中藥致癌作用

1、第七章第七章 中藥致癌作用中藥致癌作用Chemical Carcinogenesis癌癥是遺傳因素和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果癌癥是遺傳因素和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果1775年英國年英國Pott報告掃煙囪工人陰囊癌高發(fā)，提出與煤煙塵有報告掃煙囪工人陰囊癌高發(fā)，提出與煤煙塵有關(guān)；關(guān)；1895年德國年德國Rehn報告染料工人職業(yè)性膀胱癌，疑是化學(xué)物質(zhì)引報告染料工人職業(yè)性膀胱癌，疑是化學(xué)物質(zhì)引起；起；1915年日本山極和市川用煤焦油成功誘發(fā)實驗性皮膚癌；年日本山極和市川用煤焦油成功誘發(fā)實驗性皮膚癌；1922年英國年英國Kennway從煤焦油中分離出多種多環(huán)芳烴，其中幾從煤焦油中分離出多種多環(huán)芳烴，其中幾種

2、可誘發(fā)動物皮膚癌，證實了化學(xué)物的致癌性；種可誘發(fā)動物皮膚癌，證實了化學(xué)物的致癌性；1945年英國年英國Caes對染料工業(yè)膀胱癌流行病學(xué)調(diào)查，對染料工業(yè)膀胱癌流行病學(xué)調(diào)查，證實證實 萘萘胺及聯(lián)苯胺的致癌性。胺及聯(lián)苯胺的致癌性。19701970年，國際癌癥研究所：年，國際癌癥研究所：8090%8090%的人類癌癥和環(huán)境因素有關(guān)，的人類癌癥和環(huán)境因素有關(guān)，其中主要是化學(xué)因素，約占其中主要是化學(xué)因素，約占90%90%以上。以上?；瘜W(xué)致癌作用化學(xué)致癌作用(chemical carcinogenesis指化學(xué)物質(zhì)引起并誘導(dǎo)正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并指化學(xué)物質(zhì)引起并誘導(dǎo)正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)展成為腫瘤的過程。

3、發(fā)展成為腫瘤的過程。化學(xué)致癌物化學(xué)致癌物(chemical carcinogen)(chemical carcinogen)具有致癌作用具有致癌作用的化學(xué)物質(zhì)。的化學(xué)物質(zhì)。前致癌物前致癌物(pro-carcinogen)(pro-carcinogen)間接致癌物間接致癌物(indirect-carcinogen)(indirect-carcinogen)近致癌物近致癌物(proximate carcinogen)(proximate carcinogen)終致癌物終致癌物(ultimate carcinogen(ultimate carcinogen第一節(jié)第一節(jié) 化學(xué)致癌過程化學(xué)致癌過程正常細

4、胞經(jīng)過遺傳學(xué)改變的積累，才能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎?，癌癥的發(fā)生是多階段過程，包括：引發(fā)階段(initiation)促長階段(promotion)進展階段(progression)一、引發(fā)階段一、引發(fā)階段概念：概念：化學(xué)物或其活性代謝物與化學(xué)物或其活性代謝物與DNADNA作用，導(dǎo)致體細胞突變的過程。作用，導(dǎo)致體細胞突變的過程。引發(fā)劑引發(fā)劑(initiator)(initiator)：大多數(shù)是致突變物，沒有可檢測的閾劑量。：大多數(shù)是致突變物，沒有可檢測的閾劑量。引發(fā)作用靶點引發(fā)作用靶點：原癌基因和腫瘤抑制基因：原癌基因和腫瘤抑制基因引發(fā)細胞引發(fā)細胞(initiated cell)(initiated cel

5、l)引發(fā)時間短，是一個突變事件，需經(jīng)過細胞分裂來引發(fā)時間短，是一個突變事件，需經(jīng)過細胞分裂來“固定固定”引發(fā)是不可逆遺傳性改變，表型可能正常，無自主生長性引發(fā)是不可逆遺傳性改變，表型可能正常，無自主生長性-非腫瘤細非腫瘤細胞胞并非所有引發(fā)細胞均將形成腫瘤，大多數(shù)細胞將凋亡。并非所有引發(fā)細胞均將形成腫瘤，大多數(shù)細胞將凋亡。二、促長階段二、促長階段概念：概念：引發(fā)細胞增殖成為癌前病變或良性腫瘤的過程。引發(fā)細胞增殖成為癌前病變或良性腫瘤的過程。促長劑促長劑(promoter)：具有促長作用的化學(xué)物。：具有促長作用的化學(xué)物。促長劑性質(zhì)促長劑性質(zhì)：非突變劑，有量效關(guān)系、閾劑量和最大作用。：非突變劑，有量

6、效關(guān)系、閾劑量和最大作用。通常能引起局部增殖并引起良性腫瘤，少數(shù)細胞可成惡通常能引起局部增殖并引起良性腫瘤，少數(shù)細胞可成惡性腫瘤。性腫瘤。促長階段特點促長階段特點：時間長，早期可逆，晚期不可逆。對生理因：時間長，早期可逆，晚期不可逆。對生理因素調(diào)節(jié)敏感素調(diào)節(jié)敏感(特別是早期特別是早期)，衰老、激素和飲食可影響促長，衰老、激素和飲食可影響促長作用。對開展腫瘤預(yù)防有重要意義作用。對開展腫瘤預(yù)防有重要意義促長作用機制復(fù)雜，可通過改變基因表達起作用。促長作用機制復(fù)雜，可通過改變基因表達起作用。促長劑：促長劑： 佛波佛波酯酯(TPA(TPA，巴豆油活性成分，巴豆油活性成分)小鼠皮小鼠皮膚膚癌癌 糖精糖精

7、-膀胱癌膀胱癌 四四氯氯二二苯并對苯并對二二惡惡英英(TCDD)-(TCDD)-大鼠肝癌、肺、皮大鼠肝癌、肺、皮膚腫膚腫瘤瘤 性激素性激素作用器官、肝作用器官、肝臟腫臟腫瘤瘤 證實引發(fā)和促長作用實驗：證實引發(fā)和促長作用實驗： 周期：周期：3-6個月個月 終點：癌前損害終點：癌前損害(PNL) -小鼠皮膚乳頭瘤、大鼠和小鼠肝轉(zhuǎn)化灶等小鼠皮膚乳頭瘤、大鼠和小鼠肝轉(zhuǎn)化灶等三、進展階段三、進展階段概念：概念：從癌前病變或良性腫瘤轉(zhuǎn)變成惡性腫瘤的過程從癌前病變或良性腫瘤轉(zhuǎn)變成惡性腫瘤的過程惡性生物學(xué)特征：惡性生物學(xué)特征：自主性和異質(zhì)性增加、生長加速、自主性和異質(zhì)性增加、生長加速、侵襲性加強、出現(xiàn)浸潤和轉(zhuǎn)

