文心蘭PLC基因家族鑒定及其應(yīng)答軟腐菌侵染轉(zhuǎn)錄模式

1、應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào) Chin J Appl Environ Biol Doi: 10.19675/ki.1006-687x.2020.11061收稿日期 Received: 2020-11-29 接受日期 Accepted: 2021-05-04福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（KLA19009A）、福建省重大農(nóng)業(yè)科技專項(xiàng)（No.2015NZ0002-1）和福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新基金（KF2015108）資助 Supported by Young and middle-aged teacher education research project of Fujian (KLA19009A), Maj

2、or agricultural science and technology project of Fujian (No.2015NZ0002-1), and Science and Technology Innovation Fund of FAFU, China (KF2015108).*通訊作者 Corresponding author (E-mail: L)文心蘭PLC基因家族鑒定及其應(yīng)答軟腐菌侵染轉(zhuǎn)錄模式林爭春 倪珊珊 張春渝 吳秋楨 張舒婷 張梓浩 林玉玲 賴鐘雄*福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所 福州 350002摘 要 磷酸肌醇信號(hào)途徑廣泛參與生物體內(nèi)多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，P

3、LC是該信號(hào)途徑中的關(guān)鍵酶，在植物先天性免疫反應(yīng)中起核心作用。為鑒定文心蘭PLC基因家族成員、了解成員特征及其在應(yīng)答軟腐病菌侵染過程中的表達(dá)模式，基于南茜文心蘭應(yīng)答軟腐病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化特征、保守氨基酸序列、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及在文心蘭感病過程中的表達(dá)模式（RPKM值）進(jìn)行分析。共鑒定得到9個(gè)文心蘭PLC基因家族成員，其編碼蛋白的長度在332-600 aa，分子量約為36.92-68.44 kD，等電點(diǎn)介于5.42-8.50，均屬于不穩(wěn)定親水蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，文心蘭PLC蛋白在過氧化物酶體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒

4、體中均有分布。根據(jù)進(jìn)化樹和保守基序分析，文心蘭PLC蛋白可分為PI-PLC和NPC 2個(gè)亞族，包含18個(gè)保守基序。String構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，PLC家族成員可能與PTEN3、PIP5K、PIS1以及G蛋白存在互作關(guān)系。RNA-seq表達(dá)量分析表明，9個(gè)文心蘭PLC家族基因在南茜文心蘭不同感病時(shí)期（12 h和36 h）有明顯不同的表達(dá)規(guī)律。其中，OhNPC1、OhPLC3以及OhPLC5在病原菌侵染初期與后期均顯著上調(diào)表達(dá)，OhPLC4和OhPLC6在病原菌侵染后期顯著上調(diào)表達(dá)，說明OhNPC1、OhPLC3、OhPLC4、OhPLC5和OhPLC6可能在文心蘭抵御軟腐菌侵染過程中發(fā)揮重要

5、作用。（圖8 表5 參50）關(guān)鍵詞 文心蘭；PLC；基因家族鑒定；軟腐菌；表達(dá)分析Identification of the PLC gene family of Oncidium hybridum and transcriptional patterns in response to soft rot infection LIN Zhengchun, NI Shanshan, ZHANG Chunyu, WU Qiuzhen, ZHANG Shuting, ZHANG Zihao, LIN Yuling & LAI Zhongxiong*Institute of Horticultural

6、Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, ChinaAbstract Phospholipid signaling has been found to play a significant role in regulating various cellular processes, including plant growth and development as well as in response to stresses. Phospholipase C (PLC) is one o

7、f the major components of the phospholipid signaling network, implicated in plant innate immunity. Here we sought to identify genes in the PLC family and investigate the characteristics of PLC members and their expression patterns at different time points after infected with soft rot pathogen in O.

8、hybridum. Bioinformatics approaches were used to identify genes in the PLC family based on the transcriptome data of O. hybridumGower Ramsey at three different time points 0, 12, and 36 h post inoculation (HPI) with soft rot pathogen. Additionally, protein physical and chemical properties, subcellul

9、ar localization, secondary structure, phylogeny, protein conserved domains, interacting protein, and the expression pattern of the OhPLC members were analyzed. The results showed that 9 OhPLC genes were identified, which comprised 332 to 600 amino acids in length, with predicted molecular weights va

10、rying from 36.92 to 68.44 and theoretical isoelectric points ranging from 5.42 to 8.50. All of these were predicted to be unstable hydrophilic proteins, and they were localized in the peroxisome, nucleus, cytoplasm, chloroplast and mitochondrion. According to the phylogenetic and motif analysis, OhP

11、LCs have eighteen conserved motifs, which could be divided into phosphoinositide-specific PLCs (PI-PLCs) and non-specific PLCs (NPCs) classes with six and three members, respectively. Moreover, protein interaction analysis revealed that PLC family members may interact with PTEN3, PIP5K, PIS1 and G p

