RNAi技術(shù)的發(fā)展

1、RNAi技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展生命學(xué)院2010級生命基地班喻曙光。RNAi( RNA interference)，即RNA干擾是由與靶基因同源的內(nèi)源或外源雙鏈RNA( double stranded RNA, dsRNA )所引發(fā)的一種在動植物中普遍存在的基因沉默現(xiàn)象。它最早在植物體中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已發(fā)展成為一 種生物技術(shù)，并成為了后基因時代的重要研究手段。對RNAi技術(shù)在生物基礎(chǔ)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和植物學(xué)等領(lǐng) 域的研究成果進(jìn)行綜述。RNAi的發(fā)現(xiàn)1989年，Matzke等門首次報(bào)道了啟動子介導(dǎo)的序列同源性基因共轉(zhuǎn)染煙草，可引起轉(zhuǎn)基 因表達(dá)發(fā)生沉默的現(xiàn)象。1990年，Napoli等把已知色素基因置于強(qiáng)啟動

2、子后，導(dǎo)入矮 腳牽?；ㄖ校噲D加深牽?；ǖ念伾?，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)花的顏色全部或部分變白。該現(xiàn)象在當(dāng)時 被稱為“共抑制”(co-suppression)，即導(dǎo)入基因后，該基因和牽牛花內(nèi)源的著色基因都 被抑制了。1995年，康奈爾大學(xué)的Guo等嘗試用反義RNA去阻斷線蟲的par-1基因表 達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義RNA的確能阻斷目的基因的表達(dá)，但作為對照的正義RNA，雖不能與活 性RNA結(jié)合，也照樣能引發(fā)抑制。1998年，F(xiàn)ire4將雙鏈RNA( dsRNA)正義鏈與反義鏈的混合物注入線蟲后，結(jié)果出現(xiàn)了比單獨(dú)注入單鏈要強(qiáng)得多的沉默，并且導(dǎo)致子一代 同源基因的沉默。這種現(xiàn)象被稱為“RNA干擾”(即RNAi，RNA

3、 interference) o同時， 這也是人們第一次對RNAi技術(shù)的應(yīng)用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi現(xiàn)象在多種生物中存在， 如線蟲、果蠅、斑馬魚、真菌以及植物等，生物體可利用RNAi來抵御病毒的感染，阻 斷轉(zhuǎn)座子的作用5。RNAi 的定義目前對RNAi的定義有很多種，不同的資料對其定義的側(cè)重點(diǎn)也不盡相同，如果將RNAi看 作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義:(1) RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的、由特定酶參與的特 異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)(2) RNAi是 有dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象，具有核苷酸 序列特異性的

4、自我防御機(jī)制，是一種當(dāng)外源基因?qū)牖虿《救肭趾?，?xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵 病毒RNA同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。RNAi這種現(xiàn)象已被證實(shí)在植物中廣泛存 在，它可能是生物的發(fā)育調(diào)控及抗外源或內(nèi)源侵染的一種普遍機(jī)制。2002年，該發(fā)現(xiàn)被 Science雜志評為十大科技突破之一。如果將其作為一門生物技術(shù)，則可以定義為:(1) RNAi 是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象，它通過人為地 引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(正義RNA和反義RNA)，從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基 因的mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的;(2) RNAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的dsRNA

5、在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與之同源的mRNA降解成21 - 23 nt的小片段，使相應(yīng)的基因沉默 的技術(shù);(3) RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞，特異性地降解該 mRNA，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的技術(shù)，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptional genesilence， PTGS)。各種不同定義雖然說法不同，但所描述的事 實(shí)是大體相同的，即RNAi就是指由dsRNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象。RNAi 的分子機(jī)制目前研究認(rèn)為，RNAi的過程可能包括起始和效應(yīng)兩個階段。在起始階段，加入的小分子RNA 被切割為21 23 nt 長的小分子干擾RNA 片段(s

6、mall interfering， RNAs， siRNAs)，其中一個稱為Dicer的酶，是RNaseH家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙 鏈RNA，將RNA降解為19 - 21 bp的雙鏈RNAs( siRNAs)，每個片段的3端都有2個堿 基突出。在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉 默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex， RISC) 。激活RISC 需要一個ATP 將小分 子RNA解雙鏈的過程，激活的RISC通過堿基配對定位到同源mR