8、移。侵襲性加強、出現(xiàn)浸潤和轉(zhuǎn)移。出現(xiàn)惡性特征原因：出現(xiàn)惡性特征原因： -核型不穩(wěn)定性核型不穩(wěn)定性(染色體不穩(wěn)定性染色體不穩(wěn)定性)：染色體發(fā)生斷：染色體發(fā)生斷裂、斷片易位及非整倍體變化。裂、斷片易位及非整倍體變化。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(micosatellite instability，MSI)-不不穩(wěn)定性生物學(xué)標志：穩(wěn)定性生物學(xué)標志：進展劑進展劑(progressor)：使細胞由促長階段進入進展期：使細胞由促長階段進入進展期的化學(xué)物。的化學(xué)物。 -砷酸鹽、石棉纖維、苯、羥基脲等砷酸鹽、石棉纖維、苯、羥基脲等完全致癌物完全致癌物(compelet carcinogen)同時具有引發(fā)、同時

9、具有引發(fā)、促長及進展階段作用的致癌物。促長及進展階段作用的致癌物。( (黃曲毒素黃曲毒素) )綜上所述綜上所述- 化學(xué)物致癌是長期的、復(fù)雜的多階段過程，化學(xué)物致癌是長期的、復(fù)雜的多階段過程，至少涉及引發(fā)、促長和進展三個階段。至少涉及引發(fā)、促長和進展三個階段。 在引發(fā)和進展階段主要是遺傳機制，在促在引發(fā)和進展階段主要是遺傳機制，在促長階段主要是表遺傳機制。在引發(fā)階段主要是長階段主要是表遺傳機制。在引發(fā)階段主要是細胞原癌基因和腫瘤抑制基因的突變，在進展細胞原癌基因和腫瘤抑制基因的突變，在進展階段主要是核型不穩(wěn)定。階段主要是核型不穩(wěn)定。 正常細胞經(jīng)過遺傳學(xué)改變的積累才轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜毎?jīng)過遺傳學(xué)改變的積

10、累才轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎０┘毎?。遺傳機制學(xué)說遺傳機制學(xué)說(genetic theory)：外來致癌因素引外來致癌因素引起細胞基因的改變或外來基因整合到細胞基因起細胞基因的改變或外來基因整合到細胞基因中，導(dǎo)致癌變。中，導(dǎo)致癌變。表遺傳機制學(xué)說表遺傳機制學(xué)說(epigenetic theory) ：癌癥的發(fā)癌癥的發(fā)生是由于非基因改變機制引起的生是由于非基因改變機制引起的化學(xué)致癌機制學(xué)說化學(xué)致癌機制學(xué)說：親電子劑學(xué)說、體細胞突變：親電子劑學(xué)說、體細胞突變學(xué)說、癌基因?qū)W說、癌變多階段學(xué)說學(xué)說、癌基因?qū)W說、癌變多階段學(xué)說第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)致癌機制化學(xué)致癌機制體細胞突變學(xué)說體細胞突變學(xué)說突變與癌癥：突變與癌癥：

11、1)很多致癌物是致突變物很多致癌物是致突變物2)對某些致癌物的易感性取決于細胞代謝活化酶轉(zhuǎn)化致癌對某些致癌物的易感性取決于細胞代謝活化酶轉(zhuǎn)化致癌物成為致突變物的活力物成為致突變物的活力3)DNA修復(fù)能力的缺失增加癌發(fā)生的可能性修復(fù)能力的缺失增加癌發(fā)生的可能性4)在多種癌觀察到染色體和基因組的不穩(wěn)定性在多種癌觀察到染色體和基因組的不穩(wěn)定性5)某些癌有突變的癌基因某些癌有突變的癌基因6)癌的單克隆性癌的單克隆性7)某些癌具有可遺傳性某些癌具有可遺傳性8)某些癌有腫瘤抑制基因的丟失或突變某些癌有腫瘤抑制基因的丟失或突變癌基因與腫瘤抑制基因癌基因與腫瘤抑制基因癌基因癌基因(oncogene)(onco

12、gene)：一類能引起細胞惡性轉(zhuǎn)化及癌變的基：一類能引起細胞惡性轉(zhuǎn)化及癌變的基因。通常以原癌基因因。通常以原癌基因(pro-oncogene)形式普遍存在于正形式普遍存在于正常基因組內(nèi)。在進化過程中高度保守，具有正常的生物?；蚪M內(nèi)。在進化過程中高度保守，具有正常的生物學(xué)功能，對細胞增殖、分化和信息傳遞的調(diào)控起重要作學(xué)功能，對細胞增殖、分化和信息傳遞的調(diào)控起重要作用。只有當受到各種致癌因素作用而用。只有當受到各種致癌因素作用而激活激活變?yōu)榛罨陌┳優(yōu)榛罨陌┗蚧蚧蚧蜻^度表達過度表達后才顯示其致癌性。后才顯示其致癌性。如如ras基因家族基因家族腫瘤抑制基因腫瘤抑制基因(tumor suppr

13、essor gene)：抑癌基因或抗：抑癌基因或抗癌基因。作用方式與癌基因相反，在正常細胞中抑制增癌基因。作用方式與癌基因相反，在正常細胞中抑制增殖和促進分化。在致癌因素作用下，腫瘤抑制基因殖和促進分化。在致癌因素作用下，腫瘤抑制基因突變突變或或失活失活而引起細胞的惡性轉(zhuǎn)化。而引起細胞的惡性轉(zhuǎn)化。如如p53非突變致癌機制非突變致癌機制化學(xué)物通過不涉及基因結(jié)構(gòu)化學(xué)物通過不涉及基因結(jié)構(gòu)(DNA(DNA序列序列) )的改變，的改變，使基因外的一些變化，影響基因的調(diào)控，使基使基因外的一些變化，影響基因的調(diào)控，使基因出現(xiàn)不正常關(guān)閉和開放，進而影響細胞的增因出現(xiàn)不正常關(guān)閉和開放，進而影響細胞的增殖，引癌變

