醫(yī)學(xué)專題—參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)課件VIP

1、醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)參與DNA復(fù)制(fzh)有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第一頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 現(xiàn)在已經(jīng)知道約現(xiàn)在已經(jīng)知道約20多種蛋白質(zhì)參與復(fù)制多種蛋白質(zhì)參與復(fù)制(fzh)。1聚合酶聚合酶2解解 鏈、鏈、 解解 旋旋 酶酶 類類3引發(fā)酶引發(fā)酶4連接酶連接酶 下表是與大腸桿菌復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)。下表是與大腸桿菌復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)。第二頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)名稱蛋白質(zhì)名稱分子量分子量103U亞基數(shù)亞基數(shù) 功功 能能每個菌中的每個菌中的分子數(shù)分子數(shù)毫克蛋白質(zhì)毫克蛋白質(zhì)公斤細(xì)胞（濕重）公斤細(xì)胞（濕重）SSBi蛋白蛋白n蛋白蛋

2、白n 蛋白蛋白n蛋白蛋白dnaCdnaB引發(fā)酶引發(fā)酶 74 80 25 75 11 29300 6044111161與單鏈結(jié)合與單鏈結(jié)合預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)部位識別部位識別,ATPase預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)移動啟動子移動啟動子,ATPase引發(fā)合成引發(fā)合成300 50 30 70 -100 20 50 20 0.5 0.3 0.3 0.2表表 與大腸桿菌復(fù)制與大腸桿菌復(fù)制(fzh)有關(guān)的蛋白質(zhì)有關(guān)的蛋白質(zhì)接下頁接下頁BACK第三頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)名稱蛋白質(zhì)名稱分子量分子量103U亞基數(shù)亞基數(shù) 功功 能能每個菌中的分子每個菌中的分子數(shù)數(shù)毫克蛋白質(zhì)

3、毫克蛋白質(zhì)公斤細(xì)胞（濕重）公斤細(xì)胞（濕重）Pol 全酶全酶 140 25 10 37 52 32 831121211鏈的延長鏈的延長30020 0.5Pol 1091填補缺口和切去引填補缺口和切去引物物30010連接酶連接酶 741連接連接30010拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 400 210 190422引進(jìn)超螺旋引進(jìn)超螺旋_25025rep 蛋白蛋白 解鏈酶解鏈酶dnaA 65 75 4811解開雙鏈解開雙鏈復(fù)制起始復(fù)制起始5050002000.6Rep蛋白蛋白(dnbi)是一種大腸桿菌解鏈酶是一種大腸桿菌解鏈酶第四頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 1 DNA聚合酶聚合酶 D

4、NA聚合酶聚合酶是指以脫氧核苷三磷酸作為是指以脫氧核苷三磷酸作為(zuwi)底物催化合成底物催化合成DNA的一類酶。的一類酶。 全稱全稱(qun chn)： DNA依賴的依賴的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡稱：簡稱：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸核酸(h sun)外切酶活性外切酶活性第五頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 所有所有DNA聚合酶的作用方式根本相似。它們催化聚合酶的作用方式根本相似。它們催化(cu hu)脫氧核苷三磷酸加到復(fù)制中的脫氧核苷三磷酸加到復(fù)制中的DNA鏈的鏈的3羥

5、基末端，合成羥基末端，合成方向從方向從53，由模板決定加上何種脫氧核苷酸。，由模板決定加上何種脫氧核苷酸。 第六頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切外切(wi qi)酶活性酶活性 5 3 外切外切(wi qi)酶活性酶活性?能切除突變能切除突變(tbin)的的 DNA片段和片段和RNA引物。引物。能識別錯配的堿基對，并將其水解。能識別錯配的堿基對，并將其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目

6、錄錄第七頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第八頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)DNADNA聚合酶的分類聚合酶的分類(fn (fn li)li)DNA-pol 主要主要(zhyo)的修復(fù)酶的修復(fù)酶DNA-pol 次要的修復(fù)酶次要的修復(fù)酶DNA-pol 復(fù)制酶復(fù)制酶DNA-pol IV SOS修復(fù)修復(fù)DNA-pol V SOS修復(fù)修復(fù)原核原核(yun h)生物的聚合酶生物的聚合酶第九頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) (1) 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I (Pol ) 純的純的DNA聚合酶聚合酶I由分子量由分子量109 000U

