新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 - 圖文-

1、·基礎(chǔ)研究·新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定胡?？?耿召華,祝善俊,劉玉峰(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心血管內(nèi)科,重慶400037摘要目的:探討新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法,培養(yǎng)存活率高和純度高的心肌細(xì)胞。方法:無(wú)菌條件下取出出生1 2d 的SD 大鼠心臟,用2.5g /L 胰蛋白酶和2.0g /L 型膠原酶等量混合液在37條件下分次消化心肌組織。以差速貼壁并將時(shí)間延長(zhǎng)至90min 純化心肌細(xì)胞,文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1009-7236(201406-654-03網(wǎng)絡(luò)出版地址:http :/wwwcnkinet /kcms /detail /61126820130925183

2、3006html 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2013-9-2518:33基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(81070093;重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目資助(CSTC ,2011AC5031通訊作者:耿召華,副教授,主要從事ad 蛋白相關(guān)研究Email :gengzhhtomcom作者簡(jiǎn)介:胡保奎,碩士生Email :641117506qqcomCulture and identification of cardiomyocytes in neonatal ratsHU Bao-kui ,GENG Zhao-hua ,ZHU Shan-jun ,LIU Yu-feng(Department of Cardio

3、logy ,Xinqiao Hospital ,Third Military Medical University ,Chongqing 400037,China AbstractAIM :To develop a method of primary culture of neonatal rat cardiomyocytes with high survival肌細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng),使之穩(wěn)定生長(zhǎng),但原代心肌細(xì)胞一般易受外界條件因素的影響存活率往往較低。心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于心血管領(lǐng)域分子水平的研究,有助于從細(xì)胞和分子水平研究心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法1,2。本研究的目的在于建立

4、一種簡(jiǎn)單穩(wěn)定、可靠的心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法,以為心血管系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)和臨床研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法11材料新生SD 大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。小牛血清和DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone 公司,胰蛋白酶、型膠原酶、青霉素、磷酸鹽緩沖液及5溴-25-溴脫氧核苷尿嘧啶(Brdu ,Sigma 公司,臺(tái)盼藍(lán)(Gibco 公司。IX70型倒置顯微鏡(Olympas 株式會(huì)社。·456·心臟雜志(Chin Heart J 2013,12方法121心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)1 2d的SD大鼠,每次取10 20只,無(wú)菌操作取出心臟并剪成1mm3組織塊,以磷酸鹽緩沖液洗1次,棄帶血的上清液。用2

5、.5g/L胰蛋白酶和2.0g/L型膠原酶等量混合液在37條件下分次消化(每次10min,共7次,首次消化液棄去。收集細(xì)胞懸液,以1000g 離心10min,吸出上清液,加入含100ml/L小牛血清、100g/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)液,吹打均勻后,經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾,于37、50ml/L CO2孵箱中差速貼壁90min。取上清液,細(xì)胞計(jì)數(shù)以1105個(gè)/ml的密度接種于6孔板中,加入0.1mmol/LBrdu抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),置37、50ml/L CO2孵箱中培養(yǎng),48h后換液首次換液,以后隔天換液,培養(yǎng)7d。122心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察取培養(yǎng)不同時(shí)間的心肌細(xì)胞,在倒置顯微鏡下用光鏡觀察心肌細(xì)胞

6、隨著培養(yǎng)時(shí)間的不同其形態(tài)特征的變化。123心肌細(xì)胞的純度鑒定在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)算差速貼壁純化后的心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞的純度以心肌細(xì)胞的陽(yáng)性率(%表示,即心肌細(xì)胞數(shù)/(心肌細(xì)胞數(shù)+成纖維細(xì)胞數(shù)100%。124心肌細(xì)胞的存活率測(cè)定取培養(yǎng)第3天的心肌細(xì)胞懸液和4g/L臺(tái)盼藍(lán)溶液各100l并混勻。取少量細(xì)胞懸液滴在血球計(jì)數(shù)板,覆上蓋玻片,其中呈藍(lán)色的細(xì)胞為死亡細(xì)胞,未染色的細(xì)胞為活細(xì)胞。細(xì)胞存活率(%=(總心肌細(xì)胞數(shù)藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/總心肌細(xì)胞數(shù)100%。125心肌細(xì)胞的活力分析心肌細(xì)胞培養(yǎng)的第3天,在倒置顯微鏡下,6孔板中每孔任意選取5個(gè)視野,每個(gè)視野任選10個(gè)細(xì)胞,于低倍鏡下計(jì)數(shù)搏動(dòng)的細(xì)胞每分鐘搏動(dòng)次

7、數(shù),計(jì)算心肌細(xì)胞平均搏動(dòng)頻率。2結(jié)果21心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察心肌細(xì)胞消化后呈圓形,培養(yǎng)24h后基本貼壁生長(zhǎng),可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞開(kāi)始搏動(dòng),節(jié)律不規(guī)則,搏動(dòng)微弱,細(xì)胞呈梭形或多角形,核多為1個(gè)或兩個(gè),核仁清楚。培養(yǎng)48h后心肌細(xì)胞搏動(dòng)增強(qiáng),立體感明顯,折光性強(qiáng)。培養(yǎng)3d 后,細(xì)胞伸出偽足交織成網(wǎng),形成放射狀排列的細(xì)胞簇(圖1,呈同步性收縮,搏動(dòng)細(xì)胞百分率約為80% 90%。圖1培養(yǎng)3d的心肌細(xì)胞(200表1心肌細(xì)胞純度的測(cè)定視野1000個(gè)細(xì)胞中心肌細(xì)胞(個(gè)陽(yáng)性率(% 19359352948948391291249069065895895 23心肌細(xì)胞的存活率測(cè)定任選5孔,每孔任選1個(gè)視野,于低倍鏡下計(jì)數(shù)