14、。殖，引癌變。表遺傳學(xué)表遺傳學(xué)(epigenetics)(epigenetics)研究從基因演繹為表型的研究從基因演繹為表型的過程和機制的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。過程和機制的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。 (在基因的在基因的DNA 序列沒有發(fā)生改變的情況下序列沒有發(fā)生改變的情況下,基因功基因功能發(fā)生了可遺傳的變化能發(fā)生了可遺傳的變化,并最終導(dǎo)致了表型的變化。并最終導(dǎo)致了表型的變化。) 1、表觀遺傳調(diào)控失常導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、表觀遺傳調(diào)控失常導(dǎo)致腫瘤發(fā)生2、細胞異常增生、細胞異常增生3、免疫抑制、免疫抑制4、內(nèi)分泌激素失衡、內(nèi)分泌激素失衡5、過氧化酶體增殖劑激活受體、過氧化酶體增殖劑激活受體第三節(jié)、化學(xué)致癌物分類第

15、三節(jié)、化學(xué)致癌物分類(作用機制作用機制)遺傳毒性致癌物遺傳毒性致癌物(genotoxic carcinogens)非遺傳毒性致癌物非遺傳毒性致癌物(non- genotoxic carcinogens) 表表(觀觀)遺傳致癌物遺傳致癌物(epigenetic carcinogens)1 1、遺傳性致癌物、遺傳性致癌物概念：概念：進入細胞后作用于遺傳物質(zhì)進入細胞后作用于遺傳物質(zhì)( (主要是主要是DNA)DNA)，通過引，通過引起細胞遺傳物質(zhì)的改變，導(dǎo)致癌變的化學(xué)物起細胞遺傳物質(zhì)的改變，導(dǎo)致癌變的化學(xué)物 -可利用遺傳毒理學(xué)試驗來檢測可利用遺傳毒理學(xué)試驗來檢測(1)(1)直接致癌物直接致癌物(dir

16、ect carcinogen)(direct carcinogen)：無需體內(nèi)代謝活化：無需體內(nèi)代謝活化即可致癌。即可致癌。 大多數(shù)為親電子劑，可與細胞大分子親核中心發(fā)生共大多數(shù)為親電子劑，可與細胞大分子親核中心發(fā)生共價結(jié)合。價結(jié)合。如：烷基和芳香基環(huán)氧化物、內(nèi)酯、硫酸酯、亞硝酰胺等如：烷基和芳香基環(huán)氧化物、內(nèi)酯、硫酸酯、亞硝酰胺等(2)、間接致癌物間接致癌物(indirect carcinogen)(indirect carcinogen)：需體內(nèi)：需體內(nèi)代謝，活化代謝產(chǎn)物致癌。代謝，活化代謝產(chǎn)物致癌。前致癌物前致癌物(precarcinogen)(precarcinogen)近致癌物近致癌

17、物(proximate carcinogen)(proximate carcinogen)：代謝后先轉(zhuǎn)變：代謝后先轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)性質(zhì)活潑但壽命短暫的中間形式為化學(xué)性質(zhì)活潑但壽命短暫的中間形式終致癌物終致癌物(ultimate carcinogen(ultimate carcinogen 產(chǎn)物為親電子劑，產(chǎn)物為親電子劑，一些可能有多種代謝產(chǎn)物一些可能有多種代謝產(chǎn)物如：多環(huán)芳烴類化合物、芳香胺類、亞硝胺類、偶如：多環(huán)芳烴類化合物、芳香胺類、亞硝胺類、偶氮化合物、硝基雜環(huán)類、黃曲毒素氮化合物、硝基雜環(huán)類、黃曲毒素B1B1等等(3)(3)、無機致癌物：、無機致癌物： 有些可能是親電子劑，但可通過選擇性改變

18、有些可能是親電子劑，但可通過選擇性改變DNADNA復(fù)制保真性，導(dǎo)致復(fù)制保真性，導(dǎo)致DNADNA改變改變 如：金屬鎳、鉻、鈦、鎘或它們的鹽類等如：金屬鎳、鉻、鈦、鎘或它們的鹽類等 有些無機元素由于放射性致癌有些無機元素由于放射性致癌 如：氡、鈾、釙、鐳等如：氡、鈾、釙、鐳等2 2、非遺傳性致癌物、非遺傳性致癌物概念：概念：不作用于機體遺傳物質(zhì)的化學(xué)致癌物不作用于機體遺傳物質(zhì)的化學(xué)致癌物 可能間接影響可能間接影響DNADNA并改變基因組導(dǎo)致細胞癌變，通過促進并改變基因組導(dǎo)致細胞癌變，通過促進有絲分裂和抑制凋亡導(dǎo)致癌的發(fā)展。有絲分裂和抑制凋亡導(dǎo)致癌的發(fā)展。(1)(1)、促長劑：、促長劑：本身無致癌性

19、本身無致癌性 在給以遺傳毒性致癌物之后再給予促長劑可增強遺傳在給以遺傳毒性致癌物之后再給予促長劑可增強遺傳毒性致癌物的致癌作用；毒性致癌物的致癌作用； 可促進可促進“自發(fā)性自發(fā)性”轉(zhuǎn)化細胞發(fā)展成癌。轉(zhuǎn)化細胞發(fā)展成癌。如：佛波酯如：佛波酯(TPA(TPA及其衍生物及其衍生物)小鼠皮膚癌小鼠皮膚癌( (已知活性最高已知活性最高) ) 色氨酸、糖精色氨酸、糖精-膀胱癌膀胱癌 二惡英二惡英(TCDD)(TCDD)、DDTDDT、氯丹、苯巴比妥、氯丹、苯巴比妥-肝癌肝癌 丁基羥甲苯丁基羥甲苯(BHT)(BHT)肺腫瘤、肝細胞腺瘤、膀胱癌肺腫瘤、肝細胞腺瘤、膀胱癌(2)(2)、激素調(diào)控、激素調(diào)控( (內(nèi)分

20、泌調(diào)控內(nèi)分泌調(diào)控) )：主要改變內(nèi)分泌：主要改變內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡及細胞正常分化，常起促長劑作用系統(tǒng)平衡及細胞正常分化，常起促長劑作用如：雌、雄激素、類固醇如：雌、雄激素、類固醇 雌二醇、已烯雌酚雌二醇、已烯雌酚-人、動物腫瘤人、動物腫瘤 已烯雌酚已烯雌酚-經(jīng)胎盤致癌經(jīng)胎盤致癌 與化學(xué)致癌物同時或稍后接觸睪酮或合成激與化學(xué)致癌物同時或稍后接觸睪酮或合成激素素-前列腺癌或其他性器官腫瘤前列腺癌或其他性器官腫瘤 抑制甲狀腺激素合成或分泌物質(zhì)抑制甲狀腺激素合成或分泌物質(zhì)甲狀腺瘤甲狀腺瘤 長期在劑量使用抗甲狀腺物質(zhì)如硫脲、某些長期在劑量使用抗甲狀腺物質(zhì)如硫脲、某些磺胺類藥物磺胺類藥物-腫瘤腫瘤(3)(3)

