食品衛(wèi)生細菌學(xué)檢驗技術(shù)

1、課 題第五章 食品衛(wèi)生學(xué)檢驗技術(shù)§5-1食品衛(wèi)生學(xué)檢驗總則 §5-2食品衛(wèi)生細菌學(xué)檢驗技術(shù)日 期星 期科長簽字教 學(xué)目 的1知識：熟悉微生物檢驗的基本程序和要求。2技能：掌握食品微生物檢驗中常見檢樣的制備技術(shù)。3素質(zhì)：通過學(xué)習(xí)，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、養(yǎng)成良好的學(xué)習(xí)自覺性。重 點 與難 點重點： 微生物檢驗的基本程序難點： 食品微生物檢驗中常見檢樣的制備技術(shù)教 學(xué) 內(nèi) 容 及 過 程方法與環(huán)節(jié)§5-1食品衛(wèi)生學(xué)檢驗總則食品衛(wèi)生細菌學(xué)檢驗的目的，是要對食品進行細菌衛(wèi)生評價。這就要求檢驗人員在求實的精神下，科學(xué)地進行被檢對象的采樣、樣品送檢、檢樣處理、檢驗以及報告。在整個

2、過程中，不得摻雜檢驗人員的絲毫主觀臆想和工作上的馬虎，要有章可依地進行檢驗和報告。樣品的采樣送檢樣品的處理檢驗與報告一、樣品的采集1、 樣品種類樣品可分大樣、中樣、小樣三種。大樣是指一整批樣品；中樣是指從樣品各部分取得的混合樣品，定型包裝及散裝食品均采樣及散裝食品均采樣250g；小樣系指分析用的樣品，又稱為檢樣，檢樣一般為25g。2、 采樣的方法根據(jù)樣品，如袋裝、瓶裝或罐裝食品，應(yīng)采用完整的未開封的樣品；檢樣是冷凍食品，應(yīng)保持冷凍狀態(tài)（可放在冰內(nèi)、冰箱的冰盒內(nèi)或低溫冰箱保存），非冷凍食品需在05中保存。（1）液體樣品的采樣：將樣品充分混勻，無菌操作開啟包裝，用100ml無菌注射器抽取，放入無菌

3、容器。（2）半固體樣品的采樣：無菌操作開啟包裝，用滅菌勺子從幾個部位挖取樣品，放入無菌容器。（3）固體樣品的采樣：大塊整體食品應(yīng)用無菌刀具和鑷子從不同部位取樣，應(yīng)兼顧表面和深度，注意樣品代表性；小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌容器。樣品是固體粉末，應(yīng)邊取樣邊混合。（4）冷凍食品的采樣：大包裝小塊冷凍食品的采樣按小塊個體采?。淮髩K冷凍食品可以用無菌刀從不同部位削取樣品或用無菌小手鋸從冷凍上方法：1、啟發(fā)法2、問答法3、演示法環(huán)節(jié)：1、講授2、小結(jié)3、后記 鋸取樣品，也可以用無菌鉆頭鉆取碎樣品，放入無菌容器。 注：固體樣品或冷凍食品取樣還應(yīng)注意檢樣目的，若需檢驗食品污染情況，可

4、取表層樣品；若需檢驗其品質(zhì)情況，應(yīng)再取深部樣品。（5）生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣車間用水：自來水樣從車間各水龍頭上采取冷卻水，湯料從車間容器不同部位用100ml無菌注射器抽取。車間臺面、用具及加工人員手的衛(wèi)生監(jiān)測：用板孔5cm2無菌采樣板及5支無菌擦拭25cm2面積。車間空氣采樣：將5個直徑90mm的普通營養(yǎng)瓊脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋5min，然后蓋上平板送檢3、采樣的數(shù)量采樣的標簽：采樣前或后應(yīng)立即貼上標簽，每件樣品必須標記清楚，如品名、來源、數(shù)量、采樣地點、采樣人及采樣時間（年、月、日）取樣注意事項：（1）防止交叉污染或二次污染：取樣人員的個人衛(wèi)生控制 ；取樣地點的環(huán)境控制，空氣凈