8、1000個(gè)細(xì)胞,計(jì)算心肌細(xì)胞的存活率(%,即平均存活率(%為(93.928%(表2。表2心肌細(xì)胞存活率培養(yǎng)孔1000個(gè)細(xì)胞中未染色的細(xì)胞(個(gè)存活率(% 19489482957957391591549049045970970 24心肌細(xì)胞的活力分析心肌細(xì)胞培養(yǎng)第3天,在倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的平均搏動(dòng)率為80 130次/min,搏動(dòng)同步,收縮有力。 3討論心臟主要由心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成,心肌細(xì)胞占心臟細(xì)胞總數(shù)的33%左右。成功地分離心肌細(xì)胞是體外培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟,本實(shí)驗(yàn)采用2.5g/L 胰蛋白酶和2.0g/L型膠原酶等量混合液,消化時(shí)間明顯縮短,胰蛋白酶可使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解,切斷細(xì)胞間的連

9、接,使細(xì)胞脫落,但其也能消化細(xì)胞膜上的蛋白成分,心肌細(xì)胞比較脆弱,容易被損傷死亡。型膠原酶主要消化細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維,對(duì)心肌細(xì)胞損傷小,兩者混合使用,既能減少對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用,又能提供消化效率,縮短消化時(shí)間。在常規(guī)消化的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分次消化,每次消化后,棄上清,加入含100ml/L小牛血清、100g/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)液終止消化酶消化,避免酶液對(duì)細(xì)胞的持續(xù)損傷,對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。第一管消化液中組織成分較多,應(yīng)舍棄,可以明顯提供心肌細(xì)胞的純度?；旌厦赶葐我幻赶塬@得好的效果,發(fā)現(xiàn)膠原酶和DNA酶組合使用,能達(dá)到很好的消化效果3。在消化過(guò)程中,注意控制適宜的溫度,

10、在37酶的活性較高,能獲得很好的消化效果。每次消化時(shí)間應(yīng)控制在10min以內(nèi),以避免長(zhǎng)時(shí)間消化酶對(duì)細(xì)胞的損傷作用。避免產(chǎn)生氣泡,因?yàn)闅馀荼砻娴膹埩ψ饔每蔂坷瓝p傷細(xì)胞。用吸管反復(fù)吹打,使細(xì)胞脫落,可縮短消化時(shí)間。心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)板中的貼壁速度不同,成纖維細(xì)胞比心肌細(xì)胞更容易貼壁,采用差速貼壁可純化心肌細(xì)胞,適當(dāng)延長(zhǎng)貼壁時(shí)間可提高心肌細(xì)胞分離的純度。本實(shí)驗(yàn)將貼壁時(shí)間延長(zhǎng)至90 min,獲得高純度的心肌細(xì)胞,同有關(guān)報(bào)道相一致4,5。但此種方法只適合短期培養(yǎng),不適合細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。0.1mmol/L的Brdu可以抑制成纖維細(xì)胞,提高培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度,因其濃度過(guò)高會(huì)抑制心肌細(xì)胞生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)將

11、貼壁時(shí)間和加用Brdu 方法適當(dāng)結(jié)合,獲得了很好的結(jié)果。心肌細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果受多種因素的影響,一般乳鼠出生時(shí)間越短,細(xì)胞成活率越高,本實(shí)驗(yàn)選擇1 2d內(nèi)的乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)的成活率很高。培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌,盡量縮短操作時(shí)間,培養(yǎng)液的pH 值一般應(yīng)控制在7.0 7.2之間,首次換液為48h 后,以后隔天換液。共換液6次,培養(yǎng)7天,總之,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良后的培養(yǎng)方法,不僅操作簡(jiǎn)單,而且心肌細(xì)胞的純度和存活率高,較以往方法不同的是,采用兩種消化酶協(xié)同分次消化,消化完立即終止消化,避免一種消化酶長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞的損傷作用,培養(yǎng)周期長(zhǎng),可動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)變化,是一種較理想的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。參考文獻(xiàn):1S

12、hkryl VM,Maxwell JT,Domeier TL,et alefractoriness of sarco-plasmic reticulum Ca2+release determines Ca2+alternans in atrial myocytesJAm J Physiol Heart Circ Physiol,2012,302(11: 231023202Marshall GE,ussell JA,Tellez JO,et alemodelling of humanatrial K+currents but not ion channel expression by chronic-blockadeJPfluger Arch,2012,463(4:5375483李博,吳慧穎,樸虎林,等新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良J中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012,16(2:2002034劉嘉祺,孫云云乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法J微量元素與健康研究,2012,29(4:465Bes S