21、、細胞毒劑、細胞毒劑：可引起細胞死亡，導(dǎo)致細胞增殖：可引起細胞死亡，導(dǎo)致細胞增殖活躍及癌發(fā)展活躍及癌發(fā)展如：氮川三乙酸如：氮川三乙酸-大鼠腎癌、膀胱癌大鼠腎癌、膀胱癌 氯仿等氯仿等(4)(4)、過氧化物酶體增殖劑、過氧化物酶體增殖劑：導(dǎo)致細胞內(nèi)氧自由基：導(dǎo)致細胞內(nèi)氧自由基過量生成過量生成過氧化物酶體增殖劑過氧化物酶體增殖劑(peroxisome proliferator)(peroxisome proliferator)：可引起肝臟過氧化物酶體增殖的化合物?？梢鸶闻K過氧化物酶體增殖的化合物。如：降血脂藥：氯貝丁酯如：降血脂藥：氯貝丁酯( (安妥明安妥明) ) 增塑劑：鄰苯二甲酸乙基已酯增塑劑

22、：鄰苯二甲酸乙基已酯(5)(5)、免疫抑制劑、免疫抑制劑：主要對病毒誘導(dǎo)的惡化轉(zhuǎn)化起：主要對病毒誘導(dǎo)的惡化轉(zhuǎn)化起增強作用增強作用如：嘌呤同類物如：嘌呤同類物( (咪唑嘌呤、巰嘌呤咪唑嘌呤、巰嘌呤)人或動物人或動物白血病或淋巴瘤白血病或淋巴瘤(6)(6)、固態(tài)物質(zhì)、固態(tài)物質(zhì)：物理狀態(tài)是關(guān)鍵性因素：物理狀態(tài)是關(guān)鍵性因素如：一些惰性物質(zhì)如：一些惰性物質(zhì)( (塑料塑料) )或金屬薄片或金屬薄片-嚙齒類動嚙齒類動物體內(nèi)的種植部位引發(fā)肉瘤物體內(nèi)的種植部位引發(fā)肉瘤( (物理特性、表面積物理特性、表面積決定致癌能力決定致癌能力) ) 石棉纖維石棉纖維惡性間皮瘤或呼吸系統(tǒng)腫瘤惡性間皮瘤或呼吸系統(tǒng)腫瘤( (石棉石

23、棉的晶體結(jié)構(gòu)，與組分無關(guān)的晶體結(jié)構(gòu)，與組分無關(guān)) )3 3、未分類、未分類如：二如：二噁噁烷、美舍吡倫、乙醇、丙烯腈等烷、美舍吡倫、乙醇、丙烯腈等助癌物助癌物Cocarcinogen：本身或單獨接觸無致癌性，在致癌本身或單獨接觸無致癌性，在致癌物之前或同時接觸可增加腫瘤的發(fā)生的一類化合物之前或同時接觸可增加腫瘤的發(fā)生的一類化合物。物。本身既不具引發(fā)作用，也不具促長作用，但可促進本身既不具引發(fā)作用，也不具促長作用，但可促進引發(fā)作用和增強促長作用，即促進或增強全部致引發(fā)作用和增強促長作用，即促進或增強全部致癌過程癌過程如：芘：苯并如：芘：苯并(a)(a)芘芘-皮膚腫瘤皮膚腫瘤 香煙霧中兒茶酚、其他

24、酚類香煙霧中兒茶酚、其他酚類-促長劑、助癌物促長劑、助癌物 第四節(jié)第四節(jié) 中藥致癌物的評定中藥致癌物的評定主要根據(jù)：主要根據(jù)：人群流行病學(xué)調(diào)查：人群流行病學(xué)調(diào)查：可信度取決于嚴密的設(shè)計，可信度取決于嚴密的設(shè)計， 研究過程受許多因素限制和干擾研究過程受許多因素限制和干擾動物試驗結(jié)果：動物試驗結(jié)果：花費大，周期長，花費大，周期長， 動物使用數(shù)量大動物使用數(shù)量大一般評定分析流程：一般評定分析流程：化學(xué)物構(gòu)效關(guān)系分析：化學(xué)物構(gòu)效關(guān)系分析：利用定量構(gòu)效關(guān)系利用定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)(QSAR)，從，從有害物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點來評估受試物潛在的致癌有害物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點來評估受試物潛在的致癌危險性危險性短

25、期試驗：短期試驗：致突變組合試驗、細胞惡性轉(zhuǎn)化試驗、致突變組合試驗、細胞惡性轉(zhuǎn)化試驗、 哺乳動物短期致癌試驗等哺乳動物短期致癌試驗等 進行初步篩查，若結(jié)果陽性再進行下一步試驗進行初步篩查，若結(jié)果陽性再進行下一步試驗哺乳動物長期致癌試驗：哺乳動物長期致癌試驗：經(jīng)典、標準致癌性檢測方法經(jīng)典、標準致癌性檢測方法一、短期試驗一、短期試驗 (一)致突變試驗優(yōu)點：優(yōu)點：方法簡單、快速、費用低、無需特殊檢測儀器方法簡單、快速、費用低、無需特殊檢測儀器缺點：缺點：需要組合試驗，無法檢出非遺傳毒性致癌物需要組合試驗，無法檢出非遺傳毒性致癌物 (陽性：遺傳毒性致癌物陽性：遺傳毒性致癌物or遺傳毒性非致癌物遺傳毒性

26、非致癌物 陰性：非遺傳毒性非致癌物陰性：非遺傳毒性非致癌物or非遺傳毒性致癌物非遺傳毒性致癌物)要求：要求：靈敏度靈敏度(sensitivity)-陽性符合率陽性符合率(呈陽性的比例呈陽性的比例) 特異性特異性(specificity)-陰性符合率陰性符合率(呈陰性的比例呈陰性的比例)基因突變試驗：基因突變試驗：鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變試驗鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變試驗(Ames(Ames試驗試驗) )、培養(yǎng)哺乳動物細胞、培養(yǎng)哺乳動物細胞TKTK或或HGPRTHGPRT正向正向突變試驗；突變試驗；染色體畸變試驗：染色體畸變試驗：體外細胞系細胞遺傳學(xué)試驗、體外細胞系細胞遺傳學(xué)試驗、小鼠骨髓微核試驗、大鼠骨

