微生物遺傳與育種

1、微生物遺傳與育種實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)實(shí)驗(yàn)一、-半乳糖苷酶基因（lacZ）轉(zhuǎn)化入E.coli DH51實(shí)驗(yàn)任務(wù)和目的1) 掌握轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。2) 掌握重組菌株篩選的一般原理。2 實(shí)驗(yàn)原理在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化(transformation)特指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)件的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。轉(zhuǎn)化這一概念來(lái)源于遺傳學(xué)：細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)特性由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變叫轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化是一個(gè)自然存在的過(guò)程。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA狀態(tài)叫感受態(tài)，用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作叫致敏過(guò)程。重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過(guò)化學(xué)方法，人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)敏感的感受態(tài)，以便外源DNA進(jìn)入細(xì)菌

2、內(nèi)。這項(xiàng)技術(shù)始于Mandel和Higa1970年的觀察，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌經(jīng)過(guò)冰冷的CaCl2溶液處理及短暫熱休克后，容易被噬菌體DNA感染，隨后Cohn于1972年進(jìn)一步證明質(zhì)粒DNA用同樣的方法也能進(jìn)入細(xì)菌。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗Dnase的羥基- 鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，一般每微克DNA能獲得105106個(gè)轉(zhuǎn)化子，環(huán)化重組

3、子分子愈小，轉(zhuǎn)化率愈高，環(huán)狀DNA分子比線性DNA分子的轉(zhuǎn)化率高1000倍。在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它二價(jià)金屬離子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，使可轉(zhuǎn)化率提高1001000倍?；蚩寺〉淖詈笠坏拦ば蚓褪菑霓D(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落中篩選含有陽(yáng)性重組子的菌落并鑒定重組子的正確性。當(dāng)帶有Lac基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5后，質(zhì)粒表達(dá)-肽，它與宿主菌中F因子上的lacZM15基因的產(chǎn)物互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，在含有指示劑X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；因此可以篩選出重組菌。 3 試驗(yàn)材料基因材料：環(huán)形質(zhì)粒pT7blue (Novagentech 公司提供，-20

4、保存)宿主：感受態(tài)大腸桿菌DH5（-80保存）。試劑：SOC培養(yǎng)基（-80保存）、LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素（25mg/mL）（-20保存）、Xgal（ 200mg/mL，-20保存）。4 實(shí)驗(yàn)方法4.1 培養(yǎng)基制備LB平板培養(yǎng)基：10.0g胰蛋白胨（Tryptor peptone）、5.0g酵母提取物（Yeast extracting power）、5.0g NaCl、15瓊脂糖（Agar power）80溶解后定容1000mL，121滅菌20min，冷卻到60左右加入2.5ml氨芐青霉素（25mg/mL），按20ml/個(gè)倒平板備用。4.2 轉(zhuǎn)化取10ul環(huán)形質(zhì)粒pT7blue加入到冰上已解凍的

5、裝有感受態(tài)大腸桿菌DH5 Eppendoff 管中，輕輕混勻，冰上放置30min，42熱休克2min，冰上放置至少1min，加入冰上解凍的SOC培養(yǎng)基900ul，30培養(yǎng)至少1h。4.3 篩選向含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)皿中加入50ul Xgal涂抹平板，浸潤(rùn)30min，加入100ul重組大腸桿菌液涂LB平板。Eppendoff管中剩余的900ul重組大腸桿菌DH5在4 15,000g離心 1min，倒掉上清液約800ul，微型震蕩儀上懸震菌體沉淀，吸取菌懸液涂另一LB平板。涂好后的平板在37培養(yǎng)15h左右，挑選藍(lán)色菌落。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)二、-半乳糖苷酶基因（lacZ）插入突變1實(shí)驗(yàn)任務(wù)和目的

6、1) 掌握質(zhì)粒的提取和限制性內(nèi)切酶、連接酶的使用。2) 掌握插入突變的的基本原理及突變子的篩選。2 實(shí)驗(yàn)原理pT7Blue是專用商品名稱(圖2-12)，系Novagentech公司發(fā)展的一類由pUC19載體派生而來(lái)的質(zhì)粒載體，含有pUC19的高拷貝復(fù)制起點(diǎn)和lac序列、一個(gè) T7 啟動(dòng)子 , f1復(fù)制起點(diǎn)以及多克隆位點(diǎn)區(qū)段(Hind III - EcoR I)，同時(shí)還引入了氨芐青霉素抗性基因（Ap）和大腸桿菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼的-肽的DNA順序。其中編碼Lac基因的-肽的順序中含有多克隆位點(diǎn)(Hind III - EcoR I)，當(dāng)無(wú)外源DNA片段插入時(shí)，質(zhì)粒表達(dá)-肽

7、，它與宿主菌中F因子上的lacZM15基因的產(chǎn)物互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，在含有指示劑X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；外源基因的插入后，當(dāng)Lac-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無(wú)-半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色。3 試驗(yàn)材料基因材料：含HindIII酶切位點(diǎn)的一段1.5kb的外源DNA；環(huán)形質(zhì)粒pT7blue （試驗(yàn)一重菌中提?。┧拗鳎焊惺軕B(tài)大腸桿菌DH5（-80保存）。試劑：SOC培養(yǎng)基（-80保存）、LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素（25mg/mL）（-20保存）、Xgal（ 200mg/mL，-20保存）。Wizard Plus SV Cell Resuspension S

