酚法測定蛋白質含量

1、生物化學實驗報告姓 名： 學 號： 專業(yè)年級： 組 別：第一實驗室生物化學與分子生物學實驗教學中心一、 實驗室規(guī)則1實驗前應認真預習實驗指導，明確實驗目的和要求，寫出預實驗報告。2進入實驗室必須穿白大衣。嚴格遵守實驗課紀律，不得無故遲到或早退。不得高聲說話。嚴禁拿實驗器具開玩笑。實驗室內禁止吸煙、用餐。3嚴格按操作規(guī)程進行實驗。實驗過程中自己不能解決或決定的問題，切勿盲目處理，應及時請教指導老師。4嚴格按操作規(guī)程使用儀器，凡不熟悉操作方法的儀器不得隨意動用，對貴重的精密儀器必須先熟知使用方法，才能開始使用；儀器發(fā)生故障，應立即關閉電源并報告老師，不得擅自拆修。5取用試劑時必須“隨開隨蓋”，“蓋

2、隨瓶走”，即用畢立即蓋好放回原處，切忌“張冠李戴”，避免污染。6愛護公物，節(jié)約水、電、試劑，遵守損壞儀器報告、登記、賠償制度。7注意水、電、試劑的使用安全。使用易燃易爆物品時應遠離火源。用試管加熱時，管口不準對人。嚴防強酸強堿及有毒物質吸入口內或濺到別人身上。任何時候不得將強酸、強堿、高溫、有毒物質拋灑在實驗臺上。8廢紙及其它固體廢物嚴禁倒入水槽，應倒到垃圾桶內。廢棄液體如為強酸強堿，必須事先用水稀釋，方可倒入水槽內，并放水沖走。9以實事求是的科學態(tài)度如實記錄實驗結果，仔細分析，做出客觀結論。實驗失敗，須認真查找原因，而不能任意涂改實驗結果。實驗完畢，認真書寫實驗報告，按時上交。10實驗完畢，

3、個人應將試劑、儀器器材擺放整齊，用過的玻璃器皿應刷洗干凈歸置好，方可離開實驗室。值日生則要認真負責整個實驗室的清潔和整理，保持實驗整潔衛(wèi)生。離開實驗室前檢查電源、水源和門窗的安全等，并嚴格執(zhí)行值日生登記制度。實驗名稱(Title of Experimetn)Folin-酚試劑法測定蛋白質含量實驗日期(Date of Experiment)實驗地點(Lab No.)合作者(Partner)指導老師(Instructor)總分(Total Score)教師簽名(Signature)批改日期(Date)【實驗報告第一部分（預習報告內容）：實驗原理、實驗材料（包括實驗樣品、主要試劑、主要儀器與器材）、

4、實驗步驟（包括實驗流程、操作步驟和注意事項）；評分（滿分30分）：】一、實驗原理1921年，F(xiàn)olin 首創(chuàng)Folin-酚試劑法，利用蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍色反應；1951年，Lowry對此法進行了改進，先于標本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應，提高了靈敏度。Folin-酚試劑法主要包括兩步：第一步 雙縮脲反應在堿性溶液中，雙縮脲（H2NOCNHCONH2）能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡合物，這個反應叫做雙縮脲反應。由于蛋白質分子中含有與雙縮脲結構相似的多個肽鍵, 因此有雙縮脲反應。即在堿性溶液中，蛋白質分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+

5、作用生成紫紅色的蛋白質- Cu2+復合物。第二步 Folin-酚顯色反應Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍色反應（鉬藍和鎢藍的混合物）。由于蛋白質中含有帶酚羥基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此顯色反應。即蛋白質- Cu2+復合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。在一定濃度范圍內，藍色的深淺度與蛋白質濃度呈線性關系，故與同樣處理的蛋白質標準液比色即可求出樣品中蛋白質的含量。另外，可以根據(jù)預先繪制的標準曲線求出待測樣品中蛋白質的含量。二、實驗材料（一）樣品健康人血清（稀釋300倍）（二）試劑1牛血清白蛋白標準

6、液（200mg/ml）準確稱取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/L NaOH溶液潤濕溶解，加蒸餾水到250ml。2堿性硫酸銅溶液堿溶液：Na2CO32g 溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。硫酸銅溶液：CuSO45H2O 0.5g溶于100ml 35mmol/L(1%)酒石酸鉀鈉中。使用前將與按50:1混合即成堿性硫酸銅溶液。使用時新鮮配制。3Folin-酚試劑在2L磨口回流裝置內加鎢酸鈉（Na2WO42H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）25g，蒸餾水700ml，14.68mol/L（85%）磷酸50ml，濃鹽酸100ml，充分混合后用小火回流10h。冷卻

