基因敲除專(zhuān)題

1、基因敲除概述 基因敲除是自80年代末以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用。基因敲除的發(fā)展史基因敲除的成就 70歲的美國(guó)科學(xué)家馬里奧卡佩奇（中），82歲的美國(guó)科學(xué)家?jiàn)W立佛史密斯（右）與66歲的英國(guó)科學(xué)家馬丁埃文斯（左），憑借基因打靶技術(shù)共同分享了2007年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。因?yàn)樗麄儼l(fā)現(xiàn)了如何用基因控制老鼠胚胎細(xì)胞，評(píng)委會(huì)認(rèn)為，是因?yàn)槠洹伴_(kāi)創(chuàng)了全新的研究領(lǐng)域”，為人類(lèi)攻克

2、某些疾病提供了藥物試驗(yàn)的動(dòng)物模型。2007諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者馬里奧馬里奧卡佩奇曾經(jīng)流浪街頭，童年的坎坷煉成了他日后堅(jiān)強(qiáng)的性格卡佩奇曾經(jīng)流浪街頭，童年的坎坷煉成了他日后堅(jiān)強(qiáng)的性格70歲小故事：卡佩奇曾有著坎坷的傳奇經(jīng)歷：童年時(shí)正值二戰(zhàn)，母親因?yàn)榉捶ㄎ魉沟膶?xiě)作而被關(guān)入納粹集中營(yíng)，他流落成意大利街頭的小混混，以乞討和偷竊為生。母子團(tuán)聚后，他得以來(lái)到美國(guó)并接受教育，后來(lái)在1967年獲得了哈佛大學(xué)的生物物理學(xué)博士學(xué)位，還曾在DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)者之一詹姆士沃森（JamesD.Watson）的實(shí)驗(yàn)室工作。他的一位朋友描述道，他“意志堅(jiān)強(qiáng)，不受約束，即使處于逆境，對(duì)于好的想法和重大計(jì)劃的追求總是樂(lè)此不?！?/p>

3、。當(dāng)1980年卡佩奇向美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）申請(qǐng)課題，要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上建立基因靶向技術(shù)時(shí)，沒(méi)有通過(guò)評(píng)審。他得到的建議是忘了這念頭。然而卡佩奇堅(jiān)持他的想法。當(dāng)時(shí)卡佩奇已經(jīng)證明，可以用同源重組的手段將特定的外源基因?qū)氲浇湍讣?xì)胞基因組中，他覺(jué)得，新的遺傳物質(zhì)也應(yīng)該可以用這種方法引入哺乳動(dòng)物的基因組?？ㄅ迤鎻淖约旱钠渌?xiàng)目中挪出經(jīng)費(fèi)來(lái)繼續(xù)這項(xiàng)研究，不久，他就證明了這一點(diǎn)。那么，用一段壞了的基因序列去替代原來(lái)那個(gè)有功能的基因序列，就能起到讓該基因罷工的目的，這就是基因敲除。與此同時(shí)，奧利弗史密西斯也在獨(dú)立地做類(lèi)似的工作。奧利弗奧利弗史密西斯等人的工作讓在培養(yǎng)細(xì)胞中的基因靶向技術(shù)成為可能史密西斯

4、等人的工作讓在培養(yǎng)細(xì)胞中的基因靶向技術(shù)成為可能8282歲歲小故事：1985年，奧利弗史密西斯發(fā)表了一篇極為重要的論文，報(bào)道在紅白血病細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了外來(lái)基因和細(xì)胞Beta-球蛋白基因間的同源重組，他還提出了將同源重組用于修復(fù)突變基因的概念，也就是不將特定的基因敲除，而僅僅對(duì)它加以修飾改變?？ㄅ迤婧褪访芪魉沟墓ぷ髯屧谂囵B(yǎng)細(xì)胞中的基因靶向技術(shù)成為可能。然而，要想對(duì)整個(gè)動(dòng)物活體中的基因“動(dòng)武”，看上去還很困難。那時(shí)，在大西洋另一側(cè)，馬丁埃文斯正在英國(guó)的劍橋大學(xué)開(kāi)展關(guān)于胚胎干細(xì)胞的研究。 馬丁馬丁埃文斯的胚胎干細(xì)胞研究對(duì)于基因敲除技術(shù)具有重要意義埃文斯的胚胎干細(xì)胞研究對(duì)于基因敲除技術(shù)具有重要意義6666歲