7、NA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離 siRNA 3端12個堿基的位置切UmRNA6j。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個RISC都 包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。另外，還有研究表明，含有啟動子區(qū)的 dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21 -23 nt長的片段，這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA 序列甲基化，從而使啟動子失去功能，使其下游基因沉默。4 RNAi技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀近年來，作為一種高效、特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，RNAi技術(shù)發(fā)展迅速，在生物學(xué)基礎(chǔ)、 醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和植物學(xué)等很多領(lǐng)域的研究均得到較大發(fā)展。4. 1 RNAi在基礎(chǔ)學(xué)方面的研究4. 1. 1真核細(xì)胞基因功能的研究隨著基因測序

8、技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，果蠅、線蟲、 水稻、小鼠和人類基因組測序已經(jīng)完成，而基因功能的研究步伐卻相對緩慢。與傳統(tǒng)的基因 功能研究方法(如基因敲除、反義RNA技術(shù)等)相比，RNAi技術(shù)是一種高效、特異、快捷 和成本相對低廉的基因功能研究手段。利用RNAi技術(shù)，可以在RNA水平部分阻斷某基因 的表達(dá)，獲得功能性喪失，進(jìn)一步研究相關(guān)基因的功能。Dunn等刃利用RNAi技術(shù)針對 海葵肌動蛋白和半胱氨酸蛋白酶這兩個基因，用原位雜交的方法證實(shí)這兩個基因的表達(dá)均受 到抑制，進(jìn)而研究該基因的功能。4. 1. 2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究利用RNAi技術(shù)可以容易地確定復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基 因的上下游關(guān)系及其作

9、用。James等應(yīng)用RNAi技術(shù)研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素的信號 傳導(dǎo)途徑，取得了與已知胰島素信號通路完全一致的結(jié)果。另外，基因組范圍的RNAi表型 篩選已成為研究基因在特殊細(xì)胞功能和生物活性中作用的一種有效方法，但對于相關(guān)基因之 間的相互關(guān)系還是不能確定。4. 1. 3其他基礎(chǔ)研究除了以上兩個主要應(yīng)用方面外，RNAi技術(shù)還被應(yīng)用于生理學(xué)、生長發(fā) 育過程等方面的基礎(chǔ)研究中。Palmer等利用RNAi技術(shù)進(jìn)行動物細(xì)胞離子通道生理學(xué)的 研究和應(yīng)用。4. 2 RNAi在醫(yī)學(xué)方面的研究4. 2. 1利用RNAi建立疾病模型傳統(tǒng)的建立人類疾病動物模型是利用基因敲除和Cre-LoxP systems方法，但

10、是如果目的基因是小鼠發(fā)育必需基因的話，這些方法就會受到很大的限制。 RNAi技術(shù)將是建立轉(zhuǎn)基因動物模型的新的工具，隨著該技術(shù)的發(fā)展，它可以通過使組織特 異的基因功能滅活，不再需要條件定向小鼠和組織特異重組小鼠，因而轉(zhuǎn)基因動物將是使用 更加廣泛的生物研究工具10。遺傳基因工程小鼠已被廣泛用于建立人類癌癥模型，模型小鼠模擬人類癌癥相應(yīng)的形態(tài)學(xué)，組織病理學(xué)、表型和基因型。這樣的疾病模型 對于分析特殊癌癥基因和修飾基因的作用、評價(jià)常規(guī)癌癥治療和新藥、鑒定癌癥腫瘤生長標(biāo) 記、分析腫瘤微環(huán)境對腫瘤形成的影響、定義潛伏期和腫瘤發(fā)展分期等都優(yōu)于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因的疾病模型。目前，乳腺、胰腺、腸、結(jié)腸和前列腺癌癥的基

11、因工程小鼠 模型已經(jīng)構(gòu)建，而腦、卵巢、頸和皮膚癌癥模型正處于研究的初期階段11O RNAi除了被 用于建立癌癥疾病模型外，也用于其他疾病模型的建立和保護(hù)方面。Shcherbata等12利用 遺傳和RNAi誘導(dǎo)果蠅細(xì)胞激化和肌營養(yǎng)不良表型Kim等13構(gòu)建重組體慢病毒將shRNAs 定向轉(zhuǎn)移到保守的柯薩奇腸道病毒序列中，用于防治病毒性心肌炎，提高病毒性心肌炎動物 模型的成活率。但是利用RNAi建立的疾病動物模型的性狀持續(xù)時間不太長，而且不一定能 被穩(wěn)定遺傳，還有其他問題有待繼續(xù)研究。4. 2. 2 RNAi抗病毒治療目前，RNAi在抗病毒中的研究主要是設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA,誘發(fā)特異的mRNA降解，

