GST標(biāo)簽的去除

1、GST 標(biāo)簽的去除可在目的蛋白的功能或結(jié)構(gòu)研究之前進(jìn)行。根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)不同，完全消化所需的蛋白酶量、溫度、及孵育長度也各異。含有 PreScission 蛋白酶、凝血酶或 Xa 因子識別位點(diǎn)的標(biāo)簽蛋白可在與 GlutathioneSepharose層析填料結(jié)合時切割，或者洗月后在溶液中切割。當(dāng) GST 蛋白與柱結(jié)合時，切割釋放了目的蛋白，它與結(jié)合緩沖液一起洗脫，而 GST 部分仍與填料結(jié)合。一般來說，柱上切割是推薦使用的方法，因?yàn)樵S多潛在的雜質(zhì)都能洗掉，目的蛋白在洗脫時具有更高的純度。如果需要優(yōu)化切割條件，建議洗脫后切割。從蛋白或肽段制備中去除絲氨酸蛋白酶如凝血酶、Xa 因子和 PreSc

2、ission 蛋白酶，可利用BenzamidineSepharose4FastFlow 來進(jìn)行，此填料有大包裝。為了方便，BenzamidineSepharose4FastFlow也有預(yù)填充的 HiTrapBenzamidineFF1ml 和 5ml 柱。凝血酶凝血酶能夠?qū)в锌山咏哪缸R別序列的融合蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異的切割，用于消化包含凝血酶識別序列的 pGEX 載體所制備的 GST 標(biāo)簽蛋白(pGEX-1 入 T、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2 及 pGEX-4T-3)。在 22C,1XPBS 中，一個單位的酶 16 小時可切割 100ag 待測

3、 GST 標(biāo)簽蛋白，切割效率在 90%以上。Xa 因子純化自牛血漿的 Xa 因子特異切割四肽 Ile-Glu-Gly-Arg 之后的蛋白，可用于消化包含此序列的 pGEX 載體所制備的 GST 標(biāo)簽蛋白(pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2 和 pGEX-5X-3)。在 22,1mMCaCl2、100mMNaCl 和 50mMTris-HCl(pH8.0)的反應(yīng)體系中，一個單位的酶 16 小時可切割 100ag 待測 GST 標(biāo)簽蛋白，切割效率在 90%以上。PreScission 蛋白酶PreScission 蛋白酶是一種遺傳改造的融合蛋白,由人鼻病毒 3C 蛋白酶和 GS

4、T 組成。這種蛋白酶是專為蛋白酶的去除而設(shè)計，能實(shí)現(xiàn)同時的蛋白酶固定和pGEX-6P-2 和 pGEX-6P-3）所產(chǎn)生的 GST 融合蛋白的切割。PreScission 蛋白酶特異切割 Glu和 Gly 殘基之間的識別序列 LeuGluValLeuPheGlnGlyPro。 蛋白酶在 4C 具有最大活性， 因此切割在低溫下進(jìn)行，改善了目的蛋白的穩(wěn)定性。在 5C,50mMTris-HCl、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMDTT（pH7.0）的反應(yīng)體系中，一個單位的酶 16 小時可切割 100 心 g 待測 GST標(biāo)簽蛋白，切割效率在 90%以上。GST 標(biāo)簽蛋白可通過親和層析，利用固

5、定在基質(zhì)上的谷胱甘肽從例如細(xì)菌裂解液中輕松純化。GST 與谷胱甘肽之間的高特異性確保了單個步驟就能獲得高純度。洗脫在溫和、非變性的條件下進(jìn)行，因此保留了蛋白的抗原性和功能。通用電氣醫(yī)療集團(tuán)現(xiàn)有多種親和純化產(chǎn)品。GlutathioneSepharose 填料（表 1）也有多種形式,從預(yù)填充的 MultiTrap?96 孔過濾板到預(yù)裝柱的 SpinTrap?、GraviTrap?、HiTrap?及HiPrep?柱，或?qū)嶒?yàn)室包裝（填料包裝的體積從 25ml 到 500ml）。不同的形式提供了從微克到克規(guī)模的樣品的純化選擇。表 1.GlutathioneSepharose 填料的特征pGEX-6P 載

