種子發(fā)育相關(guān)性狀影響含油量的遺傳學(xué)機(jī)制VIP

1、國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃973計(jì)劃課題任務(wù)書(shū)項(xiàng)目名稱：油菜籽油脂形成的分子生物學(xué)機(jī)制及其代謝調(diào)控課題名稱：種子發(fā)育相關(guān)性狀影響含油量的遺傳學(xué)機(jī)制課題編號(hào)：2006CB101604中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部制2006年09月01日一、研究?jī)?nèi)容油菜種子既是維持世代延續(xù)的繁殖器官，也是油菜的產(chǎn)品油脂和蛋白質(zhì)的儲(chǔ)藏器官。油菜種子中油脂、蛋白質(zhì)和粗纖維大約各占35-45，28-32和7-15，其比例有著明顯的消長(zhǎng)關(guān)系；油菜種子大?。Ｖ兀┦怯筒水a(chǎn)量的直接構(gòu)成因素；油菜種子發(fā)育和最終形成受到一系列復(fù)雜的遺傳和環(huán)境因素的影響，種子成熟過(guò)程中，特別是后期的溫度逆境對(duì)種子產(chǎn)量和質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)。本課題將從

2、上述三個(gè)方面對(duì)影響油菜種子含油量和產(chǎn)量的種子發(fā)育相關(guān)性狀開(kāi)展研究，試圖深入了解控制這些性狀的遺傳及分子機(jī)理，為有效調(diào)控油菜種子發(fā)育以提高種子含油量和產(chǎn)量提供理論依據(jù)。本研究的特色主要體現(xiàn)在：1. 選用多種來(lái)源的材料，將遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜的性狀， 如甘藍(lán)型黃籽形成的遺傳和生化控制，分解成單個(gè)組成因素進(jìn)行深入剖析；2.既研究性狀的單基因和多基因控制，也研究基因網(wǎng)絡(luò)上重要基因的互作。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要有：1. 將為解決一些長(zhǎng)期困擾育種家的難題提供答案，如甘藍(lán)型油菜中黃籽性狀、種子大小的基因控制，油菜中有關(guān)種皮色素合成的分子機(jī)制等；2.將克隆一批對(duì)種子含油量和產(chǎn)量相關(guān)性狀有重要影響的基因，并分析這些基因間的

3、相互作用；3.將對(duì)種子發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)特征、不同基因?qū)Νh(huán)境因素的應(yīng)達(dá)反應(yīng)，以及這些反應(yīng)對(duì)調(diào)控種子發(fā)育性狀的意義有新的認(rèn)識(shí)，進(jìn)而提出通過(guò)調(diào)控種子發(fā)育相關(guān)性狀提高含油量和籽粒產(chǎn)量的分子操作途徑。1種皮厚薄及黃籽性狀的分子遺傳學(xué)機(jī)制精細(xì)定位與粒色和種皮性狀有關(guān)的主效基因和QTL；克隆種皮發(fā)育，木質(zhì)素和種皮纖維素生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因，明確其影響種皮纖維素積累的分子機(jī)理；分析黃色種皮形成的遺傳機(jī)理，克隆與種皮色素生物合成與沉積有關(guān)的重要調(diào)控基因，研究它們與重要結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵順式元件的作用機(jī)理。2控制油菜種子大小的基因網(wǎng)絡(luò)及重要基因的功能分析利用油菜籽大小突變體和近等基因系研究籽粒大小

4、對(duì)油分積累和籽粒產(chǎn)量的影響；定位與種子大小相關(guān)的主效基因和QTL；利用定位結(jié)果和擬南芥的分子生物信息學(xué),分離克隆與油菜籽粒大小有關(guān)的重要基因3-5個(gè),利用酵母雙雜交系統(tǒng)建立與種籽大小有關(guān)的蛋白質(zhì)及相應(yīng)基因的互作網(wǎng)絡(luò);通過(guò)基因失活或超量表達(dá)等技術(shù)，分析基因網(wǎng)絡(luò)上關(guān)鍵基因的功能。3影響油菜結(jié)實(shí)重要基因的鑒定和功能分析利用作圖群體分析不同生態(tài)條件下油菜結(jié)實(shí)性狀表現(xiàn),定位影響種子后期成熟的相關(guān)基因；利用擬南芥和油菜花器官形成及種子發(fā)育突變體分離相關(guān)基因，用擬南芥cDNA 和油菜種子特異EST芯片, 建立不同發(fā)育階段油菜種子的基因表達(dá)譜，分析在長(zhǎng)江中下游地區(qū)熱害條件下油菜種子中相關(guān)基因的差異表達(dá),克隆3