12、從而發(fā) 揮有效的抗病毒作用。美國麻省理工大學(xué)(MIT)的Novina最早開展了利用RNAi抗HIV的 研究，開啟了利用RNAi治療病毒性疾病的先河。隨后，又有學(xué)者參與到這個研究中來，他 們針對HIV生活周期的不同階段設(shè)計(jì)了多種siRNA，針對HIV病毒gag、tat、rev和nef等 基因的siRNA可用以控制病毒復(fù)制。研究證實(shí)針對病毒基因組的gag區(qū)域的siRNA可以有 效的將病毒的基因“沉默”，抑制HIV病毒的復(fù)制能力13 15 16】。此外，還有人開展了RNAi 針對其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等的作用的研究，如用脊 髓灰質(zhì)炎病毒基因組的siRNA處理人類和鼠

13、的細(xì)胞，可明顯減少子代病毒的數(shù)量，并能促 進(jìn)病毒從感染細(xì)胞中清除的速度17。4. 2. 3 RNAi在腫瘤治療中的研究1、RNAi技術(shù)具有高效沉默特定靶基因的特點(diǎn)，在確定單個基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用 以及探索腫瘤的基因治療方面是一種強(qiáng)有力的研究工具，因此其應(yīng)用十分廣泛。原癌基因的 活化和/或抑癌基因的失活會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，基于RNAi技術(shù)在單基因研究中的優(yōu)勢，利 用RNAi抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)的癌基因和抑癌基因的功能表達(dá)，分析其表型變化，有利于揭示腫 瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，從而為腫瘤的診斷和治療提供標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。Wang等函用 RNAi干擾HeLa細(xì)胞中CML66的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞的增殖

14、、侵襲和轉(zhuǎn)移能力受抑，進(jìn) 一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)CML66表達(dá)受抑后cathepsin L、MMP15、uPAR、VEGF、COX-2、S100A4、MUC1、MDM2 和RAC1均下調(diào)，從而推斷出CMI 66作為致癌基因通過多途徑促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。應(yīng)用RNAi技術(shù)對腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制及有關(guān)基因的 改變進(jìn)行研究，有助于加深理解惡性腫瘤的生物學(xué)本質(zhì)。Shin等19通過RNAi技術(shù)敲除 eaveolin-1表達(dá)，從而調(diào)節(jié)血管細(xì)胞黏附分子1( VCAM-1)的表達(dá)，使得依賴于VCAM-1的 腫瘤細(xì)胞的黏附顯著受抑;Tsuchiya等20通過RNAi制備Id1、Id3( Inhibitor

15、 of DNA binding proteins，Id)雙倍敲除的胃癌細(xì)胞系MKN45,證實(shí)Id1、Id3的敲除顯著抑制胃癌細(xì)胞腹膜 轉(zhuǎn)移。Jiang等知通過RNAi抑制MDA-MB-231和MCF-7 中MTA1基因的表達(dá)，從而下 調(diào)ERa的表達(dá)，結(jié)果使這兩株乳腺癌細(xì)胞的侵襲活性下降。另外，Wang等22設(shè)計(jì)了針 對目前所知的最強(qiáng)的凋亡抑制因子生存素(survivin )表達(dá)的RNAi，導(dǎo)入人食管鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系KYSE510中，證實(shí)下調(diào)survivin可以強(qiáng)烈抑制體內(nèi)和體外癌細(xì)胞生長，推 測這種抑制可能是通過誘導(dǎo)凋亡的增強(qiáng)。該研究可加深對食管癌發(fā)生機(jī)制的了解，而且說明 survivin

16、可能是治療食管癌潛在的靶位點(diǎn)，RNAi具有潛在的治療價(jià)值。目前國內(nèi)利用RNAi 抑制survivin的表達(dá)在胰腺癌、宮頸癌、肺癌、大腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞癌、骨肉瘤細(xì)胞和白血 病細(xì)胞中均有研究，不過大部分還停留在體外研究階段。4. 3 RNAi在藥學(xué)方面的研究利用RNAi進(jìn)行藥物研究利用RNAi能夠特異高效地抑制基因表達(dá)，獲得去基因功能表型， 能夠在短時間內(nèi)大規(guī)模篩選靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞水平和動物水平篩選藥靶和評定藥靶 *。Hamamichi24利用RNA干擾，系統(tǒng)屏蔽帕金森病模型中將近900個候選基因和通路， 找到了兩個帕金森病遺傳易感性位點(diǎn)和治療靶點(diǎn)，從而為該疾病的治療奠定基礎(chǔ)。RNAi在 被