6、體（pGEX-6P-1CharacteristicsGlutathioneSepharoseHighPerformanceGlutathioneSepharose4FastFlowGlutathioneSepharose4BMatrixHighiycross-linked,6%agaroseAverageparticle34pmsizeBindingcapacity110mgRecommended10mg10mg50-300cm/h5cn/bJ 生1 每毫升填料結(jié)合的重組谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶。GST 蛋白的結(jié)合取決于上樣樣品中蛋白的大小、構(gòu)象和濃度。GST 與谷胱甘肽的結(jié)合也是流速依賴的，低流速通

7、常會提高結(jié)合能力。這對于上樣過程很重要。蛋白性質(zhì)、pH 和溫度，以及使用過的填料也會影響結(jié)合能力。2 室溫下的水。儀器的選擇將取決于特定的純化。在利用微型離心柱時洗脫在臺式離心機(jī)中進(jìn)行，或利用重力流柱手動進(jìn)行，或利用蠕動泵或注射器再加上預(yù)填充的 GSTrap 柱進(jìn)行分步梯度洗脫。GSTMultiTrap96 孔板是為小體積的高通量篩選而設(shè)計的，每孔能純化多達(dá)500ggGST 標(biāo)簽蛋白。每根 GSTSpinTrap 柱能純化多達(dá) 500ag 蛋白。對于更大量的純化，預(yù)裝柱如 GSTGraviTrap、GSTrap 和 GSTPrep16/10 則提供了卓越的形式。GSTSpinTrap 柱GST

8、SpinTrap 柱非常適合放大之前的表達(dá)水平及純化條件的篩選。柱的設(shè)計可用于微型離心機(jī)。每根柱子含有 50 屋 GlutathioneSepharose4B,足夠純化最多 500 窺重組 GST。柱子在含有 0.05%Kathon?（一種抗菌的防腐劑）的 1XPBS 緩沖液中經(jīng)過了預(yù)平衡。每個包裝含有50 根柱子。隨機(jī)選擇大腸桿菌轉(zhuǎn)化物，這些轉(zhuǎn)化物中含有表達(dá)帶 GST 標(biāo)簽的人肌紅蛋白的 cDNA,之后表達(dá)，并用 GSTSpinTrap 柱進(jìn)行純化。人肌紅蛋白的 cDNA 與線性化的 pGEX-5X-1 連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 細(xì)胞。24 個隨機(jī)選擇的克隆接種到 3ml 培養(yǎng)基中，過

9、夜培養(yǎng)。用 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá) 2 小時。取每個培養(yǎng)物 1.5ml,通過反復(fù)凍融步驟制備裂解液，再上樣到 GSTSpinTrap 柱中。取每種還原型谷胱甘肽洗脫液的等份，上樣到 SDS 凝膠中，用于 SDS-PAGE 的分析（圖 1）。結(jié)果顯示，24 個轉(zhuǎn)化物中的 7 個表達(dá)了帶 GST 標(biāo)簽的肌紅蛋白MG123456789101112圖 1.篩選 24 個隨機(jī)選擇的含有表達(dá)帶 GST 標(biāo)簽的人肌紅蛋白的 cDNA 的大腸桿菌轉(zhuǎn)化物，將洗脫液進(jìn)行 SDS-PAGE 分析。M=LMW-SDSMarkerKit。1-24 泳道含有利用還原型谷胱甘肽從 GSTSpinTrap 柱上洗脫下來的產(chǎn)物。G

10、STGraviTrap 柱GSTGraviTrap 是方便的一次性柱子，其中預(yù)裝了 2mlGlutathioneSepharose4B,足夠純化最多 20mgGST 標(biāo)簽蛋白。每個包裝含有 10 根預(yù)裝柱，是由生物兼容的聚丙烯制造的。特殊的釉料保護(hù)填料在純化過程中不會變干。GSTGraviTrap 柱在送達(dá)時的包裝可便利地轉(zhuǎn)化成柱子支架(Workmate)。產(chǎn)品包裝中的塑料托盤可用于收集廢液。當(dāng)處理體積超過 10ml 時，將Labmate?PD-10BufferReservoir 與柱子連接，能將上樣量增加至大約 35ml。9700。6600045000-GST-myoglobin-GST20