27、髓染色體畸變試驗；小鼠骨髓微核試驗、大鼠骨髓染色體畸變試驗；原發(fā)性原發(fā)性DNADNA損傷：損傷：DNADNA加合物、鏈斷裂、慧星試驗、加合物、鏈斷裂、慧星試驗、DNADNA修復(fù)誘導(dǎo)修復(fù)誘導(dǎo)( (細菌細菌SOSSOS反應(yīng)，大鼠肝反應(yīng)，大鼠肝UDSUDS誘導(dǎo)誘導(dǎo)) )、SCESCE試驗；試驗；體外細胞轉(zhuǎn)化：體外細胞轉(zhuǎn)化：敘利亞地鼠胚胎細胞敘利亞地鼠胚胎細胞(二二)細胞惡性轉(zhuǎn)化試驗細胞惡性轉(zhuǎn)化試驗(cell malignant transformation assay)概論：概論：外源因素對體外培養(yǎng)的細胞所誘發(fā)的惡性表外源因素對體外培養(yǎng)的細胞所誘發(fā)的惡性表型改變，包括細胞形態(tài)、細胞增殖速度、生長特型

28、改變，包括細胞形態(tài)、細胞增殖速度、生長特性、軟體畸變等變化，當細胞接種在裸鼠皮下可性、軟體畸變等變化，當細胞接種在裸鼠皮下可形成肉眼可見的腫瘤。形成肉眼可見的腫瘤。 即培養(yǎng)細胞在有害因素作用下發(fā)生一系列與腫即培養(yǎng)細胞在有害因素作用下發(fā)生一系列與腫瘤形成有關(guān)的細胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性的改變。瘤形成有關(guān)的細胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性的改變。 體外細胞轉(zhuǎn)化是一個多階段的過程，具有體內(nèi)體外細胞轉(zhuǎn)化是一個多階段的過程，具有體內(nèi)致癌過程的某些特點，最終產(chǎn)生在形態(tài)學(xué)、生長致癌過程的某些特點，最終產(chǎn)生在形態(tài)學(xué)、生長方式、生物化學(xué)上發(fā)生改變的細胞克隆。方式、生物化學(xué)上發(fā)生改變的細胞克隆。例：成纖維細胞體外轉(zhuǎn)化的表型改變

29、：例：成纖維細胞體外轉(zhuǎn)化的表型改變：在等基因宿主或裸鼠體內(nèi)形成腫瘤在等基因宿主或裸鼠體內(nèi)形成腫瘤；細胞估計壽命無限長細胞估計壽命無限長(永生化永生化)；核型改變；核型改變；細胞形態(tài)改變；細胞形態(tài)改變；生長雜亂生長雜亂；失去錨基依賴性生長特性，可在軟瓊脂中形成集落失去錨基依賴性生長特性，可在軟瓊脂中形成集落；能在低血清培養(yǎng)液生長；能在低血清培養(yǎng)液生長；丟失某些表面蛋白；丟失某些表面蛋白；具有纖維蛋白溶解活性；具有纖維蛋白溶解活性；表面微絨毛增加；表面微絨毛增加；- - - - - - - - - - - - -觀察終點：觀察終點：細胞惡變細胞惡變(遺傳學(xué)終點之一遺傳學(xué)終點之一)確定惡性轉(zhuǎn)化的可靠

30、指標：確定惡性轉(zhuǎn)化的可靠指標： 在敏感宿主中的成瘤性。通常是接種于免疫抑制動物在敏感宿主中的成瘤性。通常是接種于免疫抑制動物 半固體培養(yǎng)基中成雜亂生長、形成集落及細胞交叉重疊半固體培養(yǎng)基中成雜亂生長、形成集落及細胞交叉重疊常用細胞株常用細胞株(系系)： 金黃地鼠胚胎細胞金黃地鼠胚胎細胞(GHE)、敘利亞地鼠胚胎細胞、敘利亞地鼠胚胎細胞(SHE)、中國地鼠肺細胞中國地鼠肺細胞(CHL，V79)、BALBC-3T3發(fā)展趨勢：發(fā)展趨勢：動物原代細胞培養(yǎng)系統(tǒng)動物原代細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(SHE) 非整倍體細胞系非整倍體細胞系 人體上皮細胞人體上皮細胞(人類癌癥人類癌癥70%源于此源于此)細胞選擇的主要原則細胞

31、選擇的主要原則：體外容易培養(yǎng)和傳代，陰性細胞克隆背景較低；體外容易培養(yǎng)和傳代，陰性細胞克隆背景較低；細胞自發(fā)突變率低或自發(fā)轉(zhuǎn)化能力很弱，動物細胞自發(fā)突變率低或自發(fā)轉(zhuǎn)化能力很弱，動物裸鼠試驗呈陰性；裸鼠試驗呈陰性；已獲無限生長能力，但仍保持接觸抑制而無致已獲無限生長能力，但仍保持接觸抑制而無致瘤性的細胞系瘤性的細胞系( (如病毒感染的永生化細胞：大如病毒感染的永生化細胞：大鼠鼠RLV RERLV RE細胞和倉鼠細胞和倉鼠SA7SHESA7SHE細胞細胞) )；細胞惡性轉(zhuǎn)化試驗評價細胞惡性轉(zhuǎn)化試驗評價：1 1、體外轉(zhuǎn)化試驗的終點仍屬形態(tài)轉(zhuǎn)化或惡性前、體外轉(zhuǎn)化試驗的終點仍屬形態(tài)轉(zhuǎn)化或惡性前期轉(zhuǎn)化。此

32、種轉(zhuǎn)化可能發(fā)展為真正腫瘤，也可期轉(zhuǎn)化。此種轉(zhuǎn)化可能發(fā)展為真正腫瘤，也可能停滯在此階段，不進一步惡化。能停滯在此階段，不進一步惡化。因此陽性結(jié)因此陽性結(jié)果的解釋應(yīng)慎重，僅提示受試物有致癌可能性果的解釋應(yīng)慎重，僅提示受試物有致癌可能性。2 2、觀察終點是細胞惡變，因此既可篩查遺傳毒、觀察終點是細胞惡變，因此既可篩查遺傳毒性毒物，也可檢測非遺傳毒性毒物。性毒物，也可檢測非遺傳毒性毒物。3 3、體外試驗不能代替體內(nèi)試驗。、體外試驗不能代替體內(nèi)試驗。4 4、通常測試細胞中代謝酶活性低下，降低了系、通常測試細胞中代謝酶活性低下，降低了系統(tǒng)對統(tǒng)對間接致癌物間接致癌物的檢測敏感性。的檢測敏感性。( (三三)