12、rotein. Transcript profiling showed that three genes (OhNPC1, OhPLC3, OhPLC5) were up-regulated during different pathogen infection stages, and two genes (OhPLC4, OhPLC6) showed a higher expression pattern at 48 HPI. Those findings suggest an important role of different OhPLC members in response to

13、soft rot infection, which provides reference for elucidating the biological functions of OhPLCs. Keywords Oncidium hybridum; PLC; identification of gene family; soft rot; expression analysis 磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）是磷脂酰肌醇信號(hào)通路的關(guān)鍵酶，在植物細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，PLC及其產(chǎn)物發(fā)揮著重要的媒介作用1-2。研究證實(shí)，PLC及其水解產(chǎn)物二酰甘油（diacylglycerol，DA

14、G）和三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3），以及代謝產(chǎn)物磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、二?；视徒沽姿幔╠iacylglycerol pyrophosphate，DGPP）和六磷酸肌醇（inositol 1,2,3,4,5,6-trisphosphate，IP6）在植物的抗病防御反應(yīng)中扮演重要角色，為脂質(zhì)作為第二信使提供依據(jù)3-6。根據(jù)作用底物的不同，磷脂酶C又可以分為磷脂酰肌醇特異PLC（phosphoinositide-specific PLC，PI-PLC）和非特異PLC（non-specific PLC，NPC）7。PI-

15、PLC是一種Ca2+依賴的酶，其水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（phosphatidyl inositol-4,5-bisphosphate，PIP2）產(chǎn)生DAG和磷酸化肌醇的過程中需要Ca2+的參與8-10。植物PI-PLC型蛋白通常具有EF手型、C2、X和Y結(jié)構(gòu)域11，其N端的EF手型結(jié)構(gòu)域具有典型的與Ca2+相結(jié)合螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)，能調(diào)控呼吸爆發(fā)氧化酶同系物蛋白D（Respiratory burst oxidase homolog protein D，RbohD）的活性12；C端是由大約120個(gè)氨基酸殘基組成的C2結(jié)構(gòu)域13，既能介導(dǎo)跨膜蛋白靶向性11,14，又可與Ca2+結(jié)合激活細(xì)

16、胞內(nèi)PI-PLC的活性15；位于EF手型和C2結(jié)構(gòu)域之間的X和Y催化結(jié)構(gòu)域是PI-PLC結(jié)構(gòu)中最保守的2個(gè)結(jié)構(gòu)域，當(dāng)?shù)鞍渍郫B后，這兩個(gè)部位會(huì)組成催化活性中心，形成TIM桶型結(jié)構(gòu)16。與PI-PLC不同的是，植物NPC型蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單，多數(shù)NPC蛋白在N端都含有1個(gè)信號(hào)肽17，信號(hào)肽后連接的是一段短的可變區(qū)域和1個(gè)磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域18，具有典型的酯酶活性，主要水解磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）、磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline，PC）和磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol，PG）形成DAG和相應(yīng)的磷酸鹽，且水解過程不

17、需要Ca2+的參與19-20；C端的50-100個(gè)氨基酸序列是其最分散的部位，不同的NPC成員具有不同的長度和保守序列，進(jìn)而具有不同的功能21。Pokotylo等的研究發(fā)現(xiàn)，磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域中開頭部位的ENRSFDxxxG、中間部位的TxPNR和DExxGxxDHV及尾部的GxRVPxxxxxP保守基序?qū)PC催化活性至關(guān)重要18。 隨著眾多生物基因組與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序項(xiàng)目的完成，PLCs已成為磷脂酰肌醇信號(hào)通路研究的熱點(diǎn)方向之一。目前，PLC基因家族的鑒定與分析已在多種植物中展開，如擬南芥19、水稻22、番茄23、玉米24、棉花25、亞麻芥26、蓖麻27、桃28、楊樹29、蝴蝶蘭30等。擬南芥PLC

18、基因家族共有14個(gè)成員，包含9個(gè)PI-PLC亞家族成員和5個(gè)NPC亞家族成員19。AtNPC2參與擬南芥對(duì)丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）侵染的響應(yīng)，該病原菌的刺激會(huì)使AtNPC2的轉(zhuǎn)錄水平降低5；馬文文等的研究表明，當(dāng)擬南芥遭受丁香假單胞菌侵染時(shí)，AtPLC5的RNA和蛋白表達(dá)量均顯著上升，引起植物的免疫反應(yīng)31，說明不同的PLC亞型在植物的防御反應(yīng)中是有差別的。另有證據(jù)顯示擬南芥NPC家族成員在植物防御反應(yīng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用20。水稻中鑒定出9個(gè)PLC家族成員，包含4個(gè)PI-PLC亞家族成員和5個(gè)NPC亞家族成員32。Song和Goodman的研究證實(shí)了OsPLC