11、10014400MG131415161718192021222324M970006600045000300。 。-GST-myoglobin-GST2010。GSTBulk 試劑盒GSTBulk 試劑盒含有 10ml 大包裝的 GlutathioneSepharose4B 和 5 根一次性的柱子。有了這個試劑盒，GST 標(biāo)簽蛋白可利用柱層析或分批法進(jìn)行純化。GSTBulk 試劑盒含有足夠的試劑，能純化最多 50mgGST 標(biāo)簽蛋白。GSTMultiTrap96 孔過濾板GSTMultiTrap96 孔過濾板目前有兩種選擇：GSTMultiTrapFF 和 GSTMultiTrap4B，分別預(yù)裝

12、了 GlutathioneSepharose4FastFlow 和 GlutathioneSepharose4B。兩種產(chǎn)品都能提供高重復(fù)性、高通量的篩選，從不澄清或澄清的樣品中小規(guī)?？焖偌兓?GST 標(biāo)簽蛋白。典型的應(yīng)用包括不同重組子的表達(dá)篩選，蛋白可溶性的篩選，以及小規(guī)模平行純化條件的優(yōu)化。利用 GSTMultiTrap 可直接從不澄清的細(xì)胞裂解液中純化最多 500ggGST 標(biāo)簽蛋白/孔，縮短了操作時間，將敏感目的蛋白的降解降至最低。96 孔板形式具有很大的靈活性，可與自動化的機(jī)器人系統(tǒng)共同使用，也可通過離心或抽真空手工操作?？着c孔之見、板與板之間的一致性能確保了高重復(fù)性。利用 GSTMu

13、ltiTrapFF 來設(shè)計緩沖液篩選研究，確定純化 GST-海馬鈣結(jié)合蛋白的最佳緩沖液條件。檢測的參數(shù)有緩沖液、pH、氯化鈉、甘油、DTT 和谷胱甘肽。同時還進(jìn)行了超聲破碎與市售細(xì)胞裂解試劑盒的使用效果比較。利用 MODDE?軟件（Umetrics）來進(jìn)行因子設(shè)計（實(shí)驗(yàn)設(shè)計）和統(tǒng)計分析。不同緩沖液條件和樣品制備方法隨機(jī)應(yīng)用到過濾板中。樣品、結(jié)合緩沖液或洗滌緩沖液中谷胱甘肽的存在顯著降低了純化的 GST-海馬鈣結(jié)合蛋白的產(chǎn)量，而緩沖液對產(chǎn)量無影響。低 pH 改善了產(chǎn)量，而 pH 和添加劑如 DTT、甘油或氯化鈉未顯著影響純度（圖2）。篩選結(jié)果表明，對于 GST-海馬鈣結(jié)合蛋白的純化，獲得最高產(chǎn)量

14、和純度的緩沖液條件是介于 10到 20mM 的磷酸鈉，140 至 ij400mM 的 NaCl,pH6.2-7.4。樣品制備可通過市售的細(xì)胞裂解試劑盒及超聲破碎來進(jìn)行，不會顯著影響純化結(jié)果1.LMVJSDS-MarkrKitI1?-0446-01-之.SttirtiTKJtenal3.Sonicotion.10mHP&S.10mMNaCl.pH7.4白.CslLytickit.10mMPSS.litOmMNoCI7.H5OlLytickjt10mMPBSA00mMNaCI2mMglutathiijny5%glysrolpH36.SonKotion,20mHPE&TOOmMNaC

15、l.5%g機(jī)電口|pH527.Sonwiotion20mMP65,00mMNQCI.3EMqlutothntpH68.Sontcotion.50mMTris-HCl.400mMNaCl.glycerolpH6.29.Sonkotion,50mMTris-HCl,pH610.Sonkation,50mMTrt5-HCl,1+0mHNaCl,2mMalutathk*nP5mMDTI.51qtycrolpH811.Sonkation,100mHTrbHCL140mMNad.5mHDTTpH&212SonkotiorvlOOmMTriHHd,270mHNod,11nMglutathione2.

