化療藥物體外誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡的臨床意義

1、    化療藥物體外誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡的臨床意義        我們采用TdT介導(dǎo)的脫氧核苷酸切口和缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）及超微結(jié)構(gòu)觀察等方法，對(duì)18例初治急性髓系白血?。ˋML）患者骨髓白血病細(xì)胞進(jìn)行體外化療藥物誘導(dǎo)凋亡與臨床療效關(guān)系的初步研究，以探討體外化療藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡在臨床化療療效預(yù)測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 病例和方法1病例和標(biāo)本18例初治AML患者來(lái)自第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院血液科和上海醫(yī)科大學(xué)華山醫(yī)院血液科。其中男8例，女10例；中位年齡46 歲（1

2、470歲）； M1 1例，M2 9例，M31例，M4 4例，M5 2例，M7 1例。所有患者均經(jīng)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)（M7經(jīng)電鏡及單抗）檢測(cè)確診。化療采用HA（高三尖杉酯堿24mg/m2、阿糖胞苷100150mg/m2）、DA（柔紅霉素40mg/m2、阿糖胞苷100150mg/m2）方案。完全緩解（CR）與未緩解（NR）判別按國(guó)內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)?；熐俺槿⌒迈r骨髓, 抗凝,用分離液分離單個(gè)核細(xì)胞備用。2化療藥物體外誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡單個(gè)核細(xì)胞濃度為1×106/ml, 分別孵育于高三尖杉酯堿(HHT)2mg/L,柔紅霉素(DNR)1.0mol/L，阿糖胞苷(Ara-C) 1.0mol/L，HHT

3、(2mg/L)+Ara-C (1.0mol/L)，DNR (1.0mol/L)+Ara-C (1.0mol/L)，作用18h。以上藥物終濃度的選擇參考萬(wàn)景華等1的方法及我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3白血病細(xì)胞bcl-2表達(dá)檢測(cè)所用單抗bcl-2（124）購(gòu)自上海華美公司（丹麥DAKO公司產(chǎn)品）。HRP-DAB藥盒購(gòu)自美國(guó)Labvision公司。細(xì)胞涂片（細(xì)胞濃度為2×106/ml）后丙酮固定，過(guò)氧化氫作用后微波抗原修復(fù)。加bcl-2單抗，37濕盒作用30min，加生物素化二抗,室溫作用10min，加辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素工作液（Streptavidin/HRP）室溫作用10min，最后以3,3-二

4、氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞，并計(jì)算其陽(yáng)性率。參照10例良性血液病患者的結(jié)果，bcl-2表達(dá)>15為陽(yáng)性。4凋亡檢測(cè)4.1 Wright-Giemsa染色: 細(xì)胞離心涂片染色,光鏡下計(jì)數(shù)具有明顯凋亡特征的細(xì)胞(細(xì)胞縮小, 核染色質(zhì)凝聚,核碎裂等)。4.2TUNEL法檢測(cè)片段化DNA: 主要步驟為用體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醛固定細(xì)胞,以Triton X-100穿透細(xì)胞,洗滌后滴片, 晾干。用dUTP-熒光素標(biāo)記試劑盒(購(gòu)自德國(guó)保靈曼公司上海分公司)進(jìn)行溫育反應(yīng)(每份標(biāo)本均設(shè)立陰性對(duì)照, 即不加關(guān)鍵的TdT酶)。然后加抗熒光素-AP, 再加底物5-溴-4-氯-3-吲哚基

5、-磷酸(BCIP)和氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT)，將基于熒光素的TUNEL檢測(cè)轉(zhuǎn)化為顯色法。陽(yáng)性細(xì)胞被染成藍(lán)黑色。計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并以骨髓分離后白血病細(xì)胞比例作校正。4.3透射電鏡標(biāo)本制備: 細(xì)胞用PBS洗滌后,用戊二醛和鋨酸固定后進(jìn)行漂洗、脫水、包埋、超薄切片，染色并晾干后以透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)。5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。結(jié)果1化療藥物體外誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡結(jié)果見(jiàn)表1。組別例數(shù)HHTDNRAra-CHHT+Ara-CDNR+Ara-CCR組11Wright-Giemsa染色28.1±2.5*35.8±6.4*33.9&

6、#177;4.2*36.1±5.5*42.1±7.9*TUNEL法39.3±9.7*45.0±9.4*40.7±5.7*40.7±9.3*53.3±7.5*NR組7Wright-Giemsa染色21.0±2.317.9±5.022.7±4.721.1±2.322.6±3.0TUNEL法24.6±2.723.3±4.226.4±7.426.7±4.027.3±3.9     注:與NR組比

7、較，*P<0.05 表1結(jié)果表明, CR患者化療前白血病細(xì)胞體外對(duì)化療藥物的敏感性均高于NR患者（P值均<0.05）。在所有的實(shí)驗(yàn)組中，TUNEL標(biāo)記法的敏感性普遍高于Wright-Giemsa染色法。2白血病細(xì)胞bcl-2表達(dá)與體外化療藥物誘導(dǎo)凋亡及臨床療效的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表2。表2白血病細(xì)胞bcl-2表達(dá)與體外化療藥物誘導(dǎo)凋亡及臨床療效的關(guān)系例號(hào)性別年齡(歲)診斷bcl-2表達(dá)凋亡*(%)化療方案療效1男22M4-40DACR2男70M2+47HACR3男44M2-53HACR4女46M4-54DACR5男48M7-55DACR6男38M3-61HACR7男39M5+58HACR8

