高效液相色譜-2013

1、液相色譜基礎(chǔ)知識二、定義二、定義 色譜法色譜法(Chromatography)：利用組分在：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。色譜法的分離原理色譜法的分離原理 利用樣品混合物中各組分理、化性質(zhì)的不同以及在兩相間分配系數(shù)的差異, 當(dāng)兩相相對移動時，各組分在兩相中反復(fù)多次重新分配，結(jié)果使混合物得到分離。 兩相中，固定不動的一相稱固定相(Stationary phase)；移動的一相稱流動相(Mobile phase)，攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體。色譜發(fā)展史色譜發(fā)展史 100年前，俄國的植物學(xué)家Tswett創(chuàng)立了色譜法。由Tswett創(chuàng)立的色譜法分離效

2、率低，分離時間長，根據(jù)樣品的不同，一般分離需要幾小時至幾天。 20世紀(jì)40年代至50年代初，先后出現(xiàn)了紙色譜（paper chromatography,PC）和薄膜色譜法(thin-layer chromatography,TLC)。 特點(diǎn)：較經(jīng)典色譜法簡單、分離時間短，樣品量要求小。 1952年，James和Martin提出了氣相色譜法（gas chromatography,GC) 特點(diǎn)： 以氣體作為流動相。應(yīng)用范圍廣泛受到人們重視。但對不易 氣化和熱不穩(wěn)定性差的化合物難以分離。 20世紀(jì)60年代后期由于新型色譜柱填料的，高壓輸液泵和高靈敏度的檢測器的出現(xiàn)，發(fā)展出了高效液相色譜（High p

3、erformance liquid chromatography, HPLC）。 液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法v適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析物的分析v流動相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用流動相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用（一）分離原理（二）常用吸附劑（三）吸附劑和流動相的選擇經(jīng)典液相色譜經(jīng)典液相色譜（二）常用吸附劑：多孔、微粒狀物質(zhì)（二）常用吸附劑：多孔、微粒狀物質(zhì) 1. 硅膠 2. 氧化鋁 3. 聚酰胺結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)：內(nèi)部硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)多孔結(jié)構(gòu) 表面有硅醇基氫

4、鍵作用吸附活性中心 特性特性： 1）與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵 物質(zhì)極性，吸附能力強(qiáng)極性吸附中心，不易洗脫2）吸水失活 105110OC烘干30分鐘(可逆失水)吸附力最大 500OC烘干(不可逆失水)活性喪失，無吸附力分析酸性或中性物質(zhì) 2. 氧化鋁氧化鋁 堿性氧化鋁 pH 910 適于分析堿性、中性物質(zhì) 中性氧化鋁 pH7.5 適于分析酸性堿性和中性物質(zhì) 酸性氧化鋁 pH 45 適于分析酸性、中性物質(zhì)3. 聚酰胺聚酰胺 氫鍵作用 氫鍵能力強(qiáng)，組分越后出柱 1. 被測組分性質(zhì)（極性大?。罕粶y組分性質(zhì)（極性大?。?烴 - - - - - - - - 羧酸，醇 2. 吸附劑的活性：吸附劑

5、的活性： 吸附劑的活性大，對被測組分的吸附能力強(qiáng) 強(qiáng)極性物質(zhì)強(qiáng)極性物質(zhì)選擇弱吸附劑選擇弱吸附劑 弱極性物質(zhì)弱極性物質(zhì)選擇強(qiáng)吸附劑選擇強(qiáng)吸附劑3. 流動相的極性：流動相的極性： 流動相極性大，對被測組分的洗脫能力大 “相似相溶相似相溶”原則原則 ：根據(jù)組分性質(zhì)、吸附劑的活根據(jù)組分性質(zhì)、吸附劑的活性，性， 選擇適當(dāng)極性的流動相選擇適當(dāng)極性的流動相4. 4. 三者關(guān)系圖示三者關(guān)系圖示： 組分 吸附劑 流動相 極性 活性小 極性 非(弱)極性 活性大 非極性或弱極性（一）概述（二）定性參數(shù)（三）吸附劑的選擇 （四）展開劑的選擇 （五）薄層板的制備（六）定性與定量分析1定義定義：將固定相均勻涂布在表面光

