫苗PRRS滅活苗和PRRS弱毒苗是目前生產實踐中應用較多的兩種疫苗。雖然目前很多學者對這兩種疫苗的使用存在著分歧，但滅活苗安全性好，弱毒苗保護力強的說法還是得到了大多數學者的認同。1.1PRRS滅活苗滅活苗是將致病性病原體大量培養(yǎng)后進行滅活處理，使其失去感染性而保留免疫原性制得的

5、疫苗。滅活疫苗是較早研制的疫苗，使用后主要刺激豬體產生體液免疫反應。因其是死苗，故最大的優(yōu)點是安全、不散毒、便于儲存和運輸。Ba-yer公司于1997年首次推出了滅活疫苗PR-RomiSetM,目前我國已有20家企業(yè)被農業(yè)部批準生產PRRS滅活疫苗:CH-la株（哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司）和NVDC-JXA1株（浙江易邦生物技術有限公司等19家），主要用于PRRS陰性豬場的免疫。國內學者郭寶清等曾利用國內分離的PRRSVCH-la毒株，經甲醛滅活后制成PRRS油乳劑滅活疫苗.隨后的免疫效力試驗和免疫攻毒試驗表明其具有一定的免疫效果，在首免后5d就可檢測到病毒特異性抗體，20d左右抗體就可達到

6、高峰，并可持續(xù)6個月左右，具有較長的免疫保持期。PlanaDuran"曾報道應用西班牙毒株研制成一種油佐劑滅活疫苗，用于保護后備母豬取得了良好的效果；加拿大Ro-gan的研究表明：用PRRS滅活苗免疫豬后，可以刺激豬產生針對ORF5、ORF6、ORF7所編碼的蛋白的抗體，而且可以減少豬病毒血癥的發(fā)生。但Nielsen等應用此種疫苗免疫公豬卻未取得明顯的保護效果，滅活苗抗原成分不高以及滅活過程中主要抗原決定簇的丟失而使抗原性減弱，接種后產生的免疫應答很弱甚至檢測不到特異性抗體反應，不能產生足夠的免疫保護力。Nilubol等報道滅活疫苗免疫后攻毒不能保護仔豬對PRRS病毒的感染，病毒感染

7、后病毒血癥的持續(xù)時間和病毒的滴度與非免疫組無顯著差別。美國學者HJooC123曾在經過PRRS滅活疫苗免疫過2次的母豬群中，隨機挑選2頭妊娠100d和6頭妊娠80-90d的母豬，采用ORF5核昔酸序列同源性為82.1%84.4%的PRRS異源毒進行攻毒試驗，結果有7頭流產，共產死胎63只、活仔14只?？梢奝RRS滅活苗不能夠適應PRRSV有很強的變異性特點，對PRRS異源株免疫效果不理想。而且存在著免疫劑量大、免疫次數多和免疫產生期較長等缺點，因此單純利用PRRS滅活苗來預防PRRS的發(fā)生及流行是遠遠不夠的。1.2PRRS弱毒苗PRRS弱毒疫苗是將PRRS病毒株接種易感細胞后經多次傳代培養(yǎng)，使

8、其毒力減弱至不具有致病性但能引起機體高度的免疫反應，產生大量相應的抗體，從而對機體起到保護作用的一種常規(guī)疫苗。自從BoehringerIngelheim公司于1995年首次推出商品化減毒疫苗RespPRRS/Repro®以來，PRRS弱毒苗以其免疫保護期長、保護率高、免疫劑量小等優(yōu)點受到不少專家學者和養(yǎng)殖業(yè)主的親睞。該疫苗也從開始只被允許用于318周齡豬的預防接種，發(fā)展到繁殖豬群的預防接種，并且針對不同年齡段豬群對該種疫苗的應用正在緊鑼密鼓的研究之中。目前我國自主研發(fā)的CH-1R株、R98株JXA1-R株等PRRS活疫苗也紛紛面市購。胡守萍等U"分別采用(PRRSV)CH-

9、IR致弱毒疫苗株和變異毒株滅活疫苗免疫接種40-45日齡仔豬，4周后用高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)HuN-4變異株強毒攻毒，攻毒21d后剖檢，結果顯示變異毒株滅活疫苗免疫攻毒后導致的病理變化和病毒抗原分布程度均明顯高于CH-1R弱毒疫苗免疫組。免疫病理學研究結果表明CH-1R弱毒疫苗對HU-4株強毒免疫保護效果好于變異毒株滅活疫苗。KritasSKL，5J等人在一個流行PRRS的豬場，應用英特威生產的弱毒疫苗(PorcilisPRRSVaccine)后，免疫組豬的產仔率(89%)顯著高對照組(78%),而且每窩產活仔數及斷奶仔豬存活數增加，返情率下降。然而對于應用PRRS