5、化要達到要求；取樣的器皿要求徹底消毒，避免直接與空氣接觸 ；取樣的操作要規(guī)范、迅速（無菌操作）；減少樣品存放的時間（保持樣本原有的狀態(tài)、易變質(zhì)的樣本要冷藏）(2)取樣要有代表性：取樣的數(shù)量標準；取樣的方法采樣所出的問題 二、送檢采樣后，在送檢過程中，要盡可能保持檢樣原有的物理和微生物狀態(tài)，不要因送檢過程而引起微生物的減少或增多。1、 無菌方法采樣后，所裝樣品的容器要無菌，裝樣后盡可能密封，以防止環(huán)境中的微生物進一步污染；2、 進行微生物檢驗的樣品，送達實驗室要越快越好，一般不應(yīng)超過3h。若路途遙遠，可將不需冷凍的樣品，保持在15 環(huán)境中送檢，可采用冰桶等裝置；若需保持在冷凍狀態(tài)（如已冰凍的樣品

6、），則需將樣品保存在泡沫塑料隔熱箱內(nèi)，箱內(nèi)可置干冰，使溫度維持在0以下，或采用其他冷藏設(shè)備；3、 送檢樣品不得加入任何防腐劑；4、 水產(chǎn)品因含水分較多，體內(nèi)酶的活力較旺盛，易于變質(zhì)。因此，采樣后應(yīng)在3h內(nèi)送檢，在送檢途中一般都應(yīng)加冰保存；5、 對于某些易死亡病原菌檢驗的樣品，在運送過程中可采用運送培養(yǎng)基。6、 檢樣標注適當(dāng)?shù)臉擞洸⑻顚懳⑸飳W(xué)檢驗特殊要求的送檢申請單。其內(nèi)容包括：樣品的描述，采樣者的姓名，采樣的日期、時間、地點，采樣時的溫度和濕度等 三、樣品處理 不同食品的處理方法 樣品處理的問題四、檢驗與報告檢驗：檢驗樣品送到實驗室后，立即將樣品置于普通冰箱或低溫冰箱中，并進行登記、填寫實驗

7、序號，按檢樣檢樣要求，積極準備條件進行檢驗。樣品收集后應(yīng)于36h內(nèi)檢驗；報告：按樣品項目完成各類檢驗后，檢驗人員應(yīng)及時填寫檢驗報告單，簽名后送主管人員簽字，加蓋單位印章，以示生效，立即交食品衛(wèi)生監(jiān)督人員處理； 實驗室必須具有專用冰箱存放樣品，對于一般陽性樣品，在發(fā)出報告3天（特殊情況可適當(dāng)延長）方可處理樣品；進口食品的陽性樣品，需保存6個月，才可處理；而對于陰性樣品可及時處理。§5-2食品衛(wèi)生細菌學(xué)檢驗技術(shù)1、 肉與肉制品檢樣的制備2、 乳與乳制品檢樣的制備3、 蛋與蛋制品檢樣的制備4、 水產(chǎn)品檢樣的制備5、 飲料、冷凍飲品檢樣的制備6、 調(diào)味料檢樣的制備7、 糖果、糕點和蜜餞檢樣的

8、制備8、 酒類檢樣的制備9、 方便面（速食米粉）檢樣的制備10、 罐藏食品檢樣的制備小結(jié)：后記：課 題第五章 食品衛(wèi)生學(xué)檢驗技術(shù)日 期星 期科長簽字教 學(xué)目 的1知識：熟悉食品微生物檢驗中細菌總數(shù)和大腸菌群的檢驗程序。2技能：熟練掌握食品微生物檢驗中細菌總數(shù)和大腸菌群檢測的操作技術(shù)、并能獲得正確的檢驗結(jié)果，寫出規(guī)范的檢驗報告。3素質(zhì)：通過學(xué)習(xí)，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、養(yǎng)成良好的學(xué)習(xí)自覺性。重 點 與難 點重點：食品微生物檢驗中細菌總數(shù)和大腸菌群的檢驗程序難點：食品微生物檢驗中細菌總數(shù)大腸菌群檢測的操作技術(shù)、并能獲得正確的檢驗結(jié)果教 學(xué) 內(nèi) 容 及 過 程方法與環(huán)節(jié)§5-3食品衛(wèi)生細菌學(xué)菌

9、落總數(shù)的檢驗技術(shù)菌落總數(shù)的測定 測定方法n 標準平板培養(yǎng)計數(shù)法（活菌計數(shù)法）n 顯微鏡直接計數(shù)法n 菌落總數(shù)快速檢測紙片 n 電阻抗法測定食品中細菌總數(shù)一、 平板菌落計數(shù)法1、 程序被檢樣品用生理鹽水進行無菌稀釋，做成幾個適當(dāng)稀釋倍數(shù)的懸液選擇23個適當(dāng)稀釋度懸液各1ml，加入無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做23個培養(yǎng)皿每個培養(yǎng)皿中傾注約1.5ml熔化并冷卻到45 左右的營養(yǎng)瓊脂或肉湯瓊脂培養(yǎng)基，冷卻后，于37培養(yǎng)24菌落計數(shù)報告結(jié)果行動導(dǎo)向法1、學(xué)生課下查資料、做課件2、學(xué)生代表講課件3、教師和學(xué)生提問、代表回答4、教師總結(jié)5、后記2、操作要點（1）將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基置于45 恒溫水浴鍋中