5、歲小故事：1981年，馬丁埃文斯領(lǐng)導(dǎo)的研究小組從小鼠的胚胎中提取到了胚胎干細(xì)胞，將這種細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，再植入小鼠囊胚內(nèi)，小鼠長(zhǎng)成后就成為一個(gè)嵌合體：有一些細(xì)胞是原先胚胎分裂而來(lái)的，而另一部分則由植入的胚胎干細(xì)胞分化而來(lái)?？ㄅ迤婧褪访芪魉购芸煲庾R(shí)到了這一技術(shù)對(duì)于他們工作的意義：用同源重組對(duì)胚胎干細(xì)胞中的基因加以改造，再將這種細(xì)胞植入動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)分化以后，整個(gè)動(dòng)物體內(nèi)就“嵌合”了這種特別的細(xì)胞。若運(yùn)氣好，還能得到基因被改造過(guò)的生殖細(xì)胞，通過(guò)兩代繁殖，就能孕育出純合體的基因修飾小鼠。他倆各自開(kāi)展工作，1989年，卡佩奇發(fā)表了一篇里程碑式的論文，第一只通過(guò)胚胎干細(xì)胞同源重組獲得的基因敲除小鼠出現(xiàn)了。至此

6、，基因靶向技術(shù)真正成熟。19891989年，卡佩奇發(fā)表了一篇里程碑式的論文，第一只通過(guò)胚胎年，卡佩奇發(fā)表了一篇里程碑式的論文，第一只通過(guò)胚胎干細(xì)胞同源重組獲得的基因敲除小鼠出現(xiàn)了。干細(xì)胞同源重組獲得的基因敲除小鼠出現(xiàn)了。20122012年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 約翰格登John B. Gurdon Shinya Yamanaka 山中伸彌 發(fā)現(xiàn)成熟細(xì)胞可以被重新編程為多功能的干細(xì)胞（即誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞）發(fā)現(xiàn)成熟細(xì)胞可以被重新編程為多功能的干細(xì)胞（即誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞） 他的表現(xiàn)遠(yuǎn)不能令人滿(mǎn)意，他從來(lái)不聽(tīng)從教導(dǎo)，經(jīng)常固執(zhí)己見(jiàn)，按照自己的想法胡攪蠻慘，因此常常陷入到困境里。我知道

7、他立志將來(lái)成為一位科學(xué)家，這很不錯(cuò)有 理想有目標(biāo)，不過(guò)根據(jù)他現(xiàn)在的表現(xiàn)，這非?；闹?。如果他不能學(xué)會(huì)一些簡(jiǎn)單的生物學(xué)常識(shí)，將來(lái)根本不會(huì)有任何機(jī)會(huì)去做一位專(zhuān)家級(jí)的工作，不管對(duì)他自己還是教 他的老師們來(lái)說(shuō)，純粹是浪費(fèi)時(shí)間基因敲除定義基因敲除定義實(shí)現(xiàn)基因敲除的多種原理和方法實(shí)現(xiàn)基因敲除的多種原理和方法基因敲除技術(shù)的應(yīng)用及缺陷基因敲除技術(shù)的應(yīng)用及缺陷基因敲除定義： 中文名稱(chēng)：基因敲除 英文名稱(chēng)：gene knock-out;gene knockout 其他名稱(chēng)：基因剔除 定義1：將細(xì)胞基因組中某基因去除或使基因失去活性的技術(shù)。去除原核生物 細(xì)胞、真核生物的生殖細(xì)胞、體細(xì)胞或干細(xì)胞基因組中的基因等。廣義的

8、基因敲除包括某個(gè)或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因調(diào)控序列的敲除以及成段基因組序列的敲除。常用同源重組的方法。敲除的基因用以觀(guān)察生物或細(xì)胞的表型變化，是研究基因功能的重要手段。 定義2：將細(xì)胞基因組中某基因去除或使基因失去活性的方法。常用同源重組的方法敲除目的基因，觀(guān)察生物或細(xì)胞的表型變化，是研究基因功能的重要手段。 定義3：在基因組水平上改變或破壞靶基因的結(jié)構(gòu)，使其功能完全喪失的實(shí)驗(yàn) 技術(shù)。 實(shí)現(xiàn)基因敲除的多種原理和方法: 2.1 利用同源重組進(jìn)行基因敲除 2.1.1 利用同源重組構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型的基本步驟 2.1.2 條件性基因敲除法 2.1.3 誘導(dǎo)性基因敲除法 2.1.4 同源重