10、弱毒苗而引起的負面作用的報道也不少。有學者在商品化減毒活疫苗株IngelvacHPRRSMLV使用過的豬場分離到1株PRRSV,經測序表明，該毒株來源于疫苗株，但出現了疫苗株所不具有的致病性，并引起免疫豬出現肺部病變，揭示了使用PRRS的潛在危險性I”】。丹麥的Mortensen等口試驗證明，用PRRS弱毒苗接種母豬后，會對母豬的繁殖性能造成不利影響，甚至可通過子宮感染仔豬。另有一些研究表明，弱毒疫苗毒株可以從免疫母豬傳播給未免疫豬，導致后者出現繁殖障礙；弱毒疫苗毒株還存在毒力返強的危險W-購。因此prrs弱毒苗還是一把雙刃劍，其散毒和每力返強的可能性成為最大的安全隱患，不建議PRRS陰性豬場

11、使用該疫苗，在某些國家甚至禁止使用。2新型基因工程疫苗鑒于滅活苗和弱毒苗各自的特點，要想很好的控制PRRS的發(fā)生和流行，開發(fā)新型PRRS抗原替代品迫在眉睫。蓬勃發(fā)展的分子生物學技術和PRRSV基因組的全序列測定以及病毒基因及其編碼蛋白的結構和功能的研究，為新型基因疫苗的研發(fā)奠定了基礎。一些能夠編碼具有誘導產生中和抗體蛋白的基因如ORF5.ORF6相繼被確認，使基因工程苗的研制展現出廣闊的前景。目前對PRRS基因工程疫苗研究比較多的有DNA疫苗、亞單位疫苗和活載體疫苗，此類疫苗的研制已經成為當今的主流并取得了可喜的進展。2.1DNA疫苗DNA疫苗又稱核酸疫苗，是利用分子生物學技術將能夠編碼病毒保

12、護性抗原的基因導入宿主細胞內，宿主細胞會利用自身的轉錄系統合成保護性抗原，從而誘導產生中和抗體達到抵抗外來病毒的目的。DNA疫苗具有成份單一，生產工藝簡單，免疫劑堂小，安全性相對較高等優(yōu)點，并且可人為的進行修飾，同時誘導體液免疫和細胞免疫。其中較為典型的是對GP5的研究。GP5是由ORF5編碼的，含有PRRSV主要的B細胞表位，能誘導機體產生特異性中和抗體。Kwang等網制備了分別表達PRRSV的ORF4、ORF5、0RF6及ORF74種結構蛋白的DNA疫苗并用于動物試驗，結果86%的豬產生了明顯的細胞免疫反應。通過ELISA、中和試驗及Western-blot檢測發(fā)現71%的豬產生了病毒特異

13、性抗體，對照組沒有產生針對PRRSV的免疫反應，試驗表明該DNA疫苗可誘導體液免疫和細胞免疫的產生。SuiHui等將PRRSV的ORF5基因克隆至真核表達裁體pIRESlneo的CMV啟動子下游，然后用豬2型圓環(huán)病毒（PCV2）的ORF2基因替換pIRESlne。中的ne?；颍晒嫿酥亟M表達質粒plRES-ORF2-ORF5。免疫小鼠后發(fā)現其脾T淋巴細胞亞群數髭顯著高于滅活疫苗免疫組，說明所構建的二聯苗能夠誘導小鼠產生較好的體液免疫反應和細胞免疫反應。Hou等用含編碼ORF5的質粒進行DNA免疫，可使接種豬產生抗ORF5的特異性中和抗體，接種豬沒有出現強毒攻擊造成的全身性病毒血癥和肺部病

14、變，并且間質性肺炎和支氣管肺泡炎明顯減輕。DNA疫苗作為一種新型疫苗展現出了很好的應用前景，但其免疫效果的確切性，個體差異性對免疫效果的影響以及是否受母源抗體的影響，外源基因導人帶來的不良后果如免疫耐受、免疫抑制等問題還需進一步研究?？傮w看來DNA疫苗的研究還正處于實驗室研究階段，在真正投入生產實踐之前，還要在相應的臨床動物模型中進行細致的研究，積累大量的實驗數據。2.2亞單位疫苗利用化學分解或蛋白質水解的方法，提取細菌、病毒的特殊匱白質結構，篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗即為亞單位疫苗。直接從病原中提取病毒蛋白作為亞單位疫苗的生產成本較高，因此各國專家正試圖利用基因重組技術研制PRRS亞

15、單位疫苗，即將含有PRRV保護性抗原基因的片段導入受體細胞，高效表達后提取產物，加入佐劑而制成。該種疫苗僅包含幾種主要抗原決定簇，所以能避免許多無關抗原誘發(fā)抗體，從而減少疫苗的副反應。Pirzadeh等網用帶PRRSV-ORF5基因的質粒DNA接種豬，豬體內能誘導產生抗GP5的中和抗體，并引起細胞免疫反應，阻止病毒血癥的發(fā)展，可見ORF5在豬體內得到表達并引起了免疫反應。Duran等羽將PRRSV西班牙株Olot/91的ORF2-7分別插入到重組的桿狀病毒的多角體蛋白啟動子下游，應用sf9細胞進行表達，結果得到了ORF3、ORF5和ORF7基因表達生成三種的產物，分別加入油佐劑制成只含一種產物