8、男54M2-65DACR9女40M1+51HACR10女54M2-61DACR11女47M4+54DACR12男41M5+29HANR13女55M2+25HANR14女63M2+25DANR15女14M2+21DANR16女58M2-30HANR17女16M4+31DANR18女44M2+30DANR     注:*根據(jù)化療方案取DNRAra-C或HHTAra-C誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡值(TUNEL法檢測(cè)結(jié)果) 表2顯示11例獲CR者化療藥物誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的百分率為4065，7例bcl-2表達(dá)陰性；7例NR者，化療藥物誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的百分率為2131，6例bcl-2表

9、達(dá)陽(yáng)性。3化療藥物濃度和作用時(shí)間與誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表3。表3不同濃度化療藥物作用不同時(shí)間白血病細(xì)胞凋亡率的比較組別不同時(shí)間凋亡細(xì)胞(%)6h12h18h對(duì)照組1.53.55.0HHT組2ml/L8.518.030.520ml/L24.035.636.5200ml/L26.538.542.4DNR組0.1mol/L12.223.532.81.0mol/L17.530.044.510.0mol/L25.035.552.2Ara-C組0.1mol/L6.011.518.51.0mol/L2.426.443.610.0mol/L17.841.068.5   

10、  表3示例9患者白血病細(xì)胞不同濃度化療藥物作用不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率。從表中可以看出，該患者白血病細(xì)胞對(duì)三種化療藥物誘導(dǎo)凋亡均呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。4形態(tài)學(xué)變化經(jīng)化療藥物作用的白血病細(xì)胞在光鏡下出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征，即細(xì)胞體積縮小、核固縮、染色質(zhì)凝集，并有凋亡小體形成。電鏡下觀察，胞質(zhì)空泡化，各種細(xì)胞器均出現(xiàn)不同程度的萎縮，胞膜尚完整，核固縮、碎裂，凋亡小體易見(jiàn)。 討論臨床上對(duì)初治患者合理地選用誘導(dǎo)凋亡敏感的藥物是患者獲得長(zhǎng)期持續(xù)緩解的重要因素。國(guó)外學(xué)者近年來(lái)在這方面已作了一些探索。Csoka等2采用化療初6h外周血幼稚淋巴細(xì)胞凋亡指數(shù)評(píng)估急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）對(duì)糖皮質(zhì)激素

11、的敏感性，結(jié)果顯示凋亡率與臨床療效有很好的相關(guān)性。Smith等3研究39例初發(fā)AML患者體外誘導(dǎo)凋亡與臨床療效的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)化療獲CR者，白血病細(xì)胞體外無(wú)血清培養(yǎng)24h后自發(fā)凋亡率平均為19.5（3.664.0%）;相反，未能CR者凋亡細(xì)胞平均僅為4.2%（1.87.0%）。提示體外化療藥物誘導(dǎo)凋亡的敏感性對(duì)于預(yù)測(cè)化療預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。我們對(duì)18例AML患者體外化療藥物誘導(dǎo)凋亡的研究顯示，11例患者的骨髓白血病細(xì)胞對(duì)DNR+Ara-C或HHT+Ara-C，TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例高達(dá)4065，臨床化療均獲得CR。相反，其余7例在同樣條件下對(duì)上述藥物誘導(dǎo)凋亡不敏感者，臨床采用DA或HA方案

12、化療均未能達(dá)到緩解，表明化療藥物誘導(dǎo)AML初治患者白血病細(xì)胞凋亡的作用體內(nèi)與體外基本一致。由此我們認(rèn)為，對(duì)于初發(fā)AML患者，體外化療藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡敏感性的檢測(cè)可作為一項(xiàng)化療療效預(yù)測(cè)的有用指標(biāo)。至于初發(fā)的ALL及難治與復(fù)發(fā)的急性白血病患者，體外化療藥物誘導(dǎo)凋亡敏感性的臨床意義如何，尚在研究之中。關(guān)于影響化療藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的因素較為復(fù)雜，不少作者認(rèn)為與凋亡拮抗基因bcl-2關(guān)系密切，但也有持不同看法者4，5。Palucka等6對(duì)10例AML患者的體外研究表明，白血病細(xì)胞對(duì)DNR誘導(dǎo)凋亡的敏感性與bcl-2表達(dá)無(wú)關(guān)，而只取決于細(xì)胞對(duì)藥物攝取的累積量大小。我們的觀察結(jié)果則顯示，AML初

13、治患者骨髓細(xì)胞bcl-2高表達(dá)者CR率低，反之，則預(yù)后較好。 許小平（200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院血液科）史劍慧（上海醫(yī)科大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所）程文英（上海醫(yī)科大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所）王健民（200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院血液科）丁訓(xùn)杰（上海醫(yī)科大學(xué)華山醫(yī)院血液學(xué)研究室）參 考 文 獻(xiàn)2，Csoka M, Bocsi J,Falus A, et al. Glucocorticoid-induced apoptosis and treatment sensitivity in acute lymphoblastic leukemia of children. Pediatr

14、 Hematol Oncol, 1997,14:433-442.3，Smith BD, Bambach BJ,Vala MS,et al. Inhibited apoptosis and drug resistance in acute myeloid leukemia.Br J Haematol, 1998,102:1042-1049.4，Campos L,Rouault JP, Sabido O, et al. High expression of bcl-2 protein in acute myeloid leukemia cells is associated with poor response to chemotherapy. Blood, 1993,81:3091-3097.5，Banker DE, Groudine M, Norwood T, et al. Measurement of spontaneous and therapeutic agent-induced apoptosis with BCL-2 protein expression in a