9、組基因敲除缺點(diǎn) 2.2 利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除 2.2.1 基因捕獲法 2.2.2 基因捕獲法的優(yōu)缺點(diǎn) 2.3 其它基因敲除技術(shù)2.1.1基因同源重組法敲除靶基因的基本步驟a 基因載體的構(gòu)建：bES 細(xì)胞的獲得同源重組：選擇篩選已擊中的細(xì)胞：表型研究：f得到純合體：由嵌合體得到基因敲除的純合體小鼠B, BamHI在CH12 B細(xì)胞系中敲除XRCC1基因的策略 PuroXRCC1 野生型基因基因敲除質(zhì)粒同源短臂同源長(zhǎng)臂外顯子上游引物上游引物流動(dòng)引物流動(dòng)引物L(fēng)oxPLoxPPuroXRCC1敲除后基因型上游引物流動(dòng)引物L(fēng)oxPLoxP2.1.2 條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)

10、基因的修飾限制于小鼠某些特定類(lèi)型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法利用CreLoxP實(shí)現(xiàn)靶基因的切除原理 利用CreLoxP 和來(lái)自酵母的FLPfrt 系統(tǒng)條件性基因敲除的基因重組及切除步驟 2.1.4 同源重組基因敲除缺點(diǎn)( 1)操作復(fù)雜, 實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng), 費(fèi)用偏高;( 2)在敲除過(guò)程中, 被破壞的常常只是靶基因的部分外顯子而并不是整個(gè)編碼區(qū), 殘留的編碼序列有可能組合出新的未知的功能, 這將給表型分析帶來(lái)麻煩; ( 3)對(duì)于某些必需基因, 敲除后會(huì)造成細(xì)胞死亡, 也就無(wú)法研究這些必需基因的功能; ( 4)由于基因功能上的冗余, 敲掉一個(gè)基因并并不能造成容易識(shí)別的表型, 基因家

11、族的其他成員可以提供同樣的功能; ( 5)同一個(gè)打靶載體在不同遺傳背景下進(jìn)行基因敲除,獲得的表型差異很大?？偟膩?lái)說(shuō), 基因敲除小鼠模型的建立周期長(zhǎng)、技術(shù)含量高、風(fēng)險(xiǎn)性大。至今國(guó)內(nèi)外仍沒(méi)有在基因打靶方面取得突破性進(jìn)展使得此技術(shù)能夠滿(mǎn)足快速化、高通量研究基因功能的要求。2.2 利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除原理： 此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù)，然后通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉(zhuǎn)率病毒可用于動(dòng)植物細(xì)胞的插入；對(duì)于植物細(xì)胞而言農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DN

12、A轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子比較常用；噬菌體可用于細(xì)菌基因敲除。 需要敲除的靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯出活性蛋白 2.2.1 基因捕獲法基因捕獲法是最近發(fā)展起來(lái)的利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除的新型方法?；虿东@法的基本原理圖 2.2.2 基因捕獲法的優(yōu)缺點(diǎn)利用基因捕獲可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的 ES 細(xì)胞庫(kù)，節(jié)省大量篩選染色體組文庫(kù)以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用，更有效和更迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析。 缺點(diǎn)是無(wú)法對(duì)基因進(jìn)行精細(xì)的遺傳修飾。 2.3 RNAi由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達(dá)，并且這種效應(yīng)可以傳遞到子代細(xì)胞中。近年來(lái)，越來(lái)越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡(jiǎn)單方便的方法。RNAi阻斷基因

13、表達(dá)的機(jī)理圖、：雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面雙鏈RNA還能在RdRP（以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶RNA directed RNA polymerase，RdRP）的作用下自身擴(kuò)增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。 ：siRNA的雙鏈解開(kāi)變成單鏈，并和某些蛋白形成復(fù)合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復(fù)合物形成的蛋白。：上述復(fù)合物同與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈。結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dic