7、 (109KD)，含，含928個氨基酸殘基的一條肽鏈構(gòu)成，每個大腸個氨基酸殘基的一條肽鏈構(gòu)成，每個大腸桿菌細(xì)胞桿菌細(xì)胞(xbo)中大約含中大約含400個酶分子。個酶分子。(單鏈多肽單鏈多肽 功能功能：對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙出現(xiàn)的空隙(kngx)(kngx)進(jìn)行填補。進(jìn)行填補。第十頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)323個氨基酸個氨基酸小片段小片段(pin dun)34KD5 核酸核酸(h sun)外切酶活性外切酶活性大片大片(d pin)段段/Klenow 片段片段 76KD604個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活

8、性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端枯草桿菌蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶胰蛋白酶DNA-pol 第十一頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)DNA聚合酶聚合酶的的多種活性。多種活性。 53聚合活性：聚合活性： 在模板在模板(mbn)指導(dǎo)下，以脫氧核苷三磷酸為底物在引物指導(dǎo)下，以脫氧核苷三磷酸為底物在引物3-OH末端加上脫氧核苷酸末端加上脫氧核苷酸。每個酶。每個酶分子每分鐘添加分子每分鐘添加1 000個單核苷酸。個單核苷酸。 聚合酶催化的聚合酶催化的DNA的合成需要以下條件：的合成需要以下條件： 模板模板 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 必須有一必須有

9、一 3-OH末端的引物，且此引物必須與模板正確形成氫鍵末端的引物，且此引物必須與模板正確形成氫鍵 合成從合成從53方向進(jìn)行，如圖方向進(jìn)行，如圖7-8和圖和圖7-9所示所示第十二頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第十三頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 35外切外切(wi qi)酶活性：酶活性： 沒有脫氧核苷三磷酸底物時，沒有脫氧核苷三磷酸底物時， DNA聚合酶聚合酶 I 能從能從3-OH開始以開始以35方方向水解向水解DNA，產(chǎn)生，產(chǎn)生5-單核苷酸。單核苷酸。 實際上實際上DNA復(fù)制時，加上去的脫氧核苷酸不一定每次都正確，錯誤的復(fù)制時，加上去的脫氧核苷酸

10、不一定每次都正確，錯誤的時機(jī)不少，有時甚至加上一個不與模板配對的核苷酸，當(dāng)時機(jī)不少，有時甚至加上一個不與模板配對的核苷酸，當(dāng)3-OH末端的堿基末端的堿基不與模板配對時聚合酶就無聚合活性，此時它具有的不與模板配對時聚合酶就無聚合活性，此時它具有的35外切酶活性可以外切酶活性可以切除這個不配對的核苷酸，這一堿基切除后，外切核酸酶活性終止，聚合酶切除這個不配對的核苷酸，這一堿基切除后，外切核酸酶活性終止，聚合酶活性恢復(fù)，如圖活性恢復(fù)，如圖7-10所示。所以聚合酶的所示。所以聚合酶的35外切酶活性也叫修補活性。外切酶活性也叫修補活性。 第十四頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第十五

11、頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 53外切外切(wi qi)酶活性：酶活性： DNA聚合酶聚合酶I具有具有53外切酶活性。外切酶活性。 如圖如圖7-11，其特點是：，其特點是： 只能在只能在5-P末端一個接一個地切除核苷酸；末端一個接一個地切除核苷酸； 能連續(xù)地切除多個核苷酸；能連續(xù)地切除多個核苷酸； 只切除配對的只切除配對的5-P末端核苷酸，不切除不配對的單鏈末端核苷酸，不切除不配對的單鏈5-P末端末端核苷酸；核苷酸； 既能切除脫氧核苷酸也能切除核苷酸；既能切除脫氧核苷酸也能切除核苷酸； 對只具有對只具有5-P末端的切口也有活性由于在末端的切口也有活性由于在DNA復(fù)制過