17、廣泛應(yīng)用于功能基因組研究確定了大量潛在的藥物作用靶點(diǎn)的同時，也被證實(shí)其作為 新一代基因治療藥物的可能性。2006年，美國Acuity制藥公司生產(chǎn)的用于治療濕性老年黃 斑病變的RNAi藥物Bevasiranib在RNAi臨床試驗(yàn)方面取得成功，它在療效、安全性方面都優(yōu)于常規(guī)藥物。除Acuity制藥公司外，另有兩家公司也在進(jìn)行RNAi藥物的開發(fā)， 一是Alnylam Pharmaceuticals，他們開發(fā)的RNAi藥物用來治療呼吸道合胞病毒、流行性 感冒、帕金森病和高膽固醇血癥等二是Sirna Therapeutics，他們開發(fā)治療ADM的RNAi 藥物Sirna-027已經(jīng)進(jìn)入1期臨床。其他方面

18、的應(yīng)用如治療Huntington病和哮喘以及COPD 也進(jìn)入臨床前研究階段。但是RNAi藥物仍存在如給藥途徑、使用安全性等方面的問題。4. 4 RNAi在植物學(xué)方面的研究RNAi現(xiàn)象首先是在植物研究中發(fā)現(xiàn)的，因此RNAi技術(shù)在植物方面的應(yīng)用研究也比較深 入，包括植物功能基因組的研究、植物生長發(fā)育的研究、植物抗病性方面的研究和植物改良 方面的研究等多個領(lǐng)域25】。4. 4. 1植物功能基因組的研究隨著后基因組時代的到來，人們越來越需要大規(guī)模、高通量地 研究基因的功能。由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使某些 基因沉默，從而獲得功能喪失或降低突變。因此，它可以作為研究基因

19、組學(xué)的一種有效工具。 在2002 年11 月，歐洲第五計(jì)劃（the Arabidopsisgenomic RNAi knock-out line analysis， AGRIKOLA）就已準(zhǔn)備用RNAi技術(shù)來研究擬南芥所有基因（約25 000個）的功能，方法是利 用擬南芥所有基因片段構(gòu)建組成型和誘導(dǎo)型RNAi載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥獲得4 000多個組成型hpRNA植株26。另外，Travella等在構(gòu)建的PDS-RNAi和EINIRNAi 的六倍體小麥轉(zhuǎn)基因作物中，成功地抑制了目的基因。Lawrence等也曾用擬南芥著絲 點(diǎn)甲基化相關(guān)的dsRNA，對擬南芥的四倍體進(jìn)行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)擬

20、南芥的四倍體中對應(yīng)的 與甲基化有關(guān)的mRNA含量水平劇減。這些都可以證明RNAi技術(shù)是多倍體植物功能缺失 突變很好的工具。4. 4. 2植物生長發(fā)育及新品種培育的研究雄性不育是高等植物生命活動的一個常見現(xiàn)象，在農(nóng)業(yè)上有巨大的應(yīng)用價(jià)值。Cigan等皿】利用 RNAi技術(shù)直接沉默玉米的花粉囊基因表達(dá)的啟動子MS45,從而抑制花粉囊的形成，形成 玉米的雄性不育株。利用RNAi技術(shù)可以創(chuàng)造一些優(yōu)良的不育材料。Moritoh等或觀察 OSGEN-L-RNA的水稻植株，發(fā)現(xiàn)一部分育性很低，一部分水稻雄性不育，找到了水稻的 雄性不育材料。經(jīng)濟(jì)作物的作用成分含量增加或降低，可以提高作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和利用效率。

21、張銀波等甲利用RT-PCT技術(shù)克隆了油菜PEP基因片段并構(gòu)建了對應(yīng)于PEPASE基因 的RNAi載體，以利用RNAi技術(shù)抑制PEPASE基因的表達(dá)，使代謝流偏向油脂合成，從 而提高油菜籽粒中的油脂含量。另外，還有采用果實(shí)特異啟動子結(jié)合RNAi技術(shù)抑制番茄內(nèi) 源光形態(tài)，建成調(diào)節(jié)基因DET的表達(dá)，結(jié)果使再生植株中DET1的表達(dá)下降，類胡蘿卜和 類黃酮含量明顯升高，而果實(shí)的其他品質(zhì)參數(shù)沒有發(fā)生大的改變。這些均表明利用器官特異 基因的沉默可以改善植物營養(yǎng)價(jià)值。另外，Shinjiro等勿利用RNAi技術(shù)對控制咖啡因合 成的基因進(jìn)行抑制，使材料中的咖啡因含量降低了50% - 70%。RNAi技術(shù)可針對植物的 一些表型進(jìn)行改良，這為人們生活增添了許多樂趣，也增加了一些植物更多經(jīng)濟(jì)價(jià)值；從另 一層次來說，該技術(shù)豐富了植物的品種，尤其是對花卉品質(zhì)的改良。日本生物研究所使用 RNAi