8、olution、Wizard Plus SV Cell Lysis Solution、Wizard Plus SV Column Wash Solution、Wizard Plus SV Alkaline Protease Solution、Wizard Plus SV Neutralization Solution、Wizard Plus SV Nuclease-Free Water、內(nèi)切酶Hind、10M緩沖液、10loading緩沖液、倍稀釋的Hind標(biāo)準(zhǔn)DNA分子4 實(shí)驗(yàn)方法4.1 培養(yǎng)基制備LB平板培養(yǎng)基：10.0g胰蛋白胨（Tryptor peptone）、5.0g酵母提取物（Ye

9、ast extracting power）、5.0g NaCl、15瓊脂糖（Agar power）80溶解后定容1000mL，121滅菌20min，冷卻到60左右加入2.5ml氨芐青霉素（25mg/mL），按20ml/個(gè)倒平板備用。LB大腸桿菌培養(yǎng)基：10.0g胰蛋白胨（Tryptor peptone）、5.0g酵母提取物（Yeast extracting power）、5.0g NaCl ，80溶解后定容1000mL，試管分裝2ml/管，121滅菌20min，冷卻后加入5.0ul/管氨芐青霉素（25mg/mL）備用。4.2 重組大腸桿菌培養(yǎng)將LB液體培養(yǎng)基分裝入試管中，每管2ml，121，滅

10、菌20min，冷卻后每管加入5ul氨芐青霉素（25mg/ml）。用無(wú)菌牙簽挑取試驗(yàn)一的籃色的單菌落接種于試管中，37 150rpm震蕩培養(yǎng)15h左右，直至細(xì)菌懸濁液濃度達(dá)到OD600為0.450.55(細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，一般認(rèn)為從試管另一面看不到牙簽即可。4.3質(zhì)粒pT7Blue提取(1) 大腸桿菌細(xì)胞的裂解：將.4步培養(yǎng)的大腸桿菌轉(zhuǎn)移入無(wú)菌的1.5ml的Eppendorf中, 10,000g 離心5min，棄上清，每管加入250ul Cell Resuspension Solution 充分振蕩懸浮菌體沉淀。再向每管加入250ul Cell Lysis Solution ,倒轉(zhuǎn)4次輕微混勻

11、，加入10ul Alkaline Protease Solution 倒轉(zhuǎn)4次混勻，室溫（約24）保溫5min。再加入350ul Neutralization Solution 立即倒轉(zhuǎn)4次混勻，室溫，14,000g 離心10min。 (2) 質(zhì)粒的收集：將無(wú)菌的Spin Column收集柱插入無(wú)菌的2.0ml收集管中，將上步離心后的裂解上層液緩慢的注入Spin Solution柱子中，室溫，15,000g 離心1min。棄濾液，將Spin Solution柱子重新插入收集管中。(3) 清洗質(zhì)粒：向Spin Solution柱子中加入750ul調(diào)配好的Wash Solution洗液，室溫，15

12、,000g 離心1min，棄濾液。再將Spin Column收集柱插入收集管中，再向Spin Solution柱子中加入250ul調(diào)配好的Wash Solution洗液，室溫，15,000g 離心2min，棄收集管。(4) 質(zhì)粒的洗脫：將Spin Solution柱子重新插入新的1.5ml的Eppendorf管中，向Spin Solution柱子中加入100ul的Nuclease-Free Water, 室溫，15,000g 離心1min，棄Spin Solution柱子。蓋好Eppendorf管蓋，-20或更低的溫度保存?zhèn)溆?。DNA在4的1TE緩沖液中也很穩(wěn)定，如果要在4保存質(zhì)粒DNA，則須

13、向含100ul質(zhì)粒DNA的Eppendorf管的加入11ul的10TE緩沖液。(5) 限制性內(nèi)切酶處理質(zhì)粒DNA：在1.5ml的Eppendorf管中加入滅菌水15ul/管、10M緩沖液2ul/管和酶Hind 1ul/管或酶EcoR1ul/管，然后再加入質(zhì)粒DNA 2ul/管，用手指輕輕彈勻，小型離心機(jī)上離心使管壁上的液體落入管底，37酶切1h，電泳。4.4 外源DNA的酶切限制性內(nèi)切酶處理外源DNA：在1.5ml的Eppendorf管中加入滅菌水10ul/管、10M緩沖液2ul/管和酶Hind 1ul/管或酶EcoR1ul/管，然后再加入質(zhì)粒DNA 8ul/管，用手指輕輕彈勻，小型離心機(jī)上離

14、心使管壁上的液體落入管底，37酶切1h，電泳，膠回收。4.5 插入突變和轉(zhuǎn)化 從DNA ligation Kit Ver.2 solution試劑盒取10ul連接緩沖液加入到100ul的Eppendoff 管中。然后加入酶切后的膠回收的外源DNA片段9ul，再加入酶切后的pT7blue載體 1ul ，輕輕混勻后（注：以上順序不能顛倒）在PCR儀中16連接30min。連接結(jié)束后取10ul重組質(zhì)粒DNA加入到冰上已解凍的裝有感受態(tài)大腸桿菌DH5 Eppendoff 管中，輕輕混勻，冰上放置30min，42熱休克2min，冰上放置至少1min，加入冰上解凍的SOC培養(yǎng)基900ul，30培養(yǎng)至少1h。4.6 篩選向含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)皿中加入50ul Xgal涂抹平板，浸潤(rùn)30min，加入100ul重組大腸桿菌液涂LB平板。Eppendoff管中剩余的900ul重組大腸桿菌DH5在4 15,000g離心 1min，倒掉上清液約800ul，微型震蕩儀上懸震菌體沉淀，吸取菌懸液涂另一LB平板。涂好后的平板在37培養(yǎng)15h左右，挑選白色菌落即為-半乳糖苷酶基因（lacZ）突變株。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果外源DNADNA Ligation Kit Ver.2 solutionI