12、程中復(fù)制過程中一般情況下只在一般情況下只在RNA引物處才有缺口，因此引物處才有缺口，因此53外切酶活性的主要外切酶活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物。功能是切除核糖核苷酸引物。 第十六頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第十七頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 切口翻譯切口翻譯(nicktranslation) DNA聚合酶聚合酶 I 的的53外切酶活性和聚合活性同時外切酶活性和聚合活性同時(tngsh)作用可以進(jìn)作用可以進(jìn)行切口翻譯行切口翻譯(nicktranslation)，用來制造放射性探針。，用來制造放射性探針。 在反響物里參加同位素標(biāo)記的脫氧單核

13、苷酸，在反響物里參加同位素標(biāo)記的脫氧單核苷酸，DNA聚合酶聚合酶I 首先利用首先利用53外切酶活性，從切口處逐個切下外切酶活性，從切口處逐個切下DNA上的核苷酸，再利用上的核苷酸，再利用3-OH末端末端聚合作用逐個將標(biāo)記的核苷酸加上去聚合作用逐個將標(biāo)記的核苷酸加上去(圖圖712)。第十八頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)5353第十九頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 內(nèi)切酶活性：內(nèi)切酶活性：DNA聚合酶聚合酶 I 也具有也具有53 內(nèi)切酶活性，如圖內(nèi)切酶活性，如圖7-13所示。在兩個堿基之間切開產(chǎn)生所示。在兩個堿基之間切開產(chǎn)生一個具有一個具有5-P 末

14、端的末端的不配對堿基的片段不配對堿基的片段。 很多實驗證明很多實驗證明(zhngmng)DNA聚合酶聚合酶 I 在大腸桿菌復(fù)制中不是主要的合成酶，而是在大腸桿菌復(fù)制中不是主要的合成酶，而是在除在除去去RNA引物和損傷修復(fù)中起重要作用。引物和損傷修復(fù)中起重要作用。第二十頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)不配對不配對(pi du)的的片段片段內(nèi)切酶活性內(nèi)切酶活性第二十一頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 2 大腸桿菌大腸桿菌 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶缺陷的突變株仍能生存，這說明缺陷的突變株仍能生存，這說明DNApol不是不是DNA復(fù)制的主要復(fù)制

15、的主要(zhyo)聚合酶。人們開始尋找另外的聚合酶。人們開始尋找另外的DNA聚合酶，并于聚合酶，并于1970年發(fā)現(xiàn)了年發(fā)現(xiàn)了DNApol。 從從53方向合成方向合成DNA 具有具有35外切酶活性，但沒有外切酶活性，但沒有53外切酶活性。外切酶活性。 在體外的合成速率比體內(nèi)的速率要低得多，帶有這個酶缺陷的大腸桿菌突變株染在體外的合成速率比體內(nèi)的速率要低得多，帶有這個酶缺陷的大腸桿菌突變株染色體的復(fù)制各方面都正常，它在體內(nèi)的功能可能和色體的復(fù)制各方面都正常，它在體內(nèi)的功能可能和DNA聚合酶聚合酶 I 類似。類似。 第二十二頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) (3) 大腸桿菌大腸

16、桿菌DNA聚合酶聚合酶 聚合酶聚合酶是體內(nèi)是體內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶復(fù)制所必需的酶 帶有帶有DNA聚合酶聚合酶 的溫度敏感突變的溫度敏感突變 (polc) 的大腸桿菌在限制的大腸桿菌在限制溫度下是不能存活的，從這種菌株得到的裂解液也不能合成溫度下是不能存活的，從這種菌株得到的裂解液也不能合成DNA，當(dāng)參加正常細(xì)菌的，當(dāng)參加正常細(xì)菌的DNA 聚合酶聚合酶 時可以恢復(fù)它的聚合能力，因時可以恢復(fù)它的聚合能力，因此不同于此不同于DNA聚合酶聚合酶I和和，聚合酶，聚合酶是體內(nèi)是體內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶復(fù)制所必需的酶。 DNA多聚酶多聚酶相當(dāng)復(fù)雜相當(dāng)復(fù)雜(fz)，其結(jié)構(gòu)和各亞基的功能如圖，其結(jié)構(gòu)和各亞基的