19、1調(diào)控Ca2+信號(hào)通路參與水稻的免疫信號(hào)傳導(dǎo)途徑33。對(duì)番茄PLC基因家族的研究發(fā)現(xiàn)，PI-PLC 2/4/6均參與抗病調(diào)控，過表達(dá)番茄SlPLC4基因會(huì)引發(fā)煙草對(duì)Avr4/Cf-4介導(dǎo)的過敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）34；過量表達(dá)SlPLC6基因提高煙草植株對(duì)黃萎病的抗性34；SlPLC2對(duì)HR具有負(fù)調(diào)控作用，其沉默轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)灰霉病侵染的抵抗能力較對(duì)照明顯增強(qiáng)4。上述研究表明，PLCs在植物應(yīng)答病原菌侵染信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但目前關(guān)于文心蘭PLC（OhPLC）基因家族的研究尚未見報(bào)道。文心蘭（Oncidium hybridum）又名跳舞蘭

20、，為蘭科文心蘭屬多年生草本植物，是一種觀賞價(jià)值很高的洋蘭，被廣泛用作切花材料和盆栽觀賞35。在我國福建、廣東、海南等多個(gè)省份，夏季多為高溫高濕天氣，軟腐病是文心蘭栽培過程中的一種主要病害，嚴(yán)重阻礙了文心蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展36-37。本研究基于南茜文心蘭應(yīng)答軟腐病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)OhPLC家族基因進(jìn)行篩選和鑒定，并分析各個(gè)成員在不同感病階段中的表達(dá)模式，為今后開展OhPLC家族基因的分離與抗病功能的驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料供試軟腐病菌胡蘿卜歐文式桿菌（Pectobacterium carotovorum pv. carotovora）和南茜文心蘭（O. hy

21、bridumGower Ramsey）植株均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。隨機(jī)選擇生長良好且高度和長勢(shì)較為一致的組培移栽苗（1年）做試驗(yàn)材料進(jìn)行25 恒溫培養(yǎng)，15 d后取出，以制備好的軟腐病菌液（OD600=0.6）針刺接種假鱗莖，并置于濕度為70%-80%，光強(qiáng)為2 000 lx，光周期為12 h光照、12 h黑暗（與自然光周期一致），36 的人工氣候箱中。按照處理時(shí)間分別收集放置在培養(yǎng)箱中處理12 h（輕度感?。┖?6 h（重度感?。┖蟮慕臃N假鱗莖部位上的第一片葉以及無菌水注射假鱗莖部位上的第一片葉（CK），立即用液氮速凍，放于-80 保存?zhèn)溆谩Ｋ袠悠肪O(shè)置3次重復(fù)，委托廣

22、州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建和Illumina（HiseqTM4000）測(cè)序。1.2 方法1.2.1 數(shù)據(jù)來源、基因鑒定與分析 南茜文心蘭應(yīng)答細(xì)菌軟腐病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由本實(shí)驗(yàn)室課題組獲得。根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)在NR、NT、Swiss-Prot和PFAM 4個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋的結(jié)果，利用關(guān)鍵詞“phospholipase C”進(jìn)行檢索，去除重復(fù)序列，初步篩選得到PLC家族候選基因。利用ORF Finder（/gorf/Gorf.html）查找候選基因序列的開放閱讀框、推測(cè)編碼氨基酸序列。進(jìn)一步通過在線軟件SMART（https:/smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)O

23、hPLC保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，并利用NCBI網(wǎng)站Blastlp（/Blast.cgi）搜索比較，去除不含有PLC家族特征結(jié)構(gòu)域的序列。模式植物擬南芥、水稻和玉米的PLC序列下載自NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫（/）。1.2.2 OhPLC家族蛋白理化特征及保守結(jié)構(gòu)域分析 利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的在線軟件ProtParam（/protparam/）預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)、分子量、平均親水系數(shù)和各氨基酸的組成。利用在線SOPMA軟件（https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）對(duì)OhPLC蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并采用Graph

24、Pad Prism 6.0軟件進(jìn)行制圖38。利用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https:/psort.hgc.jp/）進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。利用在線軟件Phobius（http:/phobius.sbc.su.se/）預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽。利用在線軟件NetPhos 2.0 Server（http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/）對(duì)PLC蛋白家族成員進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用Pfam在線網(wǎng)站（/）分析南茜OhPLC家族蛋白的結(jié)構(gòu)域，參數(shù)默認(rèn)，E-value=1.0，并采用TBtools軟件繪制蛋白結(jié)構(gòu)域圖。利用在線軟件MEME Suite 5.1

25、.0（/tools/meme）分析南茜OhPLC家族蛋白的保守基序，基序數(shù)目為20，其余參數(shù)為默認(rèn)值。1.2.3 OhPLC家族成員系統(tǒng)發(fā)育分析 采用MEGA5.0對(duì)文心蘭、擬南芥、水稻以及玉米4個(gè)物種的PLC家族成員采用MUSCLE進(jìn)行序列比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。選擇鄰接法（Neighbor-joining，NJ）并進(jìn)行1 000次自舉法（Bootstrap）分析，同時(shí)采用iTOL（https:/itol.embl.de/upload.cgi）在線工具進(jìn)行美化。1.2.4 OhPLC家族蛋白互作分析 選取擬南芥作為模式植物，利用STRING網(wǎng)站（/）對(duì)PLC家族成員進(jìn)行蛋白互作分析。1.2.5

