LSP1基因多態(tài)性與膀胱癌的關聯分析及LSP1在膀胱癌中的表達及意義

1、LSP1基因多態(tài)性與膀胱癌的關聯分析及LSP1在膀胱癌中的表達及意義第一部分 :LSP1 基因多態(tài)性 rs907611 與膀胱癌的相關性分析目的: 研究白細胞特異性蛋白 1(Leukocyte-specific protein 1,LSP1)單核苷酸多態(tài)性rs907611 與天津地區(qū)漢族人群膀胱尿路上皮癌發(fā)病風險的相關性。方法: 收集2012 年 5 月至 2014 年 6 月在天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院初次確診的535 例膀胱尿路上皮癌患者的血液及649 例對照組人群 ( 與病例組年齡、性別相匹配的正常體檢人群 ) 的血液進行研究 , 提取全血基因組DNA,應用 PCR-LDR方法進行基因分型。首

2、先檢驗分型結果是否遵循HWE平衡定律 , 然后采用多因素非條件logistic回歸檢驗來分析 rs907611 基因型與天津漢族人群膀胱癌易感性、分期、分級、吸煙及進展風險的相關性 ; 應用 Kaplan-Meier曲線和 COX回歸模型來分析rs907611基因型與膀胱癌短期復發(fā)的相關性。結果 : 分型結果符合 HWE平衡定律 (p>0.05)。LSP1 rs907611 存在三種基因型 : 野生型 (G/G) 、突變雜合子 (G/A) 及突變純合子 (A/A) 。以野生型 (G/G) 基因型為對照 , 突變純合子 (A/A) 人群膀胱癌發(fā)病風險明顯提高(p=0.036,OR=

3、1.786,95%CI 1.038-3.072),突變型 (G/A+A/A) 人群中膀胱癌的發(fā)病風險也有輕微升高 (p=0.049,OR=1.264,95%CI 1.001-1.596);與 G等位基因相比 ,A 等位基因與膀胱癌的發(fā)病風險存在明顯的相關性(p=0.019,OR=1.264,95%CI1.038-1.538)。分層分析結果顯示rs907611 與膀胱癌分期分級的發(fā)病風險沒有明顯的相關性。另外 , 結果顯示 rs907611 對吸煙人群膀胱癌的發(fā)病風險沒有影響。結合隨訪數據進行分析 , 沒有發(fā)現這 rs907611 與非肌層浸潤性膀胱癌的短期復發(fā)存在相關性。結論 :LSP1 基因

4、 rs907611 位點基因突變可顯著增加天津地區(qū)漢族人群膀胱癌的發(fā)病風險 , 尤其與低級別、非肌層浸潤性膀胱癌的發(fā)生關系密切。這一基因并不會影響吸煙患者膀胱癌的發(fā)病率, 也與天津地區(qū)漢族人群膀胱癌的短期復發(fā)沒有顯著地相關性。 第二部分 : 膀胱癌易感位點LSP1rs907611 的功能分析目的 :通過研究 rs907611 多態(tài)性位點周圍基因的表達量與rs907611 基因型的相關性來篩選單核苷酸多態(tài)性rs907611 的靶基因 , 從而進一步探討 rs907611 增加膀胱癌易感性的作用機制。方法 : 在 UCSC Genome Browser中檢索 rs907611 位點兩側各 250k

5、bp 范圍內的基因 ( 包括 DNA、microRNA和 lincRNA) 。從我實驗室膀胱癌標本庫中隨機選擇與 rs907611 的三種基因型相對應的患者的膀胱癌及癌旁組織標本共24 對, 其中G/G基因型 10 對、 G/A 及 A/A 基因型各 7 對, 提取組織 RNA,應用實時定量 Q-PCR的方法檢測相應基因的表達情況。結果: 在 rs907611 兩側 500kbp 范圍內共存在21 個基因 , 其中 DNA包括 KRTAP5-3、KRTAP5-4、KRTAP5-5、KRTAP5-6、IFITM10、SYT8、TNNI2、LSP1、CTSD、TNNT3、HOTS和 MRPL23;

6、microRNA包括 MIR4298、MIR7847和 MIR675;lincRNA 包括 MRPL23-AS1、FAM99A、FAM99B、 H19、Linc01219 及Linc01150 。Q-PCR結果顯示以上所有基因的表達量與rs907611 的基因型均沒有明顯的相關性 (p>0.05);但是我們發(fā)現癌組織中LSP1及 MIR7847的表達量明顯低于癌旁組織 (p<0.05),癌組織中 H19和 MIR675的表達量明顯高于癌旁組織(p<0.05)。結論 : 在 LSP1基因多態(tài)性 rs907611 位點周圍 500kbp 范圍內沒有rs90

7、7611 的靶基因 ;LSP1 及 MIR7847在癌組織中明顯低表達 , 而 H19和 MIR675在膀胱癌組織中明顯高表達。第三部分:LSP1 在膀胱癌中的表達及意義目的: 研究 LSP1在膀胱癌中的表達水平 , 并初步探討 LSP1對膀胱癌細胞的影響。方法 : 應用免疫組化和 western-blot 技術檢測膀胱癌組織及癌旁正常膀胱黏膜 LSP1的表達情況。構建 LSP1過表達質粒 , 轉染 T24膀胱癌細胞 , 應用 Q-PCR、Western-blot檢測轉染效果 , 應用 MTT、流式細胞術、劃痕實驗及Transwell實驗檢測 LSP1對膀胱癌細胞的增殖、 凋亡、遷移及侵襲的影響。 結果 : 免疫組化和Western-blot結果顯示 LSP1在膀胱癌組織中明顯低表達。我們成功構建 pcDNA3.1(+)/LSP1 過表達質粒并順利轉染T24 膀胱癌細胞 ;MTT結果顯示轉染 LSP1過表達質粒后 T24 細胞的增殖受到明顯的抑制 ; 流式細胞術結果顯示出 T24 細胞中 LSP1過表達后細胞凋亡明顯增加 ; 劃