17、功能如圖1124，25所示。所示。 DNA pol 具有具有53聚合功能。聚合功能。 第二十三頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)DNA聚合酶聚合酶 的的 “核心酶由核心酶由、三種亞基三種亞基組成。組成。 亞基具有亞基具有(jyu)合成合成DNA的能力。的能力。 亞基具有亞基具有35外切酶的功能，起到校正的外切酶的功能，起到校正的作用。作用。 亞基可能在組裝中發(fā)揮功能。亞基可能在組裝中發(fā)揮功能。亞基加到核心酶上使其二聚化亞基加到核心酶上使其二聚化，進(jìn)一步產(chǎn)生，進(jìn)一步產(chǎn)生pol III。復(fù)合體參加到復(fù)合體參加到pol ，進(jìn)一，進(jìn)一步形成步形成(xngchng) pol 復(fù)復(fù)合體

18、。合體。 復(fù)合體是由復(fù)合體是由，和和亞基組成，其作用是固定亞基組成，其作用是固定亞基這個亞基這個“夾子的支架。夾子的支架。亞基亞基：形成夾鉗，保持催化：形成夾鉗，保持催化核心和模板鏈的結(jié)合核心和模板鏈的結(jié)合第二十四頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 聚合酶聚合酶的活性的活性 聚合活性：聚合活性： DNA復(fù)制時聚合酶復(fù)制時聚合酶 全酶十分重要，它可以在全酶十分重要，它可以在DNA模板上的引物的模板上的引物的3-OH上以每分鐘約上以每分鐘約50 000核苷酸的速率逐個延伸新核苷酸的速率逐個延伸新生的生的DNA。 35和和53的外切酶活性：的外切酶活性： pol 的的53外切酶活

19、性與外切酶活性與pol的不同，的不同，pol 的的53外切酶外切酶活性只對活性只對 單鏈單鏈 DNA有作用有作用(zuyng)，因此不能用于缺口翻譯。，因此不能用于缺口翻譯。DNA聚合酶聚合酶的作用范圍如圖的作用范圍如圖7-14所示。所示。 第二十五頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第二十六頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)催化催化DNA聚合聚合參與參與DNA損傷損傷的應(yīng)急狀態(tài)修的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)復(fù)修復(fù)合成、修復(fù)合成、切除引物、切除引物、填補空隙填補空隙功能功能2040400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞1011亞基數(shù)亞基數(shù)+-+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切

20、酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶第二十七頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) (4) 真核生物中的真核生物中的DNA聚合酶聚合酶 所有真核生物中的聚合酶的性質(zhì)根本上同大腸桿菌中的聚所有真核生物中的聚合酶的性質(zhì)根本上同大腸桿菌中的聚合酶相似，它的活性有賴于模板，帶合酶相似，它的活性有賴于模板，帶3-OH的引物，四種脫氧核的引物，四種脫氧核糖核苷磷酸。糖核苷磷酸。 目前發(fā)現(xiàn)的真核生物目前發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有聚合酶有 。 DNA聚合酶聚合酶： 在迅速增殖的細(xì)胞在迅速增殖的細(xì)胞(xbo)中活

21、力較高。酶中活力較高。酶分子量在分子量在165,000一一175,000U之間。最適宜的底物是帶缺口的雙之間。最適宜的底物是帶缺口的雙鏈鏈DNA，但是帶引物的變性，但是帶引物的變性DNA也是很好的底物。是真核生物也是很好的底物。是真核生物的復(fù)制酶。的復(fù)制酶。 它同大腸桿菌它同大腸桿菌DNA聚合酶最大不同之處在于不具外切酶活聚合酶最大不同之處在于不具外切酶活性。性。 第二十八頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) DNA聚合酶聚合酶(損傷修復(fù)損傷修復(fù))：為分子量較?。簽榉肿恿枯^小(43,000U)的聚合酶。在整個細(xì)胞周期中它的聚合酶。在整個細(xì)胞周期中它的活力沒有變化，它利用的活力