26、 OhPLC家族基因的差異表達(dá)模式分析 基于南茜文心蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫提取的9個(gè)成員在不同感病階段的RPKM值（每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)目），采用Omicshare（/）在線工具繪制表達(dá)量熱圖。1.2.6 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR定量表達(dá)分析 采用OMEGA HP Plant RNA Kit試劑盒提取總RNA。采用TAKARA SYBR ExScript TM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得基因定量PCR的cDNA?；蛐蛄械膓PCR引物見表1。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照王培育等試驗(yàn)體系進(jìn)行39，采用2-CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。采用6.0版GraphPad Prism軟

27、件進(jìn)行繪圖。表1 引物信息Table1 Primer information引物名稱Primer name引物序列Primer sequence退火溫度Tm/延伸時(shí)間Extension time/s用途PurposeActin-FTTGAGCCGCGTCAATATCTCC6030qRT-PCR Actin-RTTGAGCCGCGTCAATATCTCOhNPC1-FCACGATCTGCTCCTCATCAA6030qRT-PCROhNPC1-RGGGTTGGCGTACGTAGAAGA6030qRT-PCR OhNPC2-FCTTCCTGCTCCAATCCAAA6030qRT-PCROhNPC2-R

28、CCGCCTTAAGTTGGATATTTGOhNPC3-FCTTAGTTCTCTCCGCCCACT6030qRT-PCROhNPC3-RATGACTTAAGCCAGCCGAGAOhPLC1-FGAATAATGGGCGAGAATGGA6030qRT-PCROhPLC1-RCCTGTTCCTCCCACTTACCAOhPLC2-FATTGTGATGGTGACGACGGT6030qRT-PCROhPLC2-RTTGCTCACTCAAACTAAGGCGOhPLC3-FTCACACGGGACTGACTTGGT6030qRT-PCROhPLC3-RTCAACCACAGTGACCTTCCATAOhPLC4-F

29、GTGAACAAGAACTTTCCAAGGC6030qRT-PCROhPLC4-RCCATAATGACCCTCCATAGCCOhPLC5-FCTCGAATTCCAGGCCTCAG6030qRT-PCROhPLC5-RTCGGATTGAAGTGCATGAGTOhPLC6-FGGAGATCGGCTAGGGTTTTC6030qRT-PCROhPLC6-RTCTCCATCCACCTCTCATCC2 結(jié)果與分析2.1 OhPLC基因家族成員的鑒定及蛋白特性為了鑒定南茜文心蘭應(yīng)答軟腐病菌侵染的PLC成員，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，經(jīng)過4個(gè)蛋白數(shù)據(jù)庫的注釋，初步篩選得到了19個(gè)PLC家族候選成員。通過分析比對(duì)，去除不

30、含PLC家族保守結(jié)構(gòu)域的基因，總共得到9個(gè)PLC家族成員。鑒定出來的OhPLC家族成員，按照所屬亞家族以及Unigene編號(hào)重新命名（表2），分別為OhNPC1（Unigene0022019）-OhNPC3（Unigene0040094）及OhPLC1（Unigene0002127）-OhPLC6（Unigene0034675）?；赑LC水解底物的不同，植物PI-PLC亞家族大多由EF手型結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)高度保守的催化結(jié)構(gòu)域（分別稱為X區(qū)和Y區(qū)）組成。文心蘭OhPLC3和OhPLC5均同時(shí)含有EF手型、C2、X區(qū)以及Y區(qū)4個(gè)結(jié)構(gòu)域，占據(jù)整個(gè)PLC家族的22.2%；OhPLC2和Oh

31、PLC4含有C2、X區(qū)、以及Y區(qū)3個(gè)結(jié)構(gòu)域，占基因家族總數(shù)的22.2%；而OhPLC1和OhPLC6僅含有X區(qū)1個(gè)結(jié)構(gòu)域。除此之外，文心蘭NPC亞家族成員均同時(shí)含有一個(gè)磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域，其中，OhNPC1和OhNPC2的N端存在一個(gè)典型的信號(hào)肽。表2 OhPLC家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域位置Table 2 The location of conserved domains in OhPLC family proteins轉(zhuǎn)錄組基因IDTranscriptome gene ID蛋白質(zhì)名稱Protein name信號(hào)肽Signal peptide磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域Phosphoesterase domainP

32、I-PLC-X結(jié)構(gòu)域PI-PLC-X domainPI-PLC-Y結(jié)構(gòu)域PI-PLC-Y domainC2結(jié)構(gòu)域C2 domainEF-hand_like結(jié)構(gòu)域EF-hand_likedomainUnigene0022019OhNPC11-2831-391Unigene0025025OhNPC21-2643-401Unigene0040094OhNPC34-371Unigene0002127OhPLC1104-197Unigene0022818OhPLC2112-254363-449472-571Unigene0023800OhPLC3111-253358-444486-56623-98Uni