5、-5個(gè)結(jié)實(shí)相關(guān)基因并分析其功能。1. 二、預(yù)期目標(biāo)深入了解控制種皮厚薄，籽粒顏色以及油菜種子大小控制的分子遺傳學(xué)機(jī)理。2. 克隆10個(gè)以上與種皮厚薄，種皮顏色，種子大小，種子結(jié)實(shí)效率等種子發(fā)育有關(guān)的基因，并對(duì)其中3-5個(gè)基因的功能進(jìn)行詳細(xì)分析。3. 發(fā)表SCI論文57篇，申請(qǐng)專利1-2項(xiàng)。提出通過(guò)調(diào)控種子發(fā)育相關(guān)性狀提高含油量及籽粒產(chǎn)量的分子操作途徑。三、研究方案及技術(shù)路線1、種皮厚薄及黃籽性狀的分子遺傳學(xué)機(jī)制1） 以華中農(nóng)大構(gòu)建的DH系作圖群體（HZ）和西南大學(xué)構(gòu)建的重組自交系群體（SW）為材料， 采集多年多點(diǎn)性狀數(shù)據(jù)，利用SSR、AFLP、SRAP等標(biāo)記精細(xì)定位與粒色和種皮性狀有關(guān)的主效基

6、因和QTL，建立600個(gè)以上標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，提出2篇有關(guān)油菜粒色和種皮性狀主效基因和QTL分析的SCI論文（2007、2009）。2） 以油菜黃、黑籽近等基因系為材料，利用擬南芥的分子生物學(xué)信息，克隆種皮發(fā)育，木質(zhì)素和種皮纖維素生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因，明確其影響種皮纖維素積累的分子機(jī)理。提出2篇有關(guān)種皮發(fā)育，木質(zhì)素和種皮纖維素生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因的SCI論文（2007、2008），申請(qǐng)專利1項(xiàng)。3） 針對(duì)甘藍(lán)型油菜中與種皮發(fā)育和色素合成相關(guān)基因的序列特征，利用RNAi技術(shù)研究植物種皮色素合成基因的表達(dá)，分析黃色種皮形成的遺傳機(jī)理，克隆種子發(fā)育過(guò)程尤其是種皮發(fā)育過(guò)程中調(diào)

7、控種皮色素生物合成與沉積的重要調(diào)控基因，研究它們與重要結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵順式元件的作用機(jī)理，提出12篇有關(guān)基因功能與作用機(jī)理的SCI論文（2008、2009），申請(qǐng)專利1項(xiàng)。2控制油菜種子大小的基因網(wǎng)絡(luò)及重要基因的功能分析4） 利用油菜種子大小突變體分析油菜種子大?。Ｖ兀┑倪z傳控制，分析粒重與含油量、籽粒產(chǎn)量的關(guān)系及其與環(huán)境的互作。5） 用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)TN（DH系群體）和LW（F2群體）群體定位與種子大小相關(guān)的主效基因和QTL，分析千粒重與含油量和蛋白含量的關(guān)系。構(gòu)建千粒重主效QTL的近等基因系，創(chuàng)建單個(gè)粒重基因的精細(xì)定位群體及目標(biāo)基因區(qū)段的物理圖譜，利用BAC文庫(kù)、cDNA文庫(kù)分離和克隆