22、沒有變化，它利用Dnase I 處理處理(chl)過的天然過的天然DNA作模板，對變性作模板，對變性DNA幾乎沒幾乎沒有活性，不具外切酶的活性。有活性，不具外切酶的活性。 DNA聚合酶聚合酶線粒體：是一個大分子酶，在細(xì)胞內(nèi)含量很低，因此不容易純化線粒體：是一個大分子酶，在細(xì)胞內(nèi)含量很低，因此不容易純化。這個酶可以使用帶缺口的。這個酶可以使用帶缺口的DNA作底物，但以多聚作底物，但以多聚(A)、寡聚、寡聚(dT)8-10作為底物，酶活力作為底物，酶活力更高。更高。 DNA聚合酶聚合酶負(fù)責(zé)線粒體負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制。的復(fù)制。 DNA聚合酶聚合酶和和DNA聚合酶聚合酶主要復(fù)制酶主要復(fù)制酶: 是真核

23、生物的復(fù)制酶，主要根據(jù)是聚是真核生物的復(fù)制酶，主要根據(jù)是聚合酶合酶的活性隨細(xì)胞周期而變化。的活性隨細(xì)胞周期而變化。 DNA聚合酶聚合酶：功能不詳。：功能不詳。第二十九頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 2 DNA連接酶連接酶 DNA Ligase DNA連接酶催化一個連接酶催化一個DNA鏈的鏈的5磷酸根與另一磷酸根與另一DNA鏈的鏈的3羥基形成磷羥基形成磷酸二酯鍵。酸二酯鍵。 但兩個鏈都必須與同一另外的鏈互補結(jié)合，而且兩鏈必須相鄰，即只但兩個鏈都必須與同一另外的鏈互補結(jié)合，而且兩鏈必須相鄰，即只能能(zh nn)連接一個切口連接一個切口(nick)而不能連接一個豁口而不能連

24、接一個豁口(gap)(喪失核苷酸喪失核苷酸)，如，如圖圖7-15所示。所示。例子：例子：T4誘導(dǎo)的連接酶不僅能在模板上連接誘導(dǎo)的連接酶不僅能在模板上連接DNA和和DNA之間的切口，也能之間的切口，也能連接連接RNA和和RNA之間的切口，不僅能連接之間的切口，不僅能連接DNA中的單鏈切口或雙鏈的粘性中的單鏈切口或雙鏈的粘性末端，而且能連接平頭雙鏈末端，而且能連接平頭雙鏈DNA 。大腸桿菌連接酶那么不行。大腸桿菌連接酶那么不行。 第三十頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第三十一頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)3 與解鏈有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)與解鏈有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)

25、 DNA是雙螺旋，在復(fù)制中雙螺旋要解開，雙螺旋的解開使是雙螺旋，在復(fù)制中雙螺旋要解開，雙螺旋的解開使得復(fù)制叉前面產(chǎn)生正超螺旋，如果這些應(yīng)力不以某種方式釋放將得復(fù)制叉前面產(chǎn)生正超螺旋，如果這些應(yīng)力不以某種方式釋放將阻礙復(fù)制叉前進(jìn)。阻礙復(fù)制叉前進(jìn)。 現(xiàn)在已找到一些酶和蛋白質(zhì)，它們或者能使現(xiàn)在已找到一些酶和蛋白質(zhì)，它們或者能使DNA雙鏈變得易雙鏈變得易于解開，或者可以使超螺旋分子松弛，以下于解開，或者可以使超螺旋分子松弛，以下(yxi)介紹一些這類介紹一些這類蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。 第三十二頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) (1) 單鏈結(jié)合單鏈結(jié)合(jih)蛋白蛋白 (SSB蛋白蛋白

26、) SSB蛋白：是缺乏酶活性的復(fù)制輔助蛋白，可以在遠(yuǎn)低于蛋白：是缺乏酶活性的復(fù)制輔助蛋白，可以在遠(yuǎn)低于Tm的溫度下使雙鏈的溫度下使雙鏈DNA拆開，并牢牢地結(jié)合在單鏈拆開，并牢牢地結(jié)合在單鏈DNA上，穩(wěn)上，穩(wěn)定單鏈區(qū)域的蛋白質(zhì)。定單鏈區(qū)域的蛋白質(zhì)。 SSB保護(hù)復(fù)制中的保護(hù)復(fù)制中的DNA單鏈局部不被單鏈局部不被核酸酶降解核酸酶降解 首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)許多種生物中都有這類蛋首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)許多種生物中都有這類蛋白質(zhì)。在文獻(xiàn)中，這類蛋白曾用過多種名稱：解旋蛋白白質(zhì)。在文獻(xiàn)中，這類蛋白曾用過多種名稱：解旋蛋白(unwindingproteill)，熔化蛋白，熔化蛋白(mel2i