33、gene0023801OhPLC41-143241-331374-454Unigene0025566OhPLC5106-248347-434474-55124-92Unigene0034675OhPLC697-188 對(duì)所鑒定的9個(gè)OhPLC家族蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行了更詳細(xì)地分析（表3），OhPLC蛋白質(zhì)序列的長度在332-600 aa之間；預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量（MW）最大為68.44 kD，最小為36.92 kD；等電點(diǎn)（pI）范圍為5.42-8.50，其中，等電點(diǎn)小于7的OhPLCs有6個(gè)，顯酸性，等電點(diǎn)大于7的OhPLCs有3個(gè)，顯堿性，OhPLCs等電點(diǎn)平均數(shù)小于7，說明其主要在亞細(xì)胞

34、為酸性的環(huán)境中發(fā)揮功能。此外，文心蘭9個(gè)PLC家族蛋白平均親水系數(shù)均小于0，在-0.494-0.194之間，均屬于親水性蛋白，其中親水性最強(qiáng)的是OhPLC5。 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：文心蘭OhNPC1和OhPLC2定位于細(xì)胞核，OhPLC1、OhPLC4以及OhPLC6定位于過氧化物酶體，OhNPC2和OhNPC3定位于葉綠體，OhPLC3和OhPLC5分別定位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。OhPLC家族蛋白在其亞細(xì)胞定位方面存在較大的差異，暗示著OhPLC家族成員功能上的復(fù)雜性。表3 OhPLC家族蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析Table 3 Physicochemical properties an

35、d subcellular localization of OhPLC family proteins基因Gene蛋白長度Protein length/aa等電點(diǎn)pI分子量molecule weight/KD平均親水性Grand average of hydropathicity亞細(xì)胞定位Subcellular localizationOhNPC15226.0758.13-0.401NuclearOhNPC25387.4660.45-0.366ChloroplastOhNPC34085.4245.90-0.390ChloroplastOhPLC13408.5038.02-0.268Peroxi

36、someOhPLC26006.0868.44-0.408NuclearOhPLC35935.5967.51-0.494CytoplasmOhPLC44835.7355.04-0.435PeroxisomeOhPLC55815.8466.78-0.517mitochondrionOhPLC63327.7836.92-0.194Peroxisome 比較OhPLC家族蛋白中各氨基酸的組成發(fā)現(xiàn)（圖1），pI大于7的蛋白，OhNPC2、OhPLC1和OhPLC6中堿性氨基酸分別達(dá)到了14.87%、14.11%和13.86%。3個(gè)OhNPC蛋白的各氨基酸組成中，含量最高的都是絲氨酸，所占的平均比例達(dá)到了

37、8%，其中，在OhNPC3中含量最高，達(dá)到了9.55%，OhNPC2中含量最低，為8.73%；3個(gè)OhNPC蛋白中含量最少的氨基酸是半胱氨酸。6個(gè)OhPI-PLC蛋白的各氨基酸組成中，除OhPLC5外，含量最高的都是亮氨酸，所占的平均比例接近9%；6個(gè)OhPI-PLC蛋白中含量最少的兩個(gè)氨基酸是色氨酸和半胱氨酸。這些結(jié)果說明，OhNPC與OhPI-PLC兩個(gè)亞族之間差異很大。圖1 OhPLC家族蛋白中各氨基酸的組成Fig. 1 Composition of amino acids of OhPLC family proteins二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，OhPLC家族蛋白都只包含3種結(jié)構(gòu)（圖2）：-螺

38、旋（Alpha helix）、-折疊中的延伸鏈（Extended strand）和無規(guī)則卷曲（Random coil）。其中，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)所占的比例最高（47.33%-59.12%），平均比例為53.91%；其次是-螺旋（19.12%-33.56%），平均比例為28.31%；最少的是-折疊中的延伸鏈（13.55%-33.56%），平均比例為17.78%。圖2 OhPLC家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Secondary structure prediction of OhPLC family proteins通過NetPhos在線軟件對(duì)OhPLC家族9個(gè)成員進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)（表4），結(jié)果顯

39、示，OhPLCs中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)為 27-72個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)為10-28個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)3-10個(gè)。每個(gè)成員的磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目和組成不盡相同，最少的潛在磷酸化位點(diǎn)43個(gè)，最多的99個(gè)。表4 OhPLC蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 4 Phosphorylation sites predicted of the PLC proteins in O. hybridumOhPLC家族蛋白OhPLC family proteins絲氨酸Serine/Ser蘇氨酸Threoine/Thr酪氨酸Tyrosine/TyrOhNPC161287OhNPC247218OhNPC328154OhPLC

