化療藥物體外誘導急性髓系白血病細胞凋亡的臨床意義

1、    化療藥物體外誘導急性髓系白血病細胞凋亡的臨床意義        我們采用TdT介導的脫氧核苷酸切口和缺口末端標記法（TUNEL）及超微結構觀察等方法，對18例初治急性髓系白血?。ˋML）患者骨髓白血病細胞進行體外化療藥物誘導凋亡與臨床療效關系的初步研究，以探討體外化療藥物誘導白血病細胞凋亡在臨床化療療效預測中的實際應用價值。 病例和方法1病例和標本18例初治AML患者來自第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院血液科和上海醫(yī)科大學華山醫(yī)院血液科。其中男8例，女10例；中位年齡46 歲（1

2、470歲）； M1 1例，M2 9例，M31例，M4 4例，M5 2例，M7 1例。所有患者均經(jīng)形態(tài)學、細胞化學（M7經(jīng)電鏡及單抗）檢測確診?；煵捎肏A（高三尖杉酯堿24mg/m2、阿糖胞苷100150mg/m2）、DA（柔紅霉素40mg/m2、阿糖胞苷100150mg/m2）方案。完全緩解（CR）與未緩解（NR）判別按國內現(xiàn)行標準?；熐俺槿⌒迈r骨髓, 抗凝,用分離液分離單個核細胞備用。2化療藥物體外誘導白血病細胞凋亡單個核細胞濃度為1×106/ml, 分別孵育于高三尖杉酯堿(HHT)2mg/L,柔紅霉素(DNR)1.0mol/L，阿糖胞苷(Ara-C) 1.0mol/L，HHT

3、(2mg/L)+Ara-C (1.0mol/L)，DNR (1.0mol/L)+Ara-C (1.0mol/L)，作用18h。以上藥物終濃度的選擇參考萬景華等1的方法及我們的實驗結果。3白血病細胞bcl-2表達檢測所用單抗bcl-2（124）購自上海華美公司（丹麥DAKO公司產品）。HRP-DAB藥盒購自美國Labvision公司。細胞涂片（細胞濃度為2×106/ml）后丙酮固定，過氧化氫作用后微波抗原修復。加bcl-2單抗，37濕盒作用30min，加生物素化二抗,室溫作用10min，加辣根酶標記鏈霉親和素工作液（Streptavidin/HRP）室溫作用10min，最后以3,3-二

4、氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。計數(shù)1000個細胞中的陽性細胞，并計算其陽性率。參照10例良性血液病患者的結果，bcl-2表達>15為陽性。4凋亡檢測4.1 Wright-Giemsa染色: 細胞離心涂片染色,光鏡下計數(shù)具有明顯凋亡特征的細胞(細胞縮小, 核染色質凝聚,核碎裂等)。4.2TUNEL法檢測片段化DNA: 主要步驟為用體積分數(shù)為1%的甲醛固定細胞,以Triton X-100穿透細胞,洗滌后滴片, 晾干。用dUTP-熒光素標記試劑盒(購自德國保靈曼公司上海分公司)進行溫育反應(每份標本均設立陰性對照, 即不加關鍵的TdT酶)。然后加抗熒光素-AP, 再加底物5-溴-4-氯-3-吲哚基

5、-磷酸(BCIP)和氯化硝基四氮唑藍（NBT)，將基于熒光素的TUNEL檢測轉化為顯色法。陽性細胞被染成藍黑色。計數(shù)1000個細胞中陽性細胞數(shù)，并以骨髓分離后白血病細胞比例作校正。4.3透射電鏡標本制備: 細胞用PBS洗滌后,用戊二醛和鋨酸固定后進行漂洗、脫水、包埋、超薄切片，染色并晾干后以透射電鏡觀察細胞內超微結構。5統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)分析采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗及t檢驗。結果1化療藥物體外誘導白血病細胞凋亡結果見表1。組別例數(shù)HHTDNRAra-CHHT+Ara-CDNR+Ara-CCR組11Wright-Giemsa染色28.1±2.5*35.8±6.4*33.9&

6、#177;4.2*36.1±5.5*42.1±7.9*TUNEL法39.3±9.7*45.0±9.4*40.7±5.7*40.7±9.3*53.3±7.5*NR組7Wright-Giemsa染色21.0±2.317.9±5.022.7±4.721.1±2.322.6±3.0TUNEL法24.6±2.723.3±4.226.4±7.426.7±4.027.3±3.9     注:與NR組比

7、較，*P<0.05 表1結果表明, CR患者化療前白血病細胞體外對化療藥物的敏感性均高于NR患者（P值均<0.05）。在所有的實驗組中，TUNEL標記法的敏感性普遍高于Wright-Giemsa染色法。2白血病細胞bcl-2表達與體外化療藥物誘導凋亡及臨床療效的關系結果見表2。表2白血病細胞bcl-2表達與體外化療藥物誘導凋亡及臨床療效的關系例號性別年齡(歲)診斷bcl-2表達凋亡*(%)化療方案療效1男22M4-40DACR2男70M2+47HACR3男44M2-53HACR4女46M4-54DACR5男48M7-55DACR6男38M3-61HACR7男39M5+58HACR8