6、滑的平板上， 形成薄層而進(jìn)行色譜分離和分析的方法2操作過程：鋪板 活化 點(diǎn)樣 展開 定位(定性)/洗脫(定量)3分離機(jī)制：吸附吸附（分配，離子交換，空間排阻）4特點(diǎn)：分析快速、靈敏、顯色方便5應(yīng)用：藥物雜質(zhì)檢查、純度測定 L0L1L21. 比移值比移值Rf01LLRf原點(diǎn)到溶劑前沿的距離心的距離原點(diǎn)到組分斑點(diǎn)質(zhì)量中討論討論 Rf與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān) 色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜基本定性參數(shù)，說明組分的色譜保留行為 1）K大，Rf小 2）薄層板一定，對于極性組分 展開劑極性大，Rf大（容易洗脫） 展開劑極性小，Rf小 （不容易洗脫） 3）Rf范圍：0

7、 Rf 1 （組分遷移速度和距離小于展開劑遷移速度和距離） Rf = 0.20.8（常用） 0.30.5（最佳）2. 相對比移值相對比移值Rs 參考物與被測組分在完全相同條件下展開 可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性； 參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可為樣品中已知組分 相對比移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于121LLRRRffs中心的距離原點(diǎn)到參考物斑點(diǎn)質(zhì)量心的距離原點(diǎn)到組分斑點(diǎn)質(zhì)量中（參）（組）（三）吸附劑的選擇（三）吸附劑的選擇根據(jù)被測物極性和吸附劑的吸附能力 被測物極性強(qiáng)弱極性吸附劑 被測物極性弱強(qiáng)極性吸附劑（四）展開劑的選擇（四）展開劑的選擇（同液固吸附

8、色譜流動相的選擇） 根據(jù)被測組分、吸附劑和展開劑本身的極性（六）定性與定量分析（六）定性與定量分析 定性分析日光，紫外光，顯色 定量分析洗脫法，薄層掃描法將固定相放在紙上，以紙做載體進(jìn)行點(diǎn)樣、展開、定性、和定量的液-液分配色譜法固定相：紙纖維吸附的水流動相：與水不互溶的有機(jī)溶劑（飽和正丁醇）分離機(jī)制：同液-液分配色譜定性參數(shù)： 經(jīng)典經(jīng)典LC與與HPLC比較比較HPLC特點(diǎn)：高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便特點(diǎn)：高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便HPLC:GCGC與與HPLCHPLC比較比較 GCHPLC流動相流動相惰性氣體（無親和性，只起惰性氣體（無親和性，只起運(yùn)載作用）運(yùn)載作用

9、）氣體、沸點(diǎn)較低的化合物氣體、沸點(diǎn)較低的化合物不同極性的液體（有一定不同極性的液體（有一定親和作用）親和作用）溫溫 度度較高較高一般室溫一般室溫分析對象分析對象高沸點(diǎn)、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)高沸點(diǎn)、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物、生物大分子、高分子物、生物大分子、高分子化合物化合物高效液相色譜的固定相和流動相 （）固定相 高效液相色譜固定相依據(jù)承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。 剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O1081.O109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，是目前最廣泛使用的一種固定相。 硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它

10、由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5108Pa。 固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。 1.表面多孔型固定相 基體是實(shí)心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。表面活性材料為硅膠的固定相如國外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠等；表面活性材料為氧化鋁的固定相，如Pellumina；為聚酰胺的，如Pellion。 特點(diǎn)：多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于

11、多孔層厚度薄，最大允許量受限制。 2全多孔型固定相 由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。如國外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的YWG系列，天津試劑二廠的DG系列等。 由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，如國外的Lichrosorb ALOXT。 特點(diǎn)：顆粒很細(xì)（5-10m），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析 （二）流動相 高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，須具有合適的極性和好的選擇性。（2）溶劑要與檢測器匹

12、配。 對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。 對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達(dá)最高靈敏度。（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加501OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。(5)低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇、乙腈等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。高效液相色譜法分類及分離機(jī)理高效液相色譜法分類及分