16、及含三種產物的四種疫苗，通過肌肉注射免疫懷孕2030d的母豬，21d后加強免疫。在配種后70-90d用病毒滴度為106.1TCID50/mlPRRSV對妊娠母豬進行攻毒，每頭5ml。結果發(fā)現ORF3和ORF5的表達產物能提供一定的免疫保護，保護率分別為68.4%和50%,并能阻止病毒復制。用ORF7表達產物免疫的母豬產生了強烈的IPMA抗體應答，但不能使所產仔豬得到保護，甚至干擾了其他產物的保護作用。該試驗結果提醒人們ORF3和ORF5單獨或者聯合的表達產物可以作為研制PRRS疫苗的良好抗原。另有有專家用牛結核分枝桿菌表達了截短前30個堿基的PRRSVORF5基因和全長的ORF6基因，利用表達

17、產物制成疫苗免疫豬，30d后用Western-blot.ELISA等方法可以檢測到針對PRRSV的特異性抗體，免疫60d后可以檢測到有3/4的豬產生了中和抗體，而且攻毒后病毒血癥持續(xù)期明顯縮短皈。目前亞單位疫苗的不足之處主要表現在免疫原性相對較低，對佐劑的依賴性較大,這就需要在研制此類疫苗時除了要尋找免疫活性較高的特定抗原和高效的表達系統外，還必須開發(fā)出合適的佐劑，例如利用免疫系統中固有的細胞因子（11,一2、IL-12JL-18）.補體分子及裂解物等作為免疫佐劑來提高其免疫效果已經成為該領域的研究熱點。2.3活載體疫苗用基因工程的方法對某些細菌和病毒進行改造，使之失去致病性并且具有充當病原微

18、生物活載體的功能，即將致病微生物的免疫相關基因整合到充當活載體的病毒或細菌基因組中，然后將其接種到動物體內，從而刺激動物機體產生相應的抗體?；谶@種思想，對于PRRS活載體疫苗的研究也變得非?；钴S。目前運用比較多的載體微生物主要有傳染性胃腸炎病毒、腺病毒、痘病毒、大腸桿菌、沙門氏菌等，在PRRS活載體疫苗研究中也不例外。Alonso等頑首次以傳染性胃腸炎病毒（TGEV）活病毒為載體制備PRRSV活病毒載體疫苗，利用TGEV輔助表達系統，構建表達Gp5的重組TGEV,采用滴鼻、口服和胃腸道三種途徑聯合免疫7d齡仔豬，共免疫三次（間隔7d）,末次免疫7d后采血，通過ELISA可檢測到很高的GP5特

19、異性抗體。ShenGuoshun等構建了能表達PRRSVORF5ORF3和IL-18-ORF5-ORF3重組雞痘病毒活載體，對豬初免后21d加強免疫，60d后進行攻毒。結果表明，該重組病毒能有效刺激豬外周血中T淋巴細胞的增殖和一干擾素的產生，經過ELISA檢測和病毒中和試驗都可以檢測到針對PRRSV的特異性抗體。試驗組豬的體溫、病毒血癥及支氣管淋巴結中的病毒員顯著低于對照組，表明該重組疫苗對PRRSV有一定的免疫保護作用。由于該疫苗能主動感染宿主細胞，因此可以減少疫苗用歧少，并且不需添加佐劑。在免疫效果方面該種疫苗兼有死疫苗和活疫苗的優(yōu)點，可以同時啟動機體細胞免疫和體液免疫。更具吸引力的是活載

20、體疫苗可以同時構成多價以至多聯疫苗，達到一苗防多病的效果。3展望針對PRRS的病原特點與流行現狀，尤其是我國集約化養(yǎng)殖不發(fā)達，防疫技術水平相對低下并且預防工作過分依賴于疫苗的情況下，加快新型疫苗的研究并且市場化已經刻不容緩。然而在研制疫苗時我們還遇到不少問題與挑戰(zhàn)，如PRRSV的逃避宿主免疫的機理尚不清楚，PRRSV和其他病原的相互影響也不明了，PRRSV毒株易變異且變異方向難以預測等。因此進一步的研究要在針對PRRSV的基礎研究方面下大力氣，只有對PRRSV有一個科學準確的認識才能為疫苗的成功研制提供保障。在疫苗的臨床試驗方面不僅要針對PRRSV陰性豬，還要針對帶其他病原如PPV.HCV等的

21、豬，這樣才更具有現實意義。此外，對于疫苗安全性評價技術的研究，相關法規(guī)的配套，疫苗佐劑的開發(fā)等工作也應緊跟步伐。相信在不久的將來，高效安全、質美價廉的PRRS疫苗將被廣泛的使用。參考文獻：1 KcffabcrKK.ReproductiveFailureofUnknownE-tiologyJ.AmAssocSwinePractNcwsl.1989,(1) ：l-9.2 WensvoortG,TerpstraC*PolJM,etal.MysterySwineDiseaseintheNetherlands：theIsolationofLelystadVirusJ.TheVeterinaryQuart

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