33、)哺乳動物短期致癌試驗哺乳動物短期致癌試驗有限體內(nèi)致癌試驗有限體內(nèi)致癌試驗(limited carcinogenicity (limited carcinogenicity test)test)有限動物試驗有限動物試驗(limited (limited in vivoin vivo bioassay) bioassay) 時間有限時間有限( (數(shù)月數(shù)月) )，靶器官有限，靶器官有限原理：原理：某些受試物對某些特定組織的致瘤作用，某些受試物對某些特定組織的致瘤作用，比其它組織更為明顯。比其它組織更為明顯。( (觀察特點靶器官的腫瘤觀察特點靶器官的腫瘤發(fā)生情況發(fā)生情況) )觀察終點：觀察終點：不是

34、病理確認的惡性腫瘤，而是以癌不是病理確認的惡性腫瘤，而是以癌前病變?nèi)缦倭?、瘤性增生結(jié)節(jié)為主前病變?nèi)缦倭?、瘤性增生結(jié)節(jié)為主( (周期短周期短) )常用試驗：常用試驗：1 1、小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗、小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗 小鼠連續(xù)涂抹受試物，以觀察皮膚乳頭瘤和癌的發(fā)生，小鼠連續(xù)涂抹受試物，以觀察皮膚乳頭瘤和癌的發(fā)生，一般一般2020周。敏感小鼠為周。敏感小鼠為SENCARSENCAR小鼠。小鼠。 可用于檢測引發(fā)活性可用于檢測引發(fā)活性( (多環(huán)芳烴多環(huán)芳烴) )或促長活性或促長活性(TPA(TPA(佛波佛波醇酯醇酯) )2 2、小鼠肺瘤誘發(fā)試驗、小鼠肺瘤誘發(fā)試驗 染毒途徑常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，

35、一般染毒途徑常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般3030周，周，觀察肺腫瘤的發(fā)生。敏感小鼠為觀察肺腫瘤的發(fā)生。敏感小鼠為A A系小鼠。系小鼠。 可用于檢測引發(fā)活性可用于檢測引發(fā)活性( (烏拉坦烏拉坦) )或促長活性或促長活性(BHT(BHT(二丁二丁基羥基甲苯基羥基甲苯) )3 3、大鼠肝轉(zhuǎn)化灶誘發(fā)試驗、大鼠肝轉(zhuǎn)化灶誘發(fā)試驗 大鼠肝進行大部分切除后，給予受試物。一般大鼠肝進行大部分切除后，給予受試物。一般814814周，周，觀察肝轉(zhuǎn)化灶生成。肝轉(zhuǎn)化灶是癌前病變，有觀察肝轉(zhuǎn)化灶生成。肝轉(zhuǎn)化灶是癌前病變，有-谷氨酰谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶胺轉(zhuǎn)肽酶(-GT)(-GT)活性升高，活性升高，G6PG6P酶和酶和AT

36、PATP酶活性降低，酶活性降低，以及攝以及攝 鐵能力下降。典型引發(fā)劑為二乙基亞硝胺鐵能力下降。典型引發(fā)劑為二乙基亞硝胺(DEN)(DEN)。轉(zhuǎn)化灶可用組織化學(xué)或免疫化學(xué)方法鑒定。轉(zhuǎn)化灶可用組織化學(xué)或免疫化學(xué)方法鑒定。 可用于檢測引發(fā)活性可用于檢測引發(fā)活性( (二乙基亞硝胺二乙基亞硝胺DEN)DEN)或促長活或促長活性性( (苯巴比妥苯巴比妥PB)PB)4 4、雌性大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗、雌性大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗 一般可用一般可用SDSD大鼠大鼠( (或或Wistar)Wistar)，周期，周期6 6個月。個月。方法學(xué)評價：方法學(xué)評價：1 1、此四個試驗不是成組試驗，應(yīng)根據(jù)受試物特點、此四個試驗不是成

37、組試驗，應(yīng)根據(jù)受試物特點選擇使用；選擇使用；2 2、陽性結(jié)果與長期動物致癌試驗相似；、陽性結(jié)果與長期動物致癌試驗相似；3 3、由于僅觀察特定器官，試驗周期短，陰性結(jié)果、由于僅觀察特定器官，試驗周期短，陰性結(jié)果不能排除受試物致癌性；不能排除受試物致癌性；4 4、肝和肺是最常發(fā)生腫瘤的器官，也是眾多致癌、肝和肺是最常發(fā)生腫瘤的器官，也是眾多致癌物的靶器官，所以多數(shù)試驗選用小鼠肺腫瘤誘發(fā)物的靶器官，所以多數(shù)試驗選用小鼠肺腫瘤誘發(fā)試驗和大鼠肝轉(zhuǎn)化灶試驗。試驗和大鼠肝轉(zhuǎn)化灶試驗。( (四四) )轉(zhuǎn)基因動物致癌檢測模型轉(zhuǎn)基因動物致癌檢測模型優(yōu)點：優(yōu)點：研究致癌過程特定基因的作用；快速檢測研究致癌過程特定基

38、因的作用；快速檢測方法：方法：1、轉(zhuǎn)癌基因小鼠：提高動物對化學(xué)致癌物的敏感、轉(zhuǎn)癌基因小鼠：提高動物對化學(xué)致癌物的敏感度度2、腫瘤抑制基因敲除小鼠：、腫瘤抑制基因敲除小鼠：評價：評價：標準化等不完善標準化等不完善二、哺乳動物致癌試驗二、哺乳動物致癌試驗(long-term carcinogenicity study)鑒定化學(xué)致癌物的標準體內(nèi)試驗鑒定化學(xué)致癌物的標準體內(nèi)試驗試驗?zāi)康模涸囼災(zāi)康模捍_定受試物對試驗動物的致癌性、劑量確定受試物對試驗動物的致癌性、劑量- -反應(yīng)關(guān)系及誘發(fā)腫瘤的靶器官反應(yīng)關(guān)系及誘發(fā)腫瘤的靶器官需要進行致癌試驗的一般原則：需要進行致癌試驗的一般原則：1 1、人體可能長期暴露于