13、離機(jī)理 分配色譜樣品組分在吸附于惰性載體上的固定液和流動相之間分配系數(shù)不同 鍵合相色譜樣品組分在鍵合于惰性載體上的固定液和流動相之間的分配系數(shù)不同 吸附色譜樣品組分對固定相表面吸附力不同 體積排阻色譜利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開 離子交換色譜不同離子與固定相上相反電荷間的作用力大小不同 親和色譜利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離的一種方法（一）分配色譜（partition chromatography） 原理： 固定液吸附在惰性載體上，樣品分子依據(jù)他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進(jìn)入兩相分配而實(shí)現(xiàn)分離。適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極

14、性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。 固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液，一氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈取Ａ鲃酉?在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。 根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正正相分配色譜相分配色譜和反相分配色譜反相分配色譜。如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜正相分配色

15、譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出后流出。如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。 反相色譜最常用的流動相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、異丙醇等。水甲醇體系：大約60水的時候粘度最大水乙腈體系：35水的時候粘度最大。(二)鍵合相色譜（Covalentstationary phase chromatography） 為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，

16、因此對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。 鍵合固定相優(yōu)點(diǎn)： 對極性有機(jī)溶劑有良好的化學(xué)穩(wěn)定性；使色譜柱的柱效高、壽命長；實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好；幾乎適于各種有機(jī)化合物的分離；可以梯度洗脫。 缺點(diǎn)是不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。 1鍵合固定相類型 用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)反應(yīng)成鍵,可得到各種性能的固定相。 一般可分三類（1）疏水基團(tuán) 如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等（2）極性基團(tuán) 如氨丙基，氰乙基

17、、醚和醇等。（3）離子交換基團(tuán) 如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季銨鹽；作為陽離子交換基團(tuán)的磺酸等.2鍵合固定相的制備（l）硅酸酯（Si一OR）鍵合固定相,它是最先用于液相色譜的鍵合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)： Si0HROHSiORH20 由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。（2）SiC或Si一N共價鍵合固定相 制備反應(yīng)如下 共價鍵鍵合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時，必須限制pH在4-8范圍內(nèi)。OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSiNHCH2C

18、HNH2H2NCH2CH2NH2（3）硅烷化（SiOSiC）鍵合固定相制備反應(yīng)如下： OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+ HCl這類鍵合固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在70以下，pH=2-8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛。3反相鍵合相色譜法 反相鍵合相色譜固定相極性流動相極性v 固定相：烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。如最常用的ODS柱或C18柱就是最典型的代表，其極性很小。v 流動相：極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇一水、乙腈一水、水和無機(jī)鹽的緩沖溶液等。v 適于分離非極性、弱極性離子型樣品，是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式。若采用水和無機(jī)鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些

19、易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。v 反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。 4. 正相鍵合相色譜法 正相鍵合相色譜固定相極性流動相極性v 固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。v 流動相：非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如醇）v 適合分離脂溶、水溶性的極性、強(qiáng)極性化合物。主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。5.離子性鍵合相色譜法 v固定相：以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H 一CH2NH2、C00H、一CH2N（CH3 ) 2等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相

20、；v流動相：一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。 （三）液一固吸附色譜法(LSAC) 分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物質(zhì)，表面有吸附中心，樣品組分與流動相競爭吸附中心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保留時間不同而實(shí)現(xiàn)分離。 當(dāng)流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當(dāng)試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓肿樱?，在固定相表面發(fā)生競爭吸附: X + nSad = Xad + nS 達(dá)平衡時,有 nadnadadSXSXK其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組

21、分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。 固定相： 通常是強(qiáng)極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑?；钚怨枘z最常用。 流動相： 弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。 應(yīng)用： 對于極性，結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是最有效的方法，如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離。 缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生不對稱峰和拖尾現(xiàn)象。極性吸附劑上有機(jī)化合物的保留順序如下：氟碳化合物飽和烴 烯烴芳烴有機(jī)鹵化物醚硝基化合物腈叔胺酯醛酮醇伯胺酰胺羧酸磺酸 正相正相HPLCHPLC（norm