14、er酶的作用下也被裂解成siRNA。：這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過(guò)這個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對(duì)基因表達(dá)的抑制。從21到23個(gè)核苷酸的siRNA到幾百個(gè)核苷酸的雙鏈RNA都能誘發(fā)RNAi，但長(zhǎng)的雙鏈RNA阻斷基因表達(dá)的效果明顯強(qiáng)于短的雙鏈RNA。 2.3.2 RNAi的優(yōu)缺點(diǎn)contentsCRISPR-Cas9 System3.基因敲除技術(shù)的應(yīng)用及缺陷基因敲除技術(shù)的應(yīng)用及缺陷建立生物模型。建立生物模型。在基因功能，代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要?；蚯贸夹g(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進(jìn)行相關(guān)的研究。這些模型可以

15、是細(xì)胞，也可以是完整的動(dòng)植物或微生物個(gè)體。最常見(jiàn)的是小鼠，家兔、豬、線(xiàn)蟲(chóng)、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見(jiàn)于報(bào)道。. .疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療。疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療。通過(guò)基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對(duì)機(jī)體的影響。這無(wú)論是對(duì)了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標(biāo)都有重大的意義。 . .提供廉價(jià)的異種移植器官。提供廉價(jià)的異種移植器官。眾所周知，器官來(lái)源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素，而大量廉價(jià)的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。這是因?yàn)楫愒瓷锏幕驎?huì)產(chǎn)生一些能引起人體強(qiáng)烈免疫排斥的異源分子，如果能將產(chǎn)生這些異源分子的基因敲除，那么動(dòng)物的器官將

16、能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來(lái)具大的福音。如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在豬的體細(xì)胞中用基因敲除技術(shù)敲除了1，3GT 基因。使每只豬都缺乏產(chǎn)生a半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的個(gè)拷貝。這些酶在細(xì)胞表面產(chǎn)生一種糖分子，人體的免疫系統(tǒng)可以立即辨認(rèn)出這種糖分子為異源性，從而引發(fā)超急性免疫排斥反應(yīng)。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應(yīng)即不會(huì)再發(fā)生。. . 免疫學(xué)中的應(yīng)用。免疫學(xué)中的應(yīng)用。同異源器官移植相似，異源的抗體用于人體時(shí)或多或少會(huì)有一定的免疫排斥，使得人用抗體類(lèi)藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用受阻。而如果將動(dòng)物免疫分子基因敲除，換以人的相應(yīng)基因，那么將產(chǎn)生人的抗體，從而解決人源抗體

17、的生產(chǎn)問(wèn)題。 改造生物、培育新的生物品種。改造生物、培育新的生物品種。細(xì)菌的基因工程技術(shù)是本世紀(jì)分子生物學(xué)史上的一個(gè)重大突破，而基因敲除技術(shù)則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。它為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術(shù)支持?；蚯贸夹g(shù)的缺陷 CRISPR/Cas9 Targeted genome editingAnd many others“Genome editing has never been easier”CRISPR/Cas 系統(tǒng) CRISPR/Cas 系統(tǒng)是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識(shí)別，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫

18、。 CRISPR/Cas 系統(tǒng)是細(xì)菌針對(duì)噬菌體等外源基因的獲得性免疫系統(tǒng)。CRISPRClustered regularly interspaced short palindromic repeats (規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù))。CRISPR/CasCRISPR-associated 。Cas（CRISPR associated）： 存在于存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，核酸酶，能在能在guide RNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。CRISPR/Cas 系統(tǒng)分類(lèi) CRISPR 位點(diǎn)通常由短的高度保守的不連續(xù)的同位點(diǎn)通常由短的高度保守的不連續(xù)的同向重復(fù)和及其間隔著的大小與之相近的非重復(fù)間區(qū)序向重復(fù)和及其間隔著的大小與之相近的非重復(fù)間區(qū)序列（列（spacer）組成。重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常）組成。重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常 2148 bp, 重復(fù)序列之間被重復(fù)序列之間被 2672 bp的的spacer隔開(kāi)。隔開(kāi)。 CRISPR就是通過(guò)這些就是通過(guò)這些spacer與靶基因進(jìn)行識(shí)別。與靶基因進(jìn)行識(shí)別。CRISPR-Cas主要由兩部分組成：主要由兩部分組成：CRISPR/Cas 主要結(jié)構(gòu) CRISPR-Cas系統(tǒng)識(shí)別靶序列的要求： PAM（protospacer-adjacent motif）為