39、該化學(xué)物、人體可能長期暴露于該化學(xué)物2 2、該化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與已知致癌物相似、該化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與已知致癌物相似3 3、反復(fù)染毒毒性試驗提示該化學(xué)物可能產(chǎn)生癌前病變、反復(fù)染毒毒性試驗提示該化學(xué)物可能產(chǎn)生癌前病變ICHICH：需進行致癌性試驗的新藥：需進行致癌性試驗的新藥1 1、持續(xù)用藥、持續(xù)用藥6 6個月以上的藥品個月以上的藥品2 2、過去的數(shù)據(jù)顯示此類別的藥品可能致癌、過去的數(shù)據(jù)顯示此類別的藥品可能致癌3 3、藥品的作用機制推測可能有致癌性者、藥品的作用機制推測可能有致癌性者4 4、重復(fù)劑量毒性的試驗結(jié)果顯示有腫瘤生成現(xiàn)象的藥品、重復(fù)劑量毒性的試驗結(jié)果顯示有腫瘤生成

40、現(xiàn)象的藥品5 5、藥品的成分或其代謝產(chǎn)物長期停留在組織中，產(chǎn)生局部、藥品的成分或其代謝產(chǎn)物長期停留在組織中，產(chǎn)生局部的組織作用或病理生理反應(yīng)的組織作用或病理生理反應(yīng)6 6、基因毒性試驗結(jié)果顯示有致突變性等、基因毒性試驗結(jié)果顯示有致突變性等擬用于病人預(yù)期壽命少于擬用于病人預(yù)期壽命少于3 3年的藥品不必進行致癌試驗，如年的藥品不必進行致癌試驗，如腫瘤治療藥；若藥物或制劑只針對有限的特定疾病或患腫瘤治療藥；若藥物或制劑只針對有限的特定疾病或患者進行治療，療效確切、穩(wěn)定時，可視在藥物獲準上市者進行治療，療效確切、穩(wěn)定時，可視在藥物獲準上市后的需要進行致癌試驗后的需要進行致癌試驗ICHICH：致癌試驗基

41、本原則：致癌試驗基本原則( (新藥新藥) )基本程序：基本程序：一個長期嚙齒類致癌試驗，另一個進一步的體內(nèi)試驗一個長期嚙齒類致癌試驗，另一個進一步的體內(nèi)試驗( (補充長期試驗補充長期試驗不易得到的信息不易得到的信息) )1 1、選擇合適的物種根據(jù)：藥理、代謝、毒理、毒物動力學(xué)、給藥途徑等。、選擇合適的物種根據(jù)：藥理、代謝、毒理、毒物動力學(xué)、給藥途徑等。 缺乏明顯優(yōu)先證據(jù)時，推薦選擇大鼠缺乏明顯優(yōu)先證據(jù)時，推薦選擇大鼠 短期、長期、遺傳或其它資料表明對人致癌，通常不進行第二個試驗短期、長期、遺傳或其它資料表明對人致癌，通常不進行第二個試驗2 2、進一步的致癌性體內(nèi)試驗、進一步的致癌性體內(nèi)試驗 (

42、1)(1)短期或中期體內(nèi)嚙齒類試驗系統(tǒng)：引發(fā)短期或中期體內(nèi)嚙齒類試驗系統(tǒng)：引發(fā)- -促長模型，如大鼠肝轉(zhuǎn)化灶促長促長模型，如大鼠肝轉(zhuǎn)化灶促長試驗，多器官促長試驗試驗，多器官促長試驗( (用用5 5種引發(fā)劑后再染毒性數(shù)月種引發(fā)劑后再染毒性數(shù)月) )；轉(zhuǎn)基因小鼠試驗；轉(zhuǎn)基因小鼠試驗；新生嚙齒類致癌模型。新生嚙齒類致癌模型。 (2)(2)第二種嚙齒類長期致癌試驗第二種嚙齒類長期致癌試驗3 3、選擇中、短期致癌試驗的考慮：試驗方案的合理性、方案的優(yōu)缺點和分析、選擇中、短期致癌試驗的考慮：試驗方案的合理性、方案的優(yōu)缺點和分析4 4、機制研究：結(jié)果解釋和對人的危害性評價、機制研究：結(jié)果解釋和對人的危害性評

43、價5 5、致癌強度評價：腫瘤發(fā)生率、潛伏期、嚙齒類和人動力學(xué)比較及其它附加資、致癌強度評價：腫瘤發(fā)生率、潛伏期、嚙齒類和人動力學(xué)比較及其它附加資料料(一一)、試驗動物、試驗動物物種和品系：物種和品系：要求用兩種實驗動物，常規(guī)選用大要求用兩種實驗動物，常規(guī)選用大鼠和小鼠，也可用倉鼠。鼠和小鼠，也可用倉鼠。(嚙齒類因?qū)Χ鄶?shù)致癌物嚙齒類因?qū)Χ鄶?shù)致癌物易感性高，壽命相對較短，費用較低，生理和病理學(xué)資易感性高，壽命相對較短，費用較低，生理和病理學(xué)資料較完備，而廣泛使用。料較完備，而廣泛使用。) 選擇品系要求較敏感、自發(fā)腫瘤率低、生命選擇品系要求較敏感、自發(fā)腫瘤率低、生命力強及壽命較長的品系。力強及壽命較

44、長的品系。 美國美國NCI(National Cancer Institute)推薦：推薦：Fischer344大鼠和大鼠和B6C3F1小鼠小鼠性別：性別：同等數(shù)量的雌雄兩種性別動物，即雌雄各半同等數(shù)量的雌雄兩種性別動物，即雌雄各半年齡：年齡：剛離乳動物剛離乳動物(保證足夠長的染毒和發(fā)生癌癥時間，保證足夠長的染毒和發(fā)生癌癥時間，且幼年解毒及免疫系統(tǒng)未完善，對致癌作用敏感且幼年解毒及免疫系統(tǒng)未完善，對致癌作用敏感)數(shù)量：數(shù)量：滿足統(tǒng)計學(xué)分析的要求滿足統(tǒng)計學(xué)分析的要求 一般每組至少雌雄各一般每組至少雌雄各5050只，希望在出現(xiàn)第一只，希望在出現(xiàn)第一個腫瘤時，每組還有不少于個腫瘤時，每組還有不少于2