22、al phase HPLCnormal phase HPLC）： 由極性固定相和非極性流動相所組成的液相色譜體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。 反相反相HPLCHPLC（reversed phase HPLCreversed phase HPLC）： 由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流動相是甲醇和乙腈。（四）體積排阻色譜（SEC，size exclusion chromatograp

23、hy）v 排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。v 排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。v 特點(diǎn)：（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于10才能得以分離。 原理： 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯酰胺等）作

24、固定相，依據(jù)樣品分子量大小達(dá)到分離目的。大分子不進(jìn)入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進(jìn)入大部分凝膠孔洞，在柱中被強(qiáng)滯留，后被洗脫。 根據(jù)樣品性質(zhì)分類： 凝膠過濾（GFC）用于分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核酸、多糖。 凝膠滲透（GPC）用于分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。 SEC主要依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，因此與樣品、流動相間的相互作用無關(guān)。不采用改變流動相的組成來改善分離度。固定相 排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。 所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚

25、體。 （1）軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 （2）半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。 （3）剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa，流速1cm3s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。流動相1）排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品

26、。2）與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。3）溶劑的粘度要小，因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分離效果。這對于具有低擴(kuò)散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。4）選擇溶劑還必須與檢測器相匹配。 常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機(jī)溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。（五）離子交換色譜（ion exchange chromatography, IEC） 利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換

27、色譜法進(jìn)行分離。 不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。 分離原理：使用表面有離子交換基團(tuán)的離子交換劑作為固定相。帶負(fù)電荷的交換基團(tuán)（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽離子的分離；帶正電荷的交換基團(tuán)（如季胺鹽）可以用于陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離。1離子交換原理 離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：

28、陽離子交換： RSO3-H+M+RSO3-M+ H+陰離子交換： RNR3+Cl-+ X-RNR3+X-+ Cl-達(dá)平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）： 式中Ar，Br 分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，A、B則代表它們在溶液中的濃度。KB/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。rrABABABK/一般形式： R一AB RBA 對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二價離子的順序?yàn)椋?Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+對于季銨型強(qiáng)陰離子交換樹

29、指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋?ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH-HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF2固定相 作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分，再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分。分類分類按離子交換劑類型：按離子交換劑類型：強(qiáng)陽離子交換劑強(qiáng)陽離子交換劑 以磺酸基為代表（以磺酸基為代表（-SO-SO3 3- -) )強(qiáng)陰離子交換劑強(qiáng)陰離子交換劑 以季胺基為代表以季胺基為代表 (-NR(-NR3 3+ +) )弱陽離子交換劑弱陽離子交換劑 以羧酸基為代表以羧酸基為代表

30、 (-COO(-COO- -) )1.1.弱陰離子交換劑弱陰離子交換劑 以二乙基氨基為代表以二乙基氨基為代表(-CH(-CH2 2N(CN(C2 2H H5 5) )2 2H H+ +) )按固定相制作方法：按固定相制作方法：多孔型離子交換樹脂多孔型離子交換樹脂薄膜型離子交換樹脂薄膜型離子交換樹脂表面多孔型離子交換樹脂表面多孔型離子交換樹脂1. 離子交換鍵合固定相離子交換鍵合固定相 （l）多孔型離子交換樹脂 主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5-20m，有微孔型和大孔型之分。（2）薄膜型離子交換樹脂 是在直徑約30m的固體惰性核上，凝聚1-2m厚的樹脂層。（3）表面多孔型離子交換

31、樹脂 是在固體惰性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。（4）離子交換鍵合固定相 是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。 分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實(shí)現(xiàn)快速分離。 流動相 1）離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。 2）通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。 一般，對于陰離子交換樹

32、脂來說，各種陰離子的滯留次序?yàn)椋簷幟仕犭x子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN- Cl-HCOO-CH3C00-OH-F-所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。陽離子的滯留次序大為： Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+MgAg+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十 差別不如陰離子明顯。 3）關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。 (六)親和