8、LW群體的大粒等位基因。提出1篇油菜種子大小QTL分析的SCI論文（2008）6） 利用擬南芥種子大小研究的分子生物信息學(xué)，用候選基因法克隆油菜的同源片段，將這些候選基因整合到已有的遺傳連鎖圖，確定它們與已定位的種子大小相關(guān)的分子標(biāo)記的關(guān)系；通過(guò)基因失活或超量表達(dá)分析，明確克隆的油菜候選基因?qū)ΨN子大小形成的影響，結(jié)合上述種子大小相關(guān)的主效基因和QTL定位結(jié)果，選擇3-4個(gè)效應(yīng)明顯的基因作為酵母雙雜交（Y2H）分析的誘餌基因；構(gòu)建供Y2H篩選的cDNA文庫(kù)，通過(guò)酵母雙雜交分析鑒定與誘餌基因蛋白互作的其他蛋白，建立與種籽大小有關(guān)的蛋白質(zhì)及相應(yīng)基因的互作網(wǎng)絡(luò)。7） 根據(jù)種子大小基因網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果和LW

9、大粒等位基因的鑒定，重點(diǎn)對(duì)2-3個(gè)在油菜種子大小起重要作用的基因進(jìn)行功能分析。提出2篇控制油菜種子大小基因調(diào)控的SCI論文（2009）。3、影響油菜結(jié)實(shí)重要基因的鑒定和功能分析1) 利用多年多點(diǎn)種植的作圖群體分析不同生態(tài)條件下油菜結(jié)實(shí)性狀表現(xiàn)，定位影響種子后期成熟的有關(guān)的主效基因和QTL；提出1篇油菜結(jié)實(shí)性狀控制的SCI論文（2008）。2) 用擬南芥cDNA 和油菜種子特異EST芯片, 建立不同發(fā)育階段油菜種子的基因表達(dá)譜，綜合運(yùn)用擬南芥有關(guān)種子發(fā)育研究的生物信息學(xué)結(jié)果，鑒定與油菜種子發(fā)育相關(guān)的基因，用RNAi和過(guò)量表達(dá)分析，對(duì)其中3-5個(gè)重要基因的功能進(jìn)行深入分析。提出1篇與油菜種子發(fā)育基

10、因調(diào)控有關(guān)的SCI論文。3) 在控制條件下，模擬長(zhǎng)江流域油菜種子發(fā)育后期熱害環(huán)境，分析正常溫度和熱害條件下油菜種子發(fā)育和油分積累相關(guān)基因的差異表達(dá),克隆3-5個(gè)結(jié)實(shí)相關(guān)基因并分析其功能。提出12篇與結(jié)實(shí)相關(guān)基因功能與作用機(jī)理的SCI論文（2010）四、年度計(jì)劃年度研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1 利用西南大學(xué)的黃籽×黑籽兩個(gè)組合的重組自交系群體（SW1,SW2）兩年3點(diǎn)的數(shù)據(jù)， 對(duì)粒色、種皮色素、皮殼率、木質(zhì)素、含油量、籽粒大小等性狀有關(guān)的主效基因和QTL定位研究；2 利用華中農(nóng)大的DH系群體（HZ1）和F2群體（HZ2）進(jìn)行粒色定位，構(gòu)建兩個(gè)粒色主效QTL的近等基因系；3 克隆種皮發(fā)育，木

11、質(zhì)素和種皮纖維素生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因；4 田間種植種子大小定位F2群體（LW）和DH群體（TN），利用SSR、AFLP等分子標(biāo)記構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖，對(duì)千粒重及其他相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位；5 利用擬南芥生物信息學(xué)，克隆與種籽大小控制的相關(guān)基因；6 多點(diǎn)種植供種子結(jié)實(shí)性狀分析的群體。1.利用SW1、SW2建立含600個(gè)以上標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜；利用HZ1構(gòu)建 含400個(gè)以上的遺傳連鎖圖譜；2.定位與粒色形成有關(guān)的QTL；3克隆與粒色、種皮色素、皮殼率、木質(zhì)素、含油量、籽粒大小等種子發(fā)育相關(guān)的候選基因10個(gè)以上；4.在LW群體構(gòu)建至少包含250個(gè)DNA分子標(biāo)記的遺傳連鎖圖；5定位控制千粒重