16、5mb.T2.5%glycerol.pH7.4圖 2.將 GSTMultiTrapFF 過濾板的一些孔中收集而來的 GST-海馬鈣結(jié)合蛋白的洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE（還原條件，ExcelGel?SDSGradient8-18；考馬斯藍(lán)染色）。GST 緩沖液試劑盒GST 緩沖液試劑盒含有純化 GST 標(biāo)簽蛋白所使用的結(jié)合及洗脫緩沖液的儲備溶液。試劑盒省去了耗時的緩沖液制備，促進(jìn)了快速、便利且重現(xiàn)性好的純化工作。足夠的試劑可純化最多 20mgGST 標(biāo)簽蛋白。GST 緩沖液試劑盒含有 10XPBS,還原型谷胱甘肽、稀釋緩沖液和操作指南小冊子。蛋白純化的放大純化過程可輕松放大；Glutathio

17、neSepharose4FastFlow、GlutathioneSepharose4B 及GlutathioneSepharoseHighPerformance 都有更大的預(yù)裝柱，以及大包裝的填料。推薦增加第二步的凝膠過濾步驟，來精煉目的蛋白，去除可能的聚集物。97000660004500030000201001鋁0。GST-H7391011LanesGSTrap 親和柱是 1ml 和 5ml 的 HiTrap 預(yù)裝柱，能純化毫克級的 GST 標(biāo)簽蛋白。GSTrap 柱填充有三種不同的 GlutathioneSepharose 填料GSTrapFF、GSTrap4B 和 GSTrapHP。利用

18、注射器及提供的連接器，蠕動泵或液相色譜系統(tǒng)如？KTA?design,可進(jìn)行樣品上樣、洗滌和洗脫。GSTprepFF16/20 是預(yù)裝了 GlutathioneSepharose4FastFlow 的 20mlHiprep 柱，可用于毫克至克規(guī)模的 GST 標(biāo)簽蛋白的純化。來自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare)的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合系統(tǒng)是一種表達(dá)、純化和檢測大腸桿菌中所產(chǎn)生的 GST 標(biāo)簽蛋白的多功能系統(tǒng)。系統(tǒng)包括三個主要成分：pGEX質(zhì)粒表達(dá)載體、GST 純化的產(chǎn)品以及一系列 GST 檢測產(chǎn)品。一系列切割 GST 標(biāo)簽的位點(diǎn)特異蛋白酶則是該系統(tǒng)的補(bǔ)充。GST 親和標(biāo)簽實(shí)

19、現(xiàn)了溫和的純化過程，不會影響蛋白的天然結(jié)構(gòu)和功能。GST 基因融合系統(tǒng)的優(yōu)勢包括：?所有 pGEX 載體帶有 tac 啟動子，實(shí)現(xiàn)化學(xué)誘導(dǎo)的高水平表達(dá)?溫和、非變性的緩沖液成分，以分離活性蛋白?基于 GlutathioneSepharose?填料的親和層析產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)了從微克到克規(guī)模樣品的一步純化?方便的預(yù)裝柱形式適合單個樣品或平行篩選多個重組克隆?pGEX 載體上的 PreScission?蛋白酶、凝血酶或 Xa 因子識別位點(diǎn)能將目的蛋白從融合產(chǎn)物中切割下來?利用抗-GST 抗體輕松檢測融合蛋白在天然情況下，GST 以分子量 26,000 的蛋白存在，它在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物具有完全的酶活。經(jīng)過

20、鑒定，pGEX 載體的重組日本血吸蟲（Schistosomajaponicum）GST 的晶體結(jié)構(gòu)與天然蛋白一致。pGEX 質(zhì)粒載體將基因或基因片段與 GST 融合后，在細(xì)胞內(nèi)高水平誘導(dǎo)表達(dá)。重組蛋白很容易利用 GlutathioneSepharose 填料通過親和層析從比如大腸桿菌細(xì)胞裂解液中純化（圖 1）,要么是預(yù)裝柱，要么是分批純化。圖 1.GlutathioneSepharoseHighPerformance、GlutathioneSepharose4FastFlow 以及GlutahioneSepharose4B 目前都有大包裝填料，預(yù)裝柱以及多孔板，用于 GST 標(biāo)簽蛋白的純化。利