33、色譜法（AC） 1）親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離的一種方法。 2）通常是在載體（無機(jī)或有機(jī)填料）表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）。 3）固載化的配基只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。圖20-9為親和色譜法示意圖。 固定相：固定相：載體和配基載體和配基載體：載體：具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有相當(dāng)數(shù)量可供耦聯(lián)的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有相當(dāng)數(shù)量可供耦聯(lián)的基團(tuán)，能結(jié)合配基，無吸附性，均一，有一定硬度，基團(tuán)，能結(jié)合配基，無吸附性，均一，有一定硬度，性質(zhì)穩(wěn)

34、定。常用的有瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、性質(zhì)穩(wěn)定。常用的有瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、多孔玻璃葡聚糖凝膠、多孔玻璃配基：配基：對親和物有專一的親和力，有能與載體相連的對親和物有專一的親和力，有能與載體相連的基團(tuán)，如腺嘌呤核苷酸吸附劑，核苷酸吸附劑等基團(tuán)，如腺嘌呤核苷酸吸附劑，核苷酸吸附劑等 流動相：流動相：緩沖溶液緩沖溶液 應(yīng)用：應(yīng)用：生物大分子分離和分析生物大分子分離和分析分離類型的選擇分離類型的選擇 1根據(jù)相對分子質(zhì)量選擇 相對分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質(zhì)量范圍是20O-2000。對于相對

35、分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用排阻法為最佳。 2根據(jù)溶解度選擇 弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果樣品可溶于水并屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采用液一固吸 附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。 3根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇 用紅外光譜法，可預(yù)先簡單地判斷樣品中存在什么官能團(tuán)。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構(gòu)體用液

36、一固吸附色譜；同系物或不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的用液一液分配色譜。 現(xiàn)列表作為選擇分離類型的參考。 液相色譜分離類型選擇參考表液相色譜分離類型選擇參考表 溶于水排阻色譜，水為流動相 相對分子質(zhì)量 2000 不溶于水排阻色譜，非水流動相 同系物分配色譜 不溶于水 異構(gòu)體吸附色譜樣品 分子大小差異排阻色譜 反相液一液色譜 相對分子質(zhì)量 溶于水，不離解 2000 排阻色譜，水為流動相 堿陽離子交換色譜 溶于水，可離解 酸陰離子交換色譜 HPLC儀器儀器:1.流動相系統(tǒng)4.其他輔助系統(tǒng)2.分離系統(tǒng)3.檢測系統(tǒng)Agilent 1100系列高效液相色譜系統(tǒng)系列高效液相色譜系統(tǒng) 儲液槽儲液槽 貯液槽貯液槽材料：應(yīng)

37、當(dāng)耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚酮（PEEK）。貯液槽容積：0.5-2.0L。要求：1. 貯液槽放置位置要高于泵體，以保持一定的輸液靜壓。2. 貯液槽在使用中應(yīng)密閉，以防溶劑蒸發(fā)引起流動相組成的變化，并可防止空氣中的CO2,O2重新溶解于脫氣的流動相中。 采用采用 “HPLC” 級溶劑級溶劑 避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑 對試樣有適宜的溶解度對試樣有適宜的溶解度 溶劑粘度要小溶劑粘度要小 與檢測器相匹配與檢測器相匹配 過濾過濾：0.45um或更小孔徑濾膜或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜目的：除去溶劑

38、中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其在使用無機(jī)鹽配制的緩沖液時柱，尤其在使用無機(jī)鹽配制的緩沖液時脫氣脫氣 目的：除去流動相中因溶解或混合而產(chǎn)生的氣泡目的：除去流動相中因溶解或混合而產(chǎn)生的氣泡脫氣裝置脫氣裝置氦氣脫氣法在線脫氣法 脫氣脫氣 吹氦氣脫氣法 適于給所有溶劑脫氣，脫氣效率高，但價 格昂貴。(如上圖：左圖) 加熱回流法 抽真空脫氣法 外接真空泵，對溶劑抽真空。由于抽真空會引起溶劑組成的改變，故不適于混合溶劑。因此要對每種溶劑預(yù)先脫氣后再進(jìn)行混合。 超聲波脫氣法 將溶劑倒入超聲波清洗器中，用超聲波震蕩趕走氣泡。脫氣效果最差。以上方法均為離線脫氣，隨溶劑存放時間延長又會有空氣進(jìn)入溶劑。 在線真