10、保溫備用。（2）編號:無菌試管（10-1 、10-2 、10-3 、10-4。）、無菌培養(yǎng)皿、空白對照平板（3）稀釋菌液：（4） 搖勻平板：平板前后、左右或者以順時針、逆時針。（5） 倒置培養(yǎng)3、菌落計數(shù)報告例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)菌落總平均數(shù)及報告方式（個/ml，或個/g）10-110-210-3兩個稀釋度菌落數(shù)之比114681742017400或1.7× 1042多不可計29546460/2951.637750或3.8 × 1043多不可計27160600/2712.227100或2.7 × 1044多不可計1550511511000或5.1 ×

11、105528107280或2.8 × 1026000< 1 × 10或< 107多不可計3031830300或或3.0 × 1044、菌落總數(shù)記錄報告產(chǎn)品名稱 生產(chǎn)車間 班次 生產(chǎn)日期 抽樣日期 檢驗日期 細菌總數(shù)檢驗依據(jù)  培養(yǎng)基接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基結(jié)果報告數(shù)（個/g或ml）AB平均數(shù) 1   10-1   10-2   10-3   10-4 

12、  10-5   空白  備注 檢驗員：日期：復(fù)核：日期：5、注意事項（1）檢驗中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是完全滅菌的，并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì) 。（2）充氣飲料應(yīng)在無菌條件下進行排氣；酸性樣品用經(jīng)過滅菌的2030碳酸鈉溶液調(diào)整pH值至中性；高鹽樣品應(yīng)用滅菌蒸餾水進行稀釋。(3)在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液面2.5cm；吸入液體時，應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端離開液面，將尖端貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸；當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的

13、試管內(nèi)時，應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管尖端外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。(4)為了防止細菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落，在檢液加入平皿后，應(yīng)在20分鐘內(nèi)向皿內(nèi)傾入瓊脂，并立即使其與瓊脂混和均勻。 （5） 計數(shù)表示方法：CFU /ml或個（國際標準6、其他菌落總數(shù)的測定1、平板菌落計數(shù)法測定的是在營養(yǎng)瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫性需氧或兼性厭氧的菌落總數(shù)。厭氧菌、嗜冷菌、嗜熱菌在此條件下不生長，有特殊營養(yǎng)要求的一些細菌也受到了限制。3、 嗜冷菌計數(shù)（新鮮魚貝）操作要點：采樣后盡快冷藏檢驗；稀釋液涂布于TS或CVT瓊脂平板上，平板倒置于冰箱中冷藏培養(yǎng)。4、 嗜熱菌操作要點：采樣煮沸5min（殺死

14、細菌繁殖體）；5、 厭氧菌操作要點：稀釋液與45硫乙醇酸鈉瓊脂混合搖勻，倒平板，在其上封一層3無菌瓊脂。7、出現(xiàn)的實際工作問題1、做菌落總數(shù)檢測時,發(fā)現(xiàn)稀釋倍數(shù)大的比稀釋倍數(shù)小的平皿上生長的菌落數(shù)還多,而且空白對照又沒長菌,我找不出啥原因？2、 我做的菌落總數(shù)的測定，是把濃縮的復(fù)合芽孢桿菌進行10-8、10-9、10-10稀釋，在涂布法吸取0.1ml的3個濃度的時候，培養(yǎng)皿中長出來的菌2個10-9長了一大片的菌連在一起，10-8也有一個這樣，其他的幾乎不長，究竟怎么會事？3、 檢測菌落總數(shù)時,有些菌落難以區(qū)別,有沒有什么好的試劑,能增加菌落的可見率？4、 我公司做的菌落總數(shù)和技術(shù)監(jiān)督局所測的數(shù)