27、ngprptein)，螺旋降穩(wěn)蛋白，螺旋降穩(wěn)蛋白(helixdestabizingprotein)。 第三十三頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) (2) 解鏈酶解鏈酶DNA解旋酶；解旋酶；DNA helicases 解鏈酶解鏈酶(解螺旋酶解螺旋酶)：是一類能通過水解：是一類能通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈獲得能量來解開雙鏈DNA的的酶稱為酶稱為DNA解鏈酶。解鏈酶。 解鏈酶依賴于單鏈解鏈酶依賴于單鏈DNA 的存在的存在 分解分解ATP獲得能量獲得能量 具引發(fā)酶的功能合成小片段的具引發(fā)酶的功能合成小片段的RNA作為后隨鏈的引物作為后隨鏈的引物 如果雙鏈如果雙鏈DNA中有單鏈

28、末端中有單鏈末端(m dun)或缺口，那么或缺口，那么DNA解鏈酶可以首先結(jié)解鏈酶可以首先結(jié)合在這一局部，然后逐步向雙鏈方向移動，復(fù)制時大局部合在這一局部，然后逐步向雙鏈方向移動，復(fù)制時大局部DNA解鏈酶可以沿解鏈酶可以沿著后隨鏈模板的著后隨鏈模板的53方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動，只有方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動，只有rep蛋白一種大蛋白一種大腸桿菌解鏈酶是沿前導(dǎo)鏈模板的腸桿菌解鏈酶是沿前導(dǎo)鏈模板的35方向移動。因此在復(fù)制時方向移動。因此在復(fù)制時rep蛋白和蛋白和某某DNA解鏈酶分別在解鏈酶分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用以解開雙鏈的兩條母鏈上協(xié)同作用以解開雙鏈DNA圖圖7-16 第三十四頁，共

29、五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第三十五頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第三十六頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) (3) 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase)： 是催化是催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體拓?fù)洚悩?gòu)體(Topoisomer)相互轉(zhuǎn)換的一相互轉(zhuǎn)換的一類酶。類酶。 拓?fù)洚悩?gòu)酶能與拓?fù)洚悩?gòu)酶能與DNA形成共價結(jié)合的形成共價結(jié)合的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-DNA中間體中間體，從而在其骨架的磷酸二酯鍵處造成暫時性裂口，使，從而在其骨架的磷酸二酯鍵處造成暫時性裂口，使DNA的多核苷酸鏈得以穿越，從而改變的多核苷酸鏈得以穿越，從而改變DNA分子的

30、拓?fù)浞肿拥耐負(fù)錉顟B(tài)。狀態(tài)。 根據(jù)酶作用的機(jī)理及其介導(dǎo)一條根據(jù)酶作用的機(jī)理及其介導(dǎo)一條(y tio)鏈還是二條鏈的斷鏈還是二條鏈的斷裂，拓?fù)洚悩?gòu)酶可分為裂，拓?fù)洚悩?gòu)酶可分為型型和和型型。第三十七頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 型型拓?fù)洚悩?gòu)酶的共同特點是：拓?fù)洚悩?gòu)酶的共同特點是： 僅切斷雙鏈僅切斷雙鏈DNA中的一條鏈，即催化瞬時的單鏈斷中的一條鏈，即催化瞬時的單鏈斷裂裂(dun li)和連接。和連接。 不需要能量輔助因子，如不需要能量輔助因子，如ATP和和NAD等，因此不能催等，因此不能催化需能的超螺旋化結(jié)構(gòu)?；枘艿某菪Y(jié)構(gòu)。型型拓?fù)洚悩?gòu)酶一般都拓?fù)洚悩?gòu)酶一般都使高度