39、空脫氣法 將真空脫氣裝置串接到貯液罐于高壓泵之間，實(shí)現(xiàn)溶劑在進(jìn)入高壓泵之前的連續(xù)脫氣。脫氣效果最優(yōu)(如上圖: 右圖)。高壓輸液泵高壓輸液泵恒流泵 高壓輸液泵高壓輸液泵在高效液相色譜分析中，色譜柱裝填5-10m的固定相，對流動相的通過有很大的阻力。高壓輸液泵的作用就是用較高的壓力推動流動相進(jìn)入色譜柱。高壓輸液泵分兩類：恒流泵 恒壓泵恒流泵可輸出恒定體積流量的流動相。（1）單柱塞注射型泵（2）雙柱塞往復(fù)型并聯(lián)泵恒壓泵，是輸出恒定壓力的泵。以壓縮空氣為驅(qū)動力，高壓推動活塞往復(fù)運(yùn)動完成流動相的吸入和輸出。以改變氣體壓力調(diào)節(jié)載液流速。輸輸液液泵泵進(jìn)樣進(jìn)樣器器色色譜譜柱柱柱溫箱柱溫箱檢測檢測器器 A 泵泵

40、進(jìn)樣進(jìn)樣器器色色譜譜柱柱柱溫箱柱溫箱檢測檢測器器 B泵泵AB時間時間B 濃濃度度MeOH / H2O = 6 / 4MeOH / H2O = 8 / 2( column : ODS type )95%30%甲醇甲醇 濃濃度度混合器混合器低低壓壓梯度比例梯度比例閥閥 高高壓壓梯度梯度低低壓壓梯度梯度脫氣機(jī)脫氣機(jī)高壓/低壓梯度系統(tǒng)高壓梯度系統(tǒng)高壓梯度系統(tǒng) 梯度準(zhǔn)確度好梯度準(zhǔn)確度好 系統(tǒng)復(fù)雜系統(tǒng)復(fù)雜 (需兩臺或三臺泵需兩臺或三臺泵)低壓梯度系統(tǒng)低壓梯度系統(tǒng) 系統(tǒng)簡單系統(tǒng)簡單 需在線脫氣機(jī)需在線脫氣機(jī) 存在時間滯后效應(yīng)存在時間滯后效應(yīng)高壓/低壓梯度系統(tǒng)Agilent 四元梯度泵手動進(jìn)樣器手動進(jìn)樣器自動

41、進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器 裝填狀態(tài)裝填狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài) 部分注入：一般要求進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的一半，如20l的定量環(huán)最多進(jìn)樣10l的樣品，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同； 全量注入：進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20l的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100l的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。 手動進(jìn)樣器操作注意點(diǎn)：1 1）進(jìn)樣應(yīng)使用液相色譜專用平頭進(jìn)樣針）進(jìn)樣應(yīng)使用液相色譜專用平頭進(jìn)樣針2 2）進(jìn)樣時，進(jìn)樣針應(yīng)插到底）進(jìn)樣時，進(jìn)樣針應(yīng)插到底3 3）轉(zhuǎn)動手柄時應(yīng)盡快，不要停留在中途）轉(zhuǎn)動手柄時應(yīng)盡快，不要停留在中途4 4）樣品溶液）樣品溶液pHpH小于小于1010, , 常用密封墊的材質(zhì)適用常用密封墊的材質(zhì)適用pH10, pH10, 否則換特氟隆材質(zhì)的密封墊否則換特氟隆材質(zhì)的密封墊pH10-13pH10-13微量注射器微量注射器 紅色表示殘留樣品紅色表示殘留樣品便捷的方法（不需清洗）便捷的方法（不需清洗） 1.1.進(jìn)樣狀態(tài)下插入微量注射器進(jìn)樣狀態(tài)下插入微量注射器 2.2.切到裝填狀態(tài)切到裝填狀態(tài) 3.3.注入樣品注入樣品 4.4.切回到進(jìn)樣狀態(tài)切回到進(jìn)樣狀態(tài)自動進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器適合大量樣品