12、、含油量和蛋白質(zhì)含量的QTL，分析這些QTL之間的相互關(guān)系。第二年1 繼續(xù)對(duì)粒色、種皮色素、皮殼率、木質(zhì)素、含油量、籽粒大小等性狀有關(guān)的主效基因和QTL的精細(xì)定位分析；2 繼續(xù)粒色主效QTL近等基因系的構(gòu)建工作； 3 通過(guò)正義和反義載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化，分析已克隆種皮發(fā)育，木質(zhì)素和種皮纖維素生物合成基因的功能和影響種皮纖維素積累的分子機(jī)理；4 利用全基因組分子標(biāo)記信息，從LW F2群體中選擇遺傳組成最相似、但在目標(biāo)基因區(qū)段分別帶有大粒和小粒等位基因的單株構(gòu)建粒重近等基因系；5 將已克隆的與控制種子大小有關(guān)的基因定位在分子標(biāo)記連鎖圖上，分析與所定位QTL之間的關(guān)系；6 用已克隆的與粒重相關(guān)的油菜基

13、因構(gòu)建抑制和超量表達(dá)載體，用以轉(zhuǎn)化擬南芥和油菜以分析其功能；7 構(gòu)建酵母雙雜交（Y2H）文庫(kù)；8 繼續(xù)種子結(jié)實(shí)性狀分析作圖群體的多年多點(diǎn)種植及分析；9 高含油量材料在控制條件下進(jìn)行高溫處理，獲得溫度對(duì)含油量和結(jié)實(shí)率影響的初步數(shù)據(jù)。1獲得對(duì)粒色、種皮色素等有關(guān)性狀遺傳控制的初步了解；2提出種皮發(fā)育，木質(zhì)素和種皮纖維素生物合成相關(guān)基因功能分析的SCI論文1篇；3. 申請(qǐng)專利1項(xiàng)；4. 獲得23個(gè)主效粒重的近等基因系單株；5. 獲得與千粒重QTL相吻合的擬南芥候選基因及油菜中的同源基因；6. 獲得一批轉(zhuǎn)種子發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因油菜單株；7. 結(jié)實(shí)有關(guān)性狀的QTL初步定位。第三年1、 通過(guò)3年的分析，

14、明確已克隆的種皮發(fā)育、木質(zhì)素和種皮纖維素生物合成基因的功能和影響種皮纖維素積累的分子機(jī)理；2、 利用RNAi技術(shù)研究植物種皮色素合成基因的表達(dá)，分析黃色種皮形成的遺傳機(jī)理；3、 利用來(lái)自HZ2的粒色近等基因系進(jìn)行黃籽的精細(xì)定位；4、 利用來(lái)自LW的主效粒重基因近等基因系配制雜交組合，以構(gòu)建粒重近等基因系作圖大群體；5、 分別對(duì)大粒和小粒親本的擬南芥候選基因進(jìn)行比較測(cè)序，尋找突變位點(diǎn)；對(duì)不同來(lái)源的大粒和小粒品種進(jìn)行比較測(cè)序；6、 克隆粒重候選片段的全長(zhǎng)基因，分析其在各組織器官中的表達(dá)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，并開(kāi)始遺傳轉(zhuǎn)化；7、 通過(guò)對(duì)與粒重相關(guān)的油菜候選基因的功能分析，確定3-4個(gè)用作Y2H互作篩選的誘

15、餌基因；8、 利用擬南芥cDNA 和油菜種子特異EST芯片，對(duì)油菜種子主要發(fā)育階段進(jìn)行基因表達(dá)譜分析；9、 利用多年多點(diǎn)種植的群體進(jìn)行結(jié)實(shí)性狀的QTL定位；10. 對(duì)不同溫度處理下油菜材料進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。1提出對(duì)種皮纖維素積累、皮色素合成等有關(guān)基因功能分析的SCI論文1篇；2申請(qǐng)專利1項(xiàng)；3. 提出1篇油菜種子大小QTL分析的SCI論文；4. 獲得粒重候選基因全序列，得到不同來(lái)源的大粒和小粒品種之間差異，確定導(dǎo)致粒重改變的突變；5. 獲得油菜種子主要發(fā)育階段基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)；6.鑒定出與結(jié)實(shí)有關(guān)性狀的QTL。第四年1. 用與來(lái)之HZ2粒色基因緊密連鎖的特異片段篩選BAC文庫(kù)，對(duì)侯選的陽(yáng)性克