7、后，再加硫酸鋰（Li2SO4H2O）150g，水50ml，數(shù)滴（23滴）液體溴（也可用30%H2O2 68滴代替），然后開口沸騰15min，驅除過量的溴（因溴氣甚毒，這一步應在通風櫥中進行），冷卻后加水至1000ml，過濾，溶液呈黃色（如帶綠色則不能用），保存于棕色瓶中置冷暗處備用（如配制時間較長，試劑轉呈綠色），可再加液體溴數(shù)滴，煮沸15min，若能恢復原有的黃色或金黃色仍可繼續(xù)使用）。（三）儀器及器材1V-1100分光光度計2恒溫水浴箱3試管6支、試管架4加樣槍、加樣槍架5坐標紙三、實驗步驟1反應體系設置取6支試管編號，按下表加入試劑，混勻。試劑（ml）空白管標管樣品管123456牛血清白

8、蛋白標準液0.20.40.60.8樣品液0.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.52雙縮脲反應向各管內分別加入堿性硫酸銅溶液2ml，混勻，室溫放置10min3Folin-酚反應再加入Folin-酚試劑0.20ml, 2s內迅速混勻a！40水浴10min后，冷卻至室溫。a. 當Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。4比色測定以500nm波長比色，用1號管作空白，讀取各管吸光度值A500b。b. 每管重復測三次A500值，求平均值用于繪標準曲線。【實驗報告第二部分（實驗記錄）：主要實驗條件（如材料的來源、

9、質量；試劑的規(guī)格、用量、濃度；實驗時間、操作要點中的技巧、失誤等，以便總結實驗時進行核對和作為查找成敗原因的參考依據(jù)）；實驗中觀察到的現(xiàn)象（如加入試劑后溶液顏色的變化）；原始實驗數(shù)據(jù)。評分（滿分20分）：XX】一、 主要實驗條件實驗條件見第一部分。注意事項1干擾物質此法是在Folin-酚法的基礎上引入雙縮脲試劑，因此凡干擾雙縮脲反應的基團，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性質上是氨基酸或肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑以及蔗糖，硫酸銨，巰基化合物均可干擾Folin-酚反應。此外，所測的蛋白質樣品中，若含有酚類及檸檬酸，均對此反應有干擾作用。而濃度較低的尿素（約0.5%左右）

10、，胍（0.5%左右），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）對顯色無影響，這些物質在所測樣品中含量較高時，則需做校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨，則需增加碳酸鈉氫氧化鈉濃度即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉氫氧化鈉濃度12倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。2控制時間因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。即第1支試管加入2.0ml堿性硫酸銅試劑后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入2.0ml堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立

11、即加入0.20ml Folin-酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20ml Folin-酚試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。40水浴10min，冷卻后，每一分鐘測定一管吸光值。操作問題及處理問 題解 析（1）加入Folin-酚試劑后溶液呈現(xiàn)黃綠色加入Folin-酚試劑后沒有及時混勻或加入的量不準確，偏多（2）水浴后溶液呈無色Folin-酚試劑在反應前已被破壞，原因是加入Folin-酚試劑后沒有及時混勻，或水浴時間過長。二、 實驗現(xiàn)象1、加入Folin-酚試劑后溶液呈現(xiàn)藍色，其中空白組藍色較淺，標準管25藍色依次加深。三、實驗數(shù)據(jù)1數(shù)據(jù)記錄按照下表記錄各管在500nm波長測得的吸光度值。測定

12、次數(shù)各管吸光度值A5002345610.2790.4680.6290.7200.15320.2820.4630.6280.7180.14930.2770.4560.6240.7180.150各管平均值0.2790.4620.6270.7190.1512繪制標準曲線3結果計算血清蛋白濃度(mg/ml) = 樣品蛋白質濃度×2×300線性方程為：y=0.005x，將樣品溶液（即6號試管）的吸光度（0.151）代入方程，就可得出樣品濃度X=18.2g/l即該樣本中人血清蛋白濃度為18.2 g/L,低于正常人平均值。（參考：正常人血清蛋白濃度范圍為6080 g/L）?！緦嶒瀳蟾娴谌?/p>

13、部分（結果與討論）：結果（定量實驗包括計算）：應把所得的實驗結果（如觀察現(xiàn)象）和數(shù)據(jù)進行整理、歸納、分析、對比，盡量用圖表的形式概括實驗的結果；討論：不應是實驗結果的重述，而是以結果為基礎的邏輯推論。結論：簡單扼要，說明本次實驗所獲得的結果。（包括思考題）。評分（滿分45分）：XX】一、 結果1.實驗測得的人血清蛋白濃度為18.2 g/L，較標準值低。二、 討論本實驗測得樣本人血清蛋白濃度偏低，原因可能有：1、樣本人體較正常人體蛋白濃度偏低2、Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，試劑被還原影響實驗結果3、讀數(shù)、試劑加入時間不夠精確4、分光光度計溶液管表面油漬、污穢較多影響對光波長的分析三、 結論1.實驗測得的人血清蛋白濃度為18.2 g/L，較標準值低。課后思考題1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點？Folin-酚試劑法較雙縮脲反應靈敏，可以達到g級別，操作方便，實驗重復性好。2、應用本方法有哪些干擾作用？為什么？應如何注意？ 酸堿性干擾。Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，而反應試劑是堿性的，所以將Fo