45、525只動物。只動物。 動物數(shù)量需求數(shù)與實驗動物腫瘤自發(fā)率、動物數(shù)量需求數(shù)與實驗動物腫瘤自發(fā)率、受試物誘發(fā)腫瘤發(fā)生率有關(guān)。受試物誘發(fā)腫瘤發(fā)生率有關(guān)。 如有兩種以上受試物同時試驗，可共如有兩種以上受試物同時試驗，可共用對照組，數(shù)量為雌雄各用對照組，數(shù)量為雌雄各5050受試物數(shù)受試物數(shù)(二二)劑量設(shè)置劑量設(shè)置一般原則：一般原則：設(shè)設(shè)3535個劑量組、陰性對照組，必要時設(shè)陽性對個劑量組、陰性對照組，必要時設(shè)陽性對照組，陽性致癌物最好與受試物結(jié)構(gòu)相近照組，陽性致癌物最好與受試物結(jié)構(gòu)相近高劑量組高劑量組：盡可能大，可引起輕微的毒性反應(yīng)，但不影響正：盡可能大，可引起輕微的毒性反應(yīng)，但不影響正常生長、發(fā)育和

46、生命。常生長、發(fā)育和生命。 美國美國NCINCI推薦以最大耐受量推薦以最大耐受量(MTD)(MTD)為高劑量，為高劑量，MTDMTD由由9090天天毒性試驗確定，此劑量應(yīng)使動物體重減輕不超過對照組的毒性試驗確定，此劑量應(yīng)使動物體重減輕不超過對照組的10%10%，并且不引起死亡及導(dǎo)致縮短壽命的中毒癥狀或病理，并且不引起死亡及導(dǎo)致縮短壽命的中毒癥狀或病理損傷。損傷。 ICH(1995)ICH(1995)：毒性終點；即毒性終點；即MTD；藥代動力學(xué)終點，嚙齒藥代動力學(xué)終點，嚙齒動物血漿動物血漿AUC為人的為人的25倍；倍；選擇吸收飽和劑量；選擇吸收飽和劑量；藥效學(xué)終點，藥效學(xué)終點，不應(yīng)產(chǎn)生生理學(xué)和內(nèi)

47、穩(wěn)態(tài)紊亂；不應(yīng)產(chǎn)生生理學(xué)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂；最大可行劑量，飼料中最高含量為最大可行劑量，飼料中最高含量為5%，限制劑量為，限制劑量為1500mgkg 天。天。中及低劑量組中及低劑量組：按等比級數(shù)下推，如分別為上：按等比級數(shù)下推，如分別為上一個劑量水平的一個劑量水平的1212或或1313。 低劑量組不產(chǎn)生任何毒性，但應(yīng)高于人的低劑量組不產(chǎn)生任何毒性，但應(yīng)高于人的接觸劑量，一般不低于高劑量的接觸劑量，一般不低于高劑量的10%10%。 中劑量組介于高、低劑量之間，如有可能中劑量組介于高、低劑量之間，如有可能按受試物的毒物代謝動力學(xué)性質(zhì)來確定。按受試物的毒物代謝動力學(xué)性質(zhì)來確定。(三三)染毒方式染毒方式原則

48、：原則：根據(jù)受試物理化性質(zhì)和接觸方式，盡可能模擬人根據(jù)受試物理化性質(zhì)和接觸方式，盡可能模擬人體可能暴露途徑，主要有經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入三種。體可能暴露途徑，主要有經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入三種。經(jīng)口染毒：經(jīng)口染毒：一般將受試物摻入飼料或飲水中連續(xù)給予一般將受試物摻入飼料或飲水中連續(xù)給予(57天天周周)。若摻入后適口性不良，可用灌胃法。摻。若摻入后適口性不良，可用灌胃法。摻入濃度要定期監(jiān)測，觀察均勻性和穩(wěn)定性，摻入濃度入濃度要定期監(jiān)測，觀察均勻性和穩(wěn)定性，摻入濃度一般不超過一般不超過5%。經(jīng)皮染毒：經(jīng)皮染毒：涂敷受試物的面積一般不少于動物體表總面涂敷受試物的面積一般不少于動物體表總面積的積的10%。必須保證良

49、好接觸，并防止動物舔食。每。必須保證良好接觸，并防止動物舔食。每天涂抹一次，每周天涂抹一次，每周37次。次。吸入染毒：吸入染毒：每天染毒每天染毒4小時，每周小時，每周57天。染毒柜內(nèi)受試天。染毒柜內(nèi)受試物濃度定期監(jiān)測，其分布應(yīng)均勻、恒定。物濃度定期監(jiān)測，其分布應(yīng)均勻、恒定。(四四)試驗期限試驗期限ICH(1995)ICH(1995)建議參考準則：建議參考準則：1 1、一般情況下，小鼠和倉鼠為、一般情況下，小鼠和倉鼠為1818個月，大鼠個月，大鼠2424個月；對個月；對于某些生命期較長或自發(fā)腫瘤率低的動物品系，小鼠和于某些生命期較長或自發(fā)腫瘤率低的動物品系，小鼠和倉鼠可持續(xù)倉鼠可持續(xù)2424個月

50、，大鼠個月，大鼠3030個月。個月。2 2、當最低劑量組或?qū)φ战M存活動物只有、當最低劑量組或?qū)φ战M存活動物只有25%25%時，也可結(jié)束時，也可結(jié)束試驗試驗; ;對于有明顯性別差異的試驗，結(jié)束時間對不同的性對于有明顯性別差異的試驗，結(jié)束時間對不同的性別應(yīng)有所不同別應(yīng)有所不同; ;在某些情況下因明顯的毒性作用，只造成在某些情況下因明顯的毒性作用，只造成高劑量組動物過早死亡，此時不應(yīng)結(jié)束試驗。高劑量組動物過早死亡，此時不應(yīng)結(jié)束試驗。3 3、合格的陰性對照試驗標準：因飼養(yǎng)或管理問題所造成、合格的陰性對照試驗標準：因飼養(yǎng)或管理問題所造成的動物損失在任何一組都不能高于的動物損失在任何一組都不能高于10%10%，小鼠和倉鼠在，小鼠和倉鼠在1818個月，大鼠在個月，大鼠在2424個月時各組存活的動物不少能于個月時各組存活的動物不少能于50%50%。(五五)觀察指標觀察指標1 1、一般觀察：每天觀察動物的一般狀況和毒性反應(yīng)，對死、一般觀察：每天觀察動物的一般狀況和毒性反應(yīng)，對死亡動物及時剖檢。試驗最初三個月每周稱體重一次，以亡動物及時剖檢。試驗最初三個月每周稱體重一次，以后每后每(2)4(2)4周稱體重一次。摻入飼料或飲水中染毒時，應(yīng)周稱體重一次。摻入飼料或飲水中染毒時，應(yīng)記錄食物消耗量或飲水量。記錄食物消耗量或飲水量。2 2、腫瘤發(fā)生情況：對每一肉眼可見及或觸及的腫瘤，均應(yīng)、腫瘤