15、目存在巨大差別.是這樣的:我公司跟客戶采購一批的雞粉，多次檢測此批產(chǎn)品菌落總數(shù)均在5000左右，超過我司的內(nèi)控標準。但客戶檢測數(shù)目與我司不符，于是我司把產(chǎn)品送到當(dāng)?shù)氐募夹g(shù)監(jiān)督局檢測，所得結(jié)論是菌落總數(shù)為：205個/克。所以我們老總懷疑我們的工作能力，但問題是在其中一次操作中，我們同時化驗兩種不同品牌的雞精，一種不符合要求，一種可以。 二、菌落總數(shù)快速檢測紙片 三、電阻抗法測定細菌總數(shù)原理：供細菌生長的液體培養(yǎng)基是電的良導(dǎo)體，在特制的測量管底部裝入電極插頭，即可對接種生長的培養(yǎng)基的阻抗變化進行檢測。阻抗變化的產(chǎn)生是由于微生物生長過程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)(糖、脂類、蛋白質(zhì)等）被分

16、解成小分子代謝物，即較小的帶電離子（乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸或氨等）這些代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚集，增強了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能，從而降低了其阻抗值: M=(R0-RT)/R0×100% ，其中R0表示開始時培養(yǎng)基的阻抗值， RT表示任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值，M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分數(shù)。電阻越小細菌活動越多，在一定范圍內(nèi)，菌落形成單位（CFU）的對數(shù)Log(CFU)與IDT（阻抗檢測時間）呈直線關(guān)系。四、電阻抗法測定細菌總數(shù)優(yōu)缺點：1、 常規(guī)經(jīng)典檢測方法結(jié)果準確可靠，但卻存在繁瑣、工作量大，好時過長；電阻抗法叫省力，樣品細菌數(shù)在418小時內(nèi)出結(jié)果。2、 電阻抗法制作標準曲線過程中工作量較大，但以后

17、的檢測簡便的多，不需要一系列稀釋，只需樣品1ml，培養(yǎng)基9ml，測量管一只。§5-4食品衛(wèi)生大腸菌群的檢驗技術(shù)一、基本概念1、大腸菌群指一群37、24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量。3、 大腸菌群包括大腸埃希氏菌（大腸桿菌）、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群的來源分糞便來源和非糞便來源，在44.5仍能生長的大腸菌群，稱為糞大腸菌群，糞大腸菌群又叫耐熱大腸菌群，在人和動物糞便中所占的比例較大，而且在自然界容易死亡。因此，糞大腸菌群對糞便污染的指示作用更為直接和貼切，主要就

18、是大腸桿菌，但也包括克雷伯氏菌屬，正是由于包括了克雷伯氏菌屬，使其與糞便污染的相關(guān)性受到了影響。4、 大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌這三個指標在實際工作中都在應(yīng)用，但用途有所不同，一般認為大腸菌群是水源的衛(wèi)生指標和食品加工衛(wèi)生狀況的通用指標，糞大腸菌群主要用于貝類和貝類養(yǎng)殖用水的衛(wèi)生指標，大腸桿菌用于指示食品受到近期糞便污染或不衛(wèi)生加工。5、 大腸菌群表示方法：MPN（ most probable number） /100mL 二、乳糖發(fā)酵法（國標）1、檢驗稀釋 取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗方法相同。2、乳糖發(fā)酵試驗 根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z樣污染程度的估計，選擇三個稀釋度，

19、每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。接種量在1ml以上者,用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1ml及1ml以下者,Ø 用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。置36±1溫箱內(nèi),培養(yǎng)24±2小時,如所有發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報告為大腸菌群陰性,如有產(chǎn)氣者,則與對照的混合菌種一起按下列程序進行。Ø 分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別在伊紅美蘭瓊脂（EMB瓊脂）平板上劃線分離。然后置36±1溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824小時后取出, 觀察菌落形態(tài),并作革蘭氏染色和證實試驗。3、 證實試驗 在上述平板上,挑取可疑大腸菌落12個進行革蘭氏染色,同時接種乳糖發(fā)酵管,置36±1溫箱培養(yǎng)2

20、4±2小時,觀察產(chǎn)氣情況,凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌,即可報告為大腸菌群陽性.4報告 根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。Ø  結(jié)果 三、糞大腸菌群的測定1、檢驗稀釋2、44 乳糖發(fā)酵試驗 將接稀釋液的乳糖膽鹽發(fā)酵管，置于（44±0.5）水浴中，經(jīng)（24 ±2）h培養(yǎng)。3、 證實試驗：將所有產(chǎn)氣發(fā)酵管，分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂平板上，置（36±1）培養(yǎng)1824h，并同時接種蛋白胨水，置（44±0.5）培養(yǎng)24h。在平板上觀察典型菌落，并做鏡檢。在蛋白胨水內(nèi)加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。4、 結(jié)果靛基質(zhì)陽性，平板上有典型菌落者，則證實為糞大腸菌群陽性。四、出口食品行業(yè)標準n 檢測