31、使高度超螺旋的超螺旋的DNA松弛松弛。 型型拓?fù)洚悩?gòu)酶的共同特點是：拓?fù)洚悩?gòu)酶的共同特點是： 同時切斷、縫合同時切斷、縫合DNA的兩條鏈。的兩條鏈。 需要能量輔助因子，可以作用于任何相交的兩對雙鏈需要能量輔助因子，可以作用于任何相交的兩對雙鏈DNA。第三十八頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 大腸桿菌大腸桿菌(d chn n jn)拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶I屬于屬于型酶型酶 概述：拓?fù)洚悩?gòu)酶概述：拓?fù)洚悩?gòu)酶 (E. coli)催化負(fù)超螺旋催化負(fù)超螺旋DNA的松弛。的松弛。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶也參與也參與DNA的打結(jié)和解結(jié)。的打結(jié)和解結(jié)。 將兩個互補的單鏈將兩個互補的單鏈DNA

32、環(huán)耦合為雙鏈環(huán)耦合為雙鏈DNA環(huán)。環(huán)。 完整的全酶是一分子量完整的全酶是一分子量97 kDa的蛋白。的蛋白。第三十九頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 的特點是：的特點是： 僅切斷雙鏈僅切斷雙鏈DNA中的單鏈并催化瞬時的單鏈斷裂和連中的單鏈并催化瞬時的單鏈斷裂和連接。接。 由于反響的產(chǎn)物還是閉環(huán)由于反響的產(chǎn)物還是閉環(huán)DNA，因此，酶反響機(jī)制是先，因此，酶反響機(jī)制是先切開雙鏈切開雙鏈DNA中的一條鏈，使切開鏈的末端沿螺旋的方向轉(zhuǎn)中的一條鏈，使切開鏈的末端沿螺旋的方向轉(zhuǎn)動，然后把切口封起來，到達(dá)松旋的目的。動，然后把切口封起來，到達(dá)松旋

33、的目的。 不需要能量輔助因子。如：不需要能量輔助因子。如：ATP NAD (煙酰胺腺嘌呤煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二核苷酸) ，最初從大腸桿菌中別離，最初從大腸桿菌中別離(fnl)到一種叫到一種叫蛋白，蛋白，后來定名為大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶后來定名為大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 。第四十頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)StructureoftheTopoI/contactwithDNA第四十一頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 后來發(fā)現(xiàn)這種酶廣泛存在于各種生物中，不同學(xué)者曾給予各種命名后來發(fā)現(xiàn)這種酶廣泛存在于各種生物中，不同學(xué)者曾給予各種命名：轉(zhuǎn)軸酶：轉(zhuǎn)軸酶(swiv

34、elase)，松旋酶，松旋酶(untwisting enzyme)，DNA松弛酶松弛酶(DNA relaxing enzyme)，切割，切割(qig)封口酶封口酶(nickingclosing enzyme)。 Topo I 酶松弛超螺旋酶松弛超螺旋DNA時不需要時不需要ATP，它可以催化三種拓?fù)滢D(zhuǎn)換，它可以催化三種拓?fù)滢D(zhuǎn)換反響反響(圖圖7-17)。第四十二頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 I (E. coli)催化催化負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋DNA的松弛的松弛(sn ch)。拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 I也參與也參與DNA的打結(jié)和解結(jié)。的打結(jié)和解結(jié)。 將兩個互補的

35、單鏈將兩個互補的單鏈DNA環(huán)環(huán)耦合為雙鏈耦合為雙鏈DNA環(huán)。環(huán)。第四十三頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)TopoIReactions僅切斷雙鏈DNA的一條(y tio)鏈，即催化瞬時的單鏈斷裂和連接，不需要能量輔助因子如ATP和NAD等第四十四頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)TopoI作用(zuyng)機(jī)制23圖圖2-21 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機(jī)制的作用機(jī)制第四十五頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 屬于屬于型酶型酶 概述概述(i sh)：Topo廣泛存在于各種生物中，它是完成復(fù)制所必需廣泛存在于各種生物中，它是完成復(fù)制所必需的一種酶，可使完成復(fù)制后的兩個子代環(huán)狀雙鏈的一種酶，可使完成復(fù)制后的兩個子代環(huán)狀雙鏈DNA互相分開?；ハ喾珠_。 第四十六頁，共五十二頁。醫(yī)學(xué)專題參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)