16、隆進(jìn)行PCR分析、測(cè)序，構(gòu)建粒色基因區(qū)段的物理圖譜；2. 利用LW粒重近等基因系作圖大群體，用BSA法篩選與粒重基因緊密連鎖的分子標(biāo)記；構(gòu)建目標(biāo)基因區(qū)段的物理圖譜，開(kāi)展目標(biāo)基因區(qū)段的基因組測(cè)序；3.構(gòu)建大粒等位基因載體，并轉(zhuǎn)化驗(yàn)證功能；4. Y2H篩選，建立于種子大小有關(guān)的基因互作網(wǎng)路；5.定位影響油菜結(jié)實(shí)率的主效基因和QTL；6.通過(guò)基因表達(dá)差異分析，克隆影響油菜種子后期發(fā)育及結(jié)實(shí)率的相關(guān)基因；利用RNAi和超表達(dá)分析，闡明其功能。7. 用轉(zhuǎn)基因方法，將鑒定出與粒重、種子發(fā)育有關(guān)的重要基因聚合到同一品系，研究這些基因的協(xié)同作用對(duì)種子發(fā)育、含油量及種子產(chǎn)量的影響。1.完成粒色基因的精細(xì)定位，將

17、目的基因縮小至約100kb的DNA片段上；2. 提出有關(guān)粒色基因精細(xì)定位的SCI論文1篇3.完成粒重基因的精細(xì)定位，將目的基因縮小至100kb的DNA片段上。4. 完成粒重基因100kb的基因組測(cè)序，確定候選基因。5. 完成種子發(fā)育基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)分析，提出有關(guān)SCI論文1篇6. 克隆影響油菜種子后期發(fā)育及結(jié)實(shí)率的相關(guān)基因3-5個(gè)，提出有關(guān)結(jié)實(shí)率和籽粒大小基因功能及調(diào)控機(jī)理的SCI論文1篇。第五年1. 對(duì)HZ2群體粒色候選片段進(jìn)行克隆和功能分析；2. 完成LW群體粒重等位基因克隆和功能分析，包括對(duì)不同的大粒和小粒品種進(jìn)行比較測(cè)序，對(duì)大粒和小粒親本發(fā)育種子進(jìn)行切片觀察，確定大粒和小粒親本細(xì)胞數(shù)目

18、和細(xì)胞大小的區(qū)別，對(duì)上述切片進(jìn)行RNA原位雜交，確定粒重基因在發(fā)育種子中的表達(dá)部位；3.對(duì)Y2H鑒定出的控制粒重有關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行功能分析；4.對(duì)通過(guò)熱處理基因差異表達(dá)分析鑒定出的結(jié)實(shí)相關(guān)基因作進(jìn)一步的功能分析；5. 繼續(xù)對(duì)控制粒重、種子發(fā)育等重要基因的聚合品系進(jìn)行分析。1.明確油菜黃籽形成的分子機(jī)理；2.確定不同的大粒和小粒品種之間控制粒重的機(jī)制是否相同，闡明大粒形成的分子機(jī)理；3.建立控制種子大小及種子發(fā)育的基因網(wǎng)絡(luò)，闡明其中3-5個(gè)重要基因的功能；4. 提出SCI論文1-2篇；5. 提出通過(guò)調(diào)控種子發(fā)育相關(guān)性狀提高含油量及籽粒產(chǎn)量的分子操作途徑。 五、科學(xué)數(shù)據(jù)匯交計(jì)劃課題組內(nèi)各參加單位每月的30日將有關(guān)數(shù)據(jù)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)送交華中農(nóng)大。這些數(shù)據(jù)包括：含油量及與含油量相關(guān)農(nóng)藝性狀值數(shù)據(jù)、分子標(biāo)記、遺傳圖譜和QTL數(shù)據(jù)、cDNA和基因組序列相關(guān)數(shù)據(jù)、近等基因系數(shù)據(jù)等，Brassica中各個(gè)物種比較基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。華中農(nóng)大在每月的15日前將數(shù)據(jù)整理后提交到項(xiàng)目組建立的油菜基因組油脂數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（Genome of Brassica oil crop on fat acid: ）。該網(wǎng)站是項(xiàng)目組開(kāi)展協(xié)作、數(shù)據(jù)搜集、數(shù)據(jù)分類、生物信息學(xué)分析