40、168253OhPLC272207OhPLC3521910OhPLC467265OhPLC527106OhPLC65325102.2 PLC家族系統(tǒng)進(jìn)化分析為了解OhPLC家族蛋白質(zhì)與擬南芥、水稻和玉米的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA5.0對(duì)包括OhPLC在內(nèi)的4個(gè)物種進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示（圖3），擬南芥、水稻、玉米和文心蘭的PLC家族蛋白質(zhì)可以被劃分為PI-PLC和NPC兩個(gè)亞家族。OhPI-PLC包括6個(gè)成員，分別是OhPLC 1/2/3/4/5/6，占文心蘭 PLC 基因的66.7%；OhNPC包括3個(gè)OhNPC成員，分別是OhNPC 1/2/3。在OhPI-PLC亞族中，OhPLC5和

41、水稻OsPLC4（LOC_Os05g03610）在同一分支，OhPLC2與OsPLC3（LOC_Os12g37560）同源關(guān)系較近，OhPLC3和OhPLC4與水稻PI-PLC家族中的OsPLC1（LOC_Os07g49330）、OsPLC2（LOC_Os03g18010）處于同一分支，其他OhPI-PLCs蛋白分別位于另外幾個(gè)分支下，與同為單子葉植物的水稻、玉米關(guān)系較近。在OhNPC亞家族中，OhNPC2與水稻OsNPC1（LOC_Os03g61130）同源性較高，OhNPC3與水稻NPC家族中的OsPLC3（LOC_Os11g38050）、OsPLC4（LOC_Os03g63580）同源關(guān)

42、系較近，OhNPC1則與擬南芥AtNPC2（AT2G26870）處于同一分支。圖3 文心蘭與部分植物PLC家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of PLC family proteins from Oncidium and some plants 2.3 OhPLC家族蛋白保守基序（motif）分析 為了進(jìn)一步了解PLC家族蛋白質(zhì)的保守基序（motif），利用在線軟件對(duì)文心蘭OhPLC蛋白進(jìn)行motif分析，結(jié)果顯示（圖4），文心蘭OhPLC家族蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)含有18個(gè)motif，不同OhPLC蛋白質(zhì)含有的motif數(shù)量和類型存在一定的差異。Motif 2有 4 次

43、，Motif 6有4次，Motif 4有7次，Motif 13有4次，Motif 10有7次，Motif 1有4次，Motif 12有4次，Motif 5有4次，Motif 7有4次，Motif 17有2次，Motif 3有3次，Motif 19有5次，Motif 11有3次，Motif 15有3次，Motif 20有3次，Motif 8有3次，Motif 9有3次，Motif 14有3次，Motif 16有3次，Motif 18有2次。其中，Motif 2和Motif 6屬于PI-PLC-X結(jié)構(gòu)域中起催化作用的蛋白基序；Motif 13、Motif 10和Motif 1屬于PI-PLC-Y結(jié)

44、構(gòu)域；Motif 12、Motif 5和Motif 7屬于C2結(jié)構(gòu)域中調(diào)控Ca離子的蛋白結(jié)構(gòu)基序。磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域總共有10個(gè)motif，分別為Motif 11、Motif 15、Motif 20、Motif 4、Motif 10、Motif 8、Motif 3、Motif 19、Motif 9和Motif 14，它們屬于催化磷酸酯酶的蛋白基序。 值得一提的是，OhPI-PLC和OhNPC亞家族蛋白的保守基序差異較大，Motif 4和Motif 10屬于OhPI-PLC和OhNPC亞家族蛋白共有的保守基序。此外，共有4個(gè)OhPI-PLC亞家族蛋白同時(shí)含有Motif 2、Motif 6、Motif

45、 4、Motif 13、Motif 10、Motif 1、Motif 12、Motif 5和Motif 7，OhPLC1和OhPLC6僅含有Motif 19；共有3個(gè)OhNPC亞家族蛋白同時(shí)含有Motif 11、Motif 15、Motif 20、Motif 4、Motif 10、Motif 8、Motif 3、Motif 19、Motif 9、Motif 14和Motif 16。圖 4 PLC蛋白質(zhì)家族成員氨基酸保守性分析Fig. 4 Amino acid conserved analysis of PLC protein family members. 圖 5 PLC蛋白質(zhì)家族成員保守氨基

46、酸序列Fig. 5 Conserved amino acid sequences of PLC protein family members2.4 PLC家族成員蛋白互作分析利用模式植物擬南芥的同源比對(duì)預(yù)測(cè)同源蛋白的互作關(guān)系，表5為文心蘭與擬南芥PLC家族蛋白的同源比對(duì)結(jié)果，OhPLC家族成員在擬南芥中同源性較高的蛋白有7個(gè)，分別為NPC2、NPC1、NPC4、At4G38690、At2G40116、PLC4、PLC2。圖6展示的是OhPLC家族成員在擬南芥中的同源蛋白的互作蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLC家族成員存在自身互作，例如NPC1、NPC2和NPC4，除此之外，還與PTEN3、AT1G1090