21、用位點(diǎn)特異的蛋白酶，可實(shí)現(xiàn)目的蛋白與 GST 的切割，此蛋白酶的識別位點(diǎn)位于 pGEX 載體上多克隆位點(diǎn)的上游。GST 標(biāo)簽的切除是在柱中進(jìn)行的，作為純化步驟或純化后離線的一部分。重組蛋白可利用 GST 檢測模塊中提供的免疫分析來檢測，或用抗-GST 抗體在 Westernblotting 中檢測，或通過比色分析來檢測。pGEX 載體通過將一個基因或基因片段插入某個 pGEX 載體的多克隆位點(diǎn)，可構(gòu)建出 GST 標(biāo)簽蛋白。載體提供了三種翻譯讀碼框，從 EcoRI 限制性酶切位點(diǎn)開始（詳見表 1）pGEX 載體是為基因或基因片段的高水平細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)而設(shè)計的。大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)生了標(biāo)簽蛋白，GS

22、T 部分在氨基端，目的蛋白在竣基端。目前有 13 個 pGEX 載體（詳見圖 2）;所有載體都有 tac 啟動子，用于高水平的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)，以及內(nèi)部的 laclq 基因，在任何大腸桿菌宿主中使用。pGEX-lXTThrombnILeuVolProArgGlySeeProGluPhlieVolThrAspCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGAAHCATCGTGACTGACTGACGABomHIEcoRIStopcodonsPGEX-2TThrombinlieuVolProArgGlySJpro3gHisArgAspCFGGnCCGCGTGGATCCCCGGGAAHCATCGTGACTGA

23、CTGACG一I$(nol%oRJPGEX-2TKThrombinKmoseleuVolProArgGlySrllArgArgAlaSrVdlCTGGTTCCGCGTGGATCTCGTCGTGCATCTGHGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGAJEcoRlStopco5onsPGEX-4T-1ThrombinILeuVolProArgGly$erIPTOGluPheProGlyArgLeuGluArg*oHtsArgAspCTGGTTCCGCGTGGATCCaGGAAHCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGACacnHIsmal) )S。11Notl

24、StopcodonspGEX-4T-2ThrombinkwVolProArgGlySrlp( (o38ProG&ThrAraAloAloAhCTGGTTCCGCGTGGATCCCCAGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGABomHIZcoftl5mq；SolxhoNtlStopcodonpGEX-AT-3ThrocnbnllwVolProArgGlySrlftoA$nSrArgVolAspSerSrGlyArgIto7olThrAspCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGMTTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCAKGTGACTGACTG6

25、omHI蕊疝1-Smo1so福 廠NodStopcodonsPGEX-3XFoctorXohieGluGlyArJ*GlyHeProGlyA$nSfSaATCGAAGGTCGTGgGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGAC嬴HI1端。用cvcodonTPGEX-5X-1FuelsXQIIkGuGl/Argl*GlykProGluPh*fro3ArgGluArgProH$ArgAspATCGMGGTCGTGGGATCCCCGAAHCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGAEnHIJ對而i而TStopcodonsPGEX-5X-2FactorXoIHe

26、GluGyArglGly必ProGlUeProGl/SerIhrArgAloAloAlo$rATCGAAGGTCGTGfiGATCCfC.GGA”CCC空飛叼C%GCGGCC(yATCGTGA,eamHI15mol荷，hot0tlStopTodonPGEX-5X-3FactorXoIII。GuGArgrGlySProArgA$nS3A( (9VolAspSr$rGlyZU9VolThrAspATCGAAGGTCGTGGGATCCCCAGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCaATCGTGACTGACTGABomHI20RI十；0尸$01Notl_*-ItopcodonTpGEX-

27、6P-lPre$ci$sonProtosleuGluVolLeuFheGlnGlyProLeuGlySerProGluFheFToGlyArgleGluArgProHisCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCCGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCAT11( ( -1) )JBom網(wǎng)EcoRI初一SH-NotlPGEX-6P-2PrSci$knProtectluGluVolSuPheGh，GlyFroIQUGlySaProGlylieProGlySecThrAraAloAloAloSerCTGGAGTTCTGHCCAGGGGCCCCTGGdATCCCCAGGAAHCCCGGGTCGACTCGGCGGCCGCATCGLJJ l。二二“iBamHIEcoM餉Not1PGEX-6P-3PreScissonProteoseLeuGluVolleuFtwGlnGlyProUuGlySfProA$nS4rArgVolAspSaSrGlyArgCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCCGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGC11117,在JJIBamHICcoRI5molSoilNod圖 2.谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶融合載體的圖譜，顯示出讀碼框和主要特征。所有 13 個載體在三種讀碼框