第一節(jié)免疫標記技術的基本概念

1、 第一節(jié)第一節(jié) 免疫標記技術的基本概念免疫標記技術的基本概念一、免疫標記與標記免疫的概念二、常用的免疫標記物質 免疫標記與免疫標記與標記免疫標記免疫免疫標記技術免疫標記技術：標記物與免疫活性物質的聯(lián)接技術標記免疫技術標記免疫技術：以標記免疫物質檢測相應靶物質的技術常用的免疫標記物質常用的免疫標記物質類別 標記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白

2、免疫組化 免疫分析測定 第二節(jié)第二節(jié) 酶標記技術酶標記技術一、常用標記方法二、標記免疫物的分離與鑒定常用標記方法常用標記方法1、常用酶 辣根過氧化物酶（HRP） 堿性磷酸酶（AP）2、標記方法 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 (一步法）一步法）抗體-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗體酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶戊二醛交聯(lián)法（二步法）戊二醛交聯(lián)法（二步法）COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗體-NH2 +

3、 CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+ NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)標記免疫物的分離與鑒定標記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離酶 方法：鹽析、柱層析2、鑒定 抗體活性 酶活性 標記物純度 第三節(jié)第三節(jié) 熒光標記技術熒光標記技術一、常用標記方法二、標記免疫物的分離與純化常用標記方法常用標記方法1、熒光素的概念2、生物標記熒光素的要求3、常用熒光素標記原理與方法 生物標記熒光素的要求生物標記熒光素的要求1、具

4、有與蛋白質共價結合的能力2、熒光效率高3、能與背景物質形成鮮明對比4、不影響蛋白質的生物、免疫活性5、標記方法安全、簡便6、標記物穩(wěn)定，易保存FITCFITC的標記原理與方法的標記原理與方法熒光素-N=C=S + NH2-抗體熒光素-N-C-N-抗體H S HRB200RB200的標記原理與方法的標記原理與方法熒光素-SO3Na + PCl5熒光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl熒光素-SO2 Cl + NH2-抗體 熒光素-SO2 -NH-抗體 + HCl 標記免疫物的分離與鑒定標記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離熒光素 方法：柱層析2、鑒定 抗體活性 標記物結合度 F/

5、P比值的應用意義 第四節(jié)第四節(jié) 放射性核素標記技術放射性核素標記技術一、常用標記方法二、標記免疫物的分離與純化常用標記方法常用標記方法1、常用放射性核素2、125I 的標記方法 直接法（氯胺T法） 間接法（連接法）直接法（氯胺直接法（氯胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T間接法（連接法）間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+ Na125I氯胺T125INSHPP間接法（連接法）間接法（連接法）CH2OHOH-C

6、-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHH-C-C-N-蛋白質H O H+ NH2-蛋白質125I125I標記免疫物的分離與鑒定標記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離放射性核素 方法：柱層析2、鑒定 游離放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）應用意義本章小結本章小結1、免疫標記技術的概念2、常用免疫標記物質及其標記方法3、標記免疫物質的分離與鑒定思考題思考題1、何謂免疫標記技術？2、常用的免疫標記物質有哪些？3、酶標記的主要方法有哪些？4、F/P比值的實用意義如何？5、何謂比放射性？有何意義？ 第一節(jié)第一節(jié) 標記免疫技術的分類標記免疫技術的分類一、按指示

7、標記物質劃分的類型二、按測定方式劃分的類型三、按測定用途劃分的類型1、酶免疫技術2、熒光免疫技術3、放射免疫技術4、發(fā)光免疫技術5、金免疫技術按指示標記物質劃分的類型按指示標記物質劃分的類型1、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）按測定方式劃分的類型按測定方式劃分的類型均相型（均相型（homogenous）非均相型（非均相型（heterogeneous）雙標記均相熒光免疫測定雙標記均相熒光免疫測定酶擴大免疫測定技術酶擴大免疫測定技術1、免疫測定技術2、免疫組化技術按測定用途劃分的類型按測定用途劃分的類型 第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗一、EL

8、ISA技術的原理與方法二、 ELISA技術的操作注意要點ELISA技術的原理與方法技術的原理與方法間接法 夾心法 競爭法間接法間接法夾心法夾心法競爭法競爭法酶標儀酶標儀酶標儀酶標儀ELISA技術的操作注意要點技術的操作注意要點試劑器材操作環(huán)節(jié) 合適工作濃度 第三節(jié)第三節(jié) 熒光抗體技術熒光抗體技術一、熒光抗體技術的原理與方法二、熒光抗體技術的操作注意要點熒光抗體技術的原理與方法熒光抗體技術的原理與方法直接法間接法補體法雙標記法 直接法間接法補體法雙標記法熒光抗體技術的操作注意要點熒光抗體技術的操作注意要點標本處理染色操作 結果觀測熒光顯微鏡熒光顯微鏡熒光顯微鏡使用原理熒光顯微鏡使用原理激發(fā)濾片（

9、BG）吸收濾片（OG）標本FITC吸收光峰值：490-495nm FITC發(fā)射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650激發(fā)濾片激發(fā)濾片吸收濾片吸收濾片熒光濾鏡使用原理熒光濾鏡使用原理 第四節(jié)第四節(jié) 放射免疫測定技術放射免疫測定技術一、放射免疫測定技術的原理與方法二、放射免疫測定技術的操作注意要點結合相游離相放射免疫分析法的原理與方法放射免疫分析法的原理與方法1 2 5 10 20 50 10040302010未標記抗原含量未標記抗原含量結結合、合、游游離離相相放放射射性性含含量量比比值值液閃儀液閃儀計數(shù)器計數(shù)器放射免疫測定技術的操作注意要點放射免疫測定技術的操作注意要點反應的溫度與時間結合相與游離相的分離免疫標記技術的比較免疫標記技術的比較 FIA ELISA RIA敏感性 較低 高 高特異性 高 高 高重復性 差 好