47、0（PIP5K）、PIS1、G蛋白（G-Protein 2，XLG2）和G蛋白亞基（Protein Subunit，GPA1）這5個(gè)蛋白存在互作關(guān)系。其中，XLG2和GPA1均屬于G蛋白，說明PLC家族成員在發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)，不僅家族成員聯(lián)系緊密，而且還與G蛋白相互作用，共同行使功能。表5 OhPLCs與擬南芥PLCs的同源比對(duì)結(jié)果Table 5 PLCs homologous alignment result between Arabidopsis thaliana and O. hybridumOhPLC家族基因OhPLC family genes擬南芥同源基因homologous gen

48、e in Arabidopsis thaliana同一性Identity/%分值BitscoreOhNPC1NPC271%729OhNPC2NPC175%819OhNPC3NPC471%620OhPLC1At4G3869062%432OhPLC2At2G40116,PLC657%694OhPLC3PLC460%752OhPLC4At2G40116,PLC669%679OhPLC5PLC258%687OhPLC6At4G3869064%439圖6 OhPLC家族成員互作蛋白的預(yù)測(cè)Fig. 6 Predict and analysis of the interacting protein of P

49、LC family members in O. hybridum2.5 OhPLC家族基因在文心蘭感病過程中的表達(dá)模式基于南茜文心蘭應(yīng)答軟腐病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提取9個(gè)PLC家族成員在3個(gè)樣品（CK、輕度感病、重度感?。┑腞PKM值，采用Omicshare在線軟件對(duì)這些成員的差異表達(dá)進(jìn)行分層聚類分析（圖6）。結(jié)果顯示，隨著侵染時(shí)間的延長，OhPLC家族成員呈現(xiàn)出了4種不同的表達(dá)模式，OhPLC4表達(dá)量顯著上調(diào)，OhPLC3、OhPLC5、OhNPC1以及OhNPC2表現(xiàn)為先升高后降低的表達(dá)趨勢(shì)，OhPLC6、OhPLC2以及OhNPC3表現(xiàn)為先降低后升高的表達(dá)趨勢(shì)，OhPLC1表達(dá)量顯著下調(diào)

50、。值得注意的是，OhNPC1、OhPLC3以及OhPLC5在病原菌侵染初期與后期均顯著上調(diào)表達(dá)，OhPLC4和OhPLC6在病原菌侵染后期顯著上調(diào)表達(dá)，說明OhNPC1、OhPLC3、OhPLC4、OhPLC5和OhPLC6可能在文心蘭應(yīng)答軟腐病菌侵染過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。圖7 OhPLC家族基因在軟腐菌侵染不同時(shí)期的表達(dá)模式。對(duì)照樣本用T-0表示，T-1表示輕度感病，T-2表示重度感病；基于南茜文心蘭應(yīng)答細(xì)菌軟腐病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)計(jì)算得出，對(duì)各個(gè)樣本的基因表達(dá)量以2為底求對(duì)數(shù)值，基因在不同樣品中的表達(dá)量用不同顏色表示，顏色越紅表示表達(dá)量越高，顏色越藍(lán)表示表達(dá)量越低。Fig.7 Patt

51、erns of expression of PLC family in different period infected by soft rot pathogen in O. hybridum. The control samples were called T-0, where T-1 indicates soft rot pathogen infected O. hybridum for 12h, and T-2 indicates soft rot pathogen infected O. hybridum for 36h. Based on the transcriptome dat

52、a of O. hybridum Gower Ramsey infected by soft rot pathogen, the above figure shows that each color represents the corresponding expression value. The greater the value, the higher the expression.為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)文心蘭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)9個(gè)PLC家族成員的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。如圖8所示，除OhNPC1和OhPLC1外，qRT-PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致，說明文心蘭轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序結(jié)果較為準(zhǔn)確。圖

53、8 文心蘭PLC家族基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig. 8 qRT-PCR validation of PLC family genes in O. hybridum 3 討論與結(jié)論3.1 文心蘭OhPLC可能在過氧化物酶體中參與調(diào)控抗軟腐病防御反應(yīng)近年來，隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)植物基因家族進(jìn)行分析的研究已有不少文獻(xiàn)報(bào)道40-42。目前，已從多種植物中分離鑒定出PLC家族基因成員，不同物種中的PLC家族成員數(shù)目各不相同，推測(cè)它們?cè)谔囟ǖ臅r(shí)空和組織響應(yīng)發(fā)育信號(hào)和各種環(huán)境刺激從而精細(xì)調(diào)節(jié)各自的生理生化過程。已鑒定的單子葉植物水稻22、玉米24、蝴蝶蘭30分別含有9個(gè)、9個(gè)和3個(gè)家族成

