蛋白相互作用PullDown實驗

1、蛋白相互作用Pull-Down實驗實驗原理：Pull-Down技術(shù)是通過蛋白相互作用來研究細胞通路的有力工具。是確定兩種或更多蛋白之間相互作用的體外方法。Pull-Down實驗可用來檢測已知的蛋白相互作用條件，并且可用來篩選未知的蛋白相互作用。用作誘餌的蛋白是重組蛋白，會含有一個用于純化的親和標簽。這個融合標簽就是用于Pull-Down實驗的基礎(chǔ)。最常見的標簽為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和多組氨酸（6×His）。其分別使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金屬螯合物親和配體（如Ni2+和Co2+）。實驗準備：實驗儀器：谷胱甘肽瓊脂糖凝膠（鎳離子瓊脂糖凝膠）、離心機、實驗材料：表達的含標簽的

2、純化蛋白、細胞裂解液實驗試劑：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚藍、10%甘油、10mM DTT裂解緩沖液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、 200mM NaCl、 1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制劑。（蛋白酶抑制劑：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug

3、/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF）實驗方法：方法一：1、 預(yù)清除細胞裂解液：將細胞裂解液與50ul的50%谷胱甘肽瓊脂糖球珠懸液和25ug GST在4混合孵育2h。離心機12,000g在4離心2min。將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。2、 探測細胞裂解液兩個含等量預(yù)清除細胞裂解液及50ul谷胱甘肽瓊脂糖球珠的微量離心管。在一管中加約10ug的GST蛋白，另一管中加約10ug的GST融合探針蛋白。兩個反應(yīng)中加入的探針和對照蛋白質(zhì)的量應(yīng)該是等摩爾的。將離心管在4翻轉(zhuǎn)混合孵育2h。最大速度在4離心樣品2min。在新的微量離心管中收集上清。用1ml冰冷的裂解液洗球珠。

4、在離心機上以最大速度離心1ml。棄去上清。重復(fù)洗三次。加入50ul 20mmol/L的還原型谷胱甘肽到球珠中，洗脫GST融合蛋白及任何與其結(jié)合的蛋白質(zhì)。在離心機上最大速度離心2min。將洗脫蛋白質(zhì)與等體積的2×SDS-PAGE上樣buffer混合。3、檢測相互作用蛋白質(zhì)將樣品煮沸4min，進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。方法二：1、5ug目的GST融合探針蛋白和GST蛋白分別和谷胱甘肽瓊脂糖凝膠球珠在4孵育結(jié)合30min。2、結(jié)合GST融合探針蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠球珠與100ul細胞裂解液結(jié)合在4作用4h。3、3000rpm在4離心5min，除去上清。4、用洗滌緩沖液重懸谷胱甘

5、肽瓊脂糖凝膠球珠，3000rpm在4離心5min，除去上清，重復(fù)5次。5、取谷胱甘肽瓊脂糖凝膠球珠進行SDS-PAGE電泳分析。方法三：實驗試劑：PBS（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4）Elution Buffer: 50mM Tris-Cl(pH8.0)、10mM還原型谷胱甘肽0.154g溶解到50ml 50mM Tris-Cl(pH8.0)中配制Elution Buffer。1、 細胞裂解取1ml細菌培養(yǎng)液離心去上清，加200ul細胞裂解液到菌丸，在室溫下重懸并輕柔的混勻。將其在室溫下晃動孵育20-30min。2、固定GST融合

6、蛋白到柱子上 將谷胱甘肽瓊脂糖凝膠顛倒混勻后取20ul到1.5ml離心管中，小心去除上清，加250ul Binding Buffer或wash Buffer到凝膠中，混勻。重復(fù)洗3次以上。 平衡好的凝膠用100ul Binding Buffer或wash Buffer重懸。加200ul含GST融合蛋白的細菌裂解液，在旋轉(zhuǎn)的臺子上室溫下孵育30min。 小心移去上清，（保存以便分析，）將250ul Binding Buffer或wash Buffer加到凝膠中，輕柔混勻，在室溫下孵育5min。小心移去上清。加入250ulBinding Buffer或Washing Buffer再次清洗，將凝膠用

7、20ul Binding Buffer或wash Buffer重懸。3、 捕獲獵物蛋白將5ul固定GST融合蛋白的凝膠中加入20ul含獵物蛋白的溶液，將155ul Binding Buffer或wash Buffer和20ul 10%BSA加入凝膠中，在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育1h。移去上清。將400ul Binding Buffer或wash Buffer加入凝膠中，輕柔混勻，在室溫下孵育5min，移去上清。加400ul Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝膠。小心移去上清。分析：加20ul SDS-PAGE loading Buffer，在室溫下混合5min。取出上清用于分

8、析。His Pull-Down方法實驗試劑：Binding Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM NaCl、20mM咪唑Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl、500mM咪唑?qū)嶒灢襟E：1、結(jié)合蛋白裂解后，經(jīng)0.45um濾膜過濾，2、與Ni-NTA樹脂（1ml蛋白裂解液上清結(jié)合5ul樹脂）4混合孵育3h。3、待樹脂沉淀后用10倍柱體積的鎳柱洗滌緩沖液洗去雜蛋白。4、用6倍柱體積鎳柱洗脫目的蛋白。5、純化后的蛋白用PBS和超純水透析，凍干。6、SDS-PAGE電泳分析7、純化的蛋白與Ni-NTA樹脂冰浴作用2h，8

9、、10倍柱體積洗滌緩沖液洗滌，9、然后加入過量100ug/ml蛋白溶液，冰浴作用2h，10、用10倍柱體積的鎳柱洗滌緩沖液清洗，11、加入1倍柱體積洗脫緩沖液洗脫，12、洗脫蛋白進行SDS-PAGE和Western-blot分析鑒定。13、陰性對照為結(jié)合蛋白溶液加入Ni-NTA樹脂中冰浴作用2h。10倍柱體積的鎳柱洗滌緩沖液清洗，加入1倍柱體積洗脫緩沖液洗脫，注意事項：1、所有過柱的液體都要經(jīng)過0.45um或0.22um的濾膜。2、平衡柱子：2.1 用3-5個柱體積蒸餾水洗柱2.2 用3-5個柱體積的binding buffer平衡柱子。3、洗柱：如谷胱甘肽瓊脂糖凝膠的柱子失去結(jié)合能力，需要洗去柱子上的雜質(zhì)3.1 除去變性物質(zhì)，用2個柱體積的的6M鹽酸胍洗柱子，然后用5個柱體積的PBS洗柱3.2 除去疏水