8、男54M2-65DACR9女40M1+51HACR10女54M2-61DACR11女47M4+54DACR12男41M5+29HANR13女55M2+25HANR14女63M2+25DANR15女14M2+21DANR16女58M2-30HANR17女16M4+31DANR18女44M2+30DANR     注:*根據(jù)化療方案取DNRAra-C或HHTAra-C誘導細胞凋亡值(TUNEL法檢測結果) 表2顯示11例獲CR者化療藥物誘導凋亡細胞的百分率為4065，7例bcl-2表達陰性；7例NR者，化療藥物誘導凋亡細胞的百分率為2131，6例bcl-2表

9、達陽性。3化療藥物濃度和作用時間與誘導白血病細胞凋亡的關系結果見表3。表3不同濃度化療藥物作用不同時間白血病細胞凋亡率的比較組別不同時間凋亡細胞(%)6h12h18h對照組1.53.55.0HHT組2ml/L8.518.030.520ml/L24.035.636.5200ml/L26.538.542.4DNR組0.1mol/L12.223.532.81.0mol/L17.530.044.510.0mol/L25.035.552.2Ara-C組0.1mol/L6.011.518.51.0mol/L2.426.443.610.0mol/L17.841.068.5   

10、  表3示例9患者白血病細胞不同濃度化療藥物作用不同時間的細胞凋亡率。從表中可以看出，該患者白血病細胞對三種化療藥物誘導凋亡均呈現(xiàn)濃度和時間依賴關系。4形態(tài)學變化經(jīng)化療藥物作用的白血病細胞在光鏡下出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征，即細胞體積縮小、核固縮、染色質凝集，并有凋亡小體形成。電鏡下觀察，胞質空泡化，各種細胞器均出現(xiàn)不同程度的萎縮，胞膜尚完整，核固縮、碎裂，凋亡小體易見。 討論臨床上對初治患者合理地選用誘導凋亡敏感的藥物是患者獲得長期持續(xù)緩解的重要因素。國外學者近年來在這方面已作了一些探索。Csoka等2采用化療初6h外周血幼稚淋巴細胞凋亡指數(shù)評估急性淋巴細胞白血病（ALL）對糖皮質激素

11、的敏感性，結果顯示凋亡率與臨床療效有很好的相關性。Smith等3研究39例初發(fā)AML患者體外誘導凋亡與臨床療效的關系，發(fā)現(xiàn)化療獲CR者，白血病細胞體外無血清培養(yǎng)24h后自發(fā)凋亡率平均為19.5（3.664.0%）;相反，未能CR者凋亡細胞平均僅為4.2%（1.87.0%）。提示體外化療藥物誘導凋亡的敏感性對于預測化療預后有一定的指導意義。我們對18例AML患者體外化療藥物誘導凋亡的研究顯示，11例患者的骨髓白血病細胞對DNR+Ara-C或HHT+Ara-C，TUNEL法檢測凋亡細胞比例高達4065，臨床化療均獲得CR。相反，其余7例在同樣條件下對上述藥物誘導凋亡不敏感者，臨床采用DA或HA方案

12、化療均未能達到緩解，表明化療藥物誘導AML初治患者白血病細胞凋亡的作用體內與體外基本一致。由此我們認為，對于初發(fā)AML患者，體外化療藥物誘導白血病細胞凋亡敏感性的檢測可作為一項化療療效預測的有用指標。至于初發(fā)的ALL及難治與復發(fā)的急性白血病患者，體外化療藥物誘導凋亡敏感性的臨床意義如何，尚在研究之中。關于影響化療藥物誘導白血病細胞凋亡的因素較為復雜，不少作者認為與凋亡拮抗基因bcl-2關系密切，但也有持不同看法者4，5。Palucka等6對10例AML患者的體外研究表明，白血病細胞對DNR誘導凋亡的敏感性與bcl-2表達無關，而只取決于細胞對藥物攝取的累積量大小。我們的觀察結果則顯示，AML初

13、治患者骨髓細胞bcl-2高表達者CR率低，反之，則預后較好。 許小平（200433上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院血液科）史劍慧（上海醫(yī)科大學放射醫(yī)學研究所）程文英（上海醫(yī)科大學放射醫(yī)學研究所）王健民（200433上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院血液科）丁訓杰（上海醫(yī)科大學華山醫(yī)院血液學研究室）參 考 文 獻2，Csoka M, Bocsi J,Falus A, et al. Glucocorticoid-induced apoptosis and treatment sensitivity in acute lymphoblastic leukemia of children. Pediatr

14、 Hematol Oncol, 1997,14:433-442.3，Smith BD, Bambach BJ,Vala MS,et al. Inhibited apoptosis and drug resistance in acute myeloid leukemia.Br J Haematol, 1998,102:1042-1049.4，Campos L,Rouault JP, Sabido O, et al. High expression of bcl-2 protein in acute myeloid leukemia cells is associated with poor response to chemotherapy. Blood, 1993,81:3091-3097.5，Banker DE, Groudine M, Norwood T, et al. Measurement of spontaneous and therapeutic agent-induced apoptosis with BCL-2 protein expression in a