54、員，而雙子葉植物擬南芥19、棉花25、亞麻芥26、楊樹29、番茄23、蓖麻27、桃28分別含有14、15、10、7、7、6和5個(gè)家族成員。 本研究從南茜文心蘭應(yīng)答軟腐病侵染的轉(zhuǎn)錄組中鑒定出9個(gè)PLC家族成員（6個(gè)PI-PLC，3個(gè)NPC）。多重序列比對(duì)后根據(jù)其相應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域，將OhPLC劃分為2個(gè)不同的亞家族，NPC和PI-PLC。值得注意的是，9個(gè)OhPLC在亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)方面有較大的差異，與其同源的擬南芥和水稻PLC并不完全相同19,22，共有2個(gè)OhNPC定位于葉綠體，3個(gè)OhPI-PLC（OhPLC1、OhPLC4以及OhPLC6）定位于過氧化物酶體，說明它們可能在葉綠體或者過氧化物

55、酶體中進(jìn)行表達(dá)，行使不同的功能。過氧化物酶體是高度動(dòng)態(tài)、代謝活躍的細(xì)胞器，主要功能是參與脂肪酸等脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)43。越來越多的證據(jù)表明，過氧化物酶體可以作為植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）/氧化還原變化的傳感器，對(duì)于生物脅迫能引發(fā)快速和特異性的應(yīng)答44-45。因此，我們初步推測(cè)這些基因可能在過氧化物酶體中參與調(diào)控抗軟腐病防御反應(yīng)，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。3.2 文心蘭OhPLC可能協(xié)同G蛋白參與免疫應(yīng)答 尋找PLC的互作蛋白，對(duì)于揭示磷脂酰肌醇信號(hào)途徑在文心蘭中的抗病分子機(jī)理具有重要意義。目前，在植物中已發(fā)現(xiàn)了PLC與G蛋白互作的例子，如Misr

56、a等通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了G蛋白（XLG2）可以與豌豆PI-PLC中的C2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，且PsPLC與G蛋白相互作用后提高了植株對(duì)鹽和熱的耐受能力46；Apone等的研究指出，G蛋白偶聯(lián)受體（GCR1）和G蛋白亞基（GPA）過表達(dá)煙草和擬南芥可以提高植株P(guān)I-PLC的活性和IP3水平47。值得注意的是，At2G40116與XLG2相互作用、PLC4與XLG2相互作用、PLC2與XLG2相互作用、At2G40116與（GPA1）相互作用、PLC4與GPA1相互作用以及PLC2與GPA1相互作用均已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)48。本研究中，OhPLC2（OhPLC4）、OhPLC3和OhPLC5分別與擬南芥At2

57、G40116、AtPLC4和AtPLC2同源性較高，推測(cè)也可能是協(xié)同G蛋白參與免疫應(yīng)答。但是，它們是否與其擬南芥同源基因存在一樣的互作關(guān)系，仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。3.3 文心蘭OhPLC可能通過Ca2+信號(hào)通路響應(yīng)軟腐病侵染 系統(tǒng)進(jìn)化和保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，文心蘭與水稻、擬南芥相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列有較高的同源性，且同一亞組內(nèi)的基因具有相似的保守結(jié)構(gòu)域。目前，已有充足的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，當(dāng)植物細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體PRRs感知病原菌的PAMPs后，Ca2+內(nèi)流會(huì)通過鈣依賴性蛋白激酶CPKs介導(dǎo)RBOHD的N-端EF手型結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化，并且多種細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶會(huì)誘導(dǎo)RBOHD N末端激活域的磷酸化，以保證RO

58、S的產(chǎn)生，對(duì)激活病原菌侵染的免疫反應(yīng)至關(guān)重要49。OhPI-PLC亞家族中的OhPLC3和OhPLC5均具有類似的EF手型結(jié)構(gòu)域，可能在植物防御反應(yīng)建立過程中發(fā)揮重要作用。有趣的是，科研人員在對(duì)水稻的PI-PLC蛋白研究過程中發(fā)現(xiàn)，C2結(jié)構(gòu)域可以在EF手型和XY催化結(jié)構(gòu)域發(fā)生缺失的情況下，單獨(dú)與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，完成相應(yīng)的生物學(xué)功能50。在本研究中，OhPLC2和OhPLC4同樣缺少EF手型結(jié)構(gòu)域，說明可能在文心蘭中也有類似的機(jī)制。 PLCs在應(yīng)答病原菌侵染信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中對(duì)植物防御反應(yīng)的激活或抑制起著重要作用。通過對(duì)擬南芥接種不同病原菌的DNA微陣列數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在假單胞桿菌感染的條件下，NPC基

59、因家族（特別是AtNPC6）表達(dá)被抑制，而在丁香假單胞菌、白粉菌、晚疫病菌以及灰霉菌感染下AtNPC3和AtNPC4的表達(dá)模式正好相反，該研究認(rèn)為造成NPC基因家族成員表達(dá)量下降的主要原因是擬南芥需要迅速重新排列它們的代謝通量并激活相應(yīng)的防御反應(yīng)，從而阻止或消除病原菌的攻擊20。OhNPC3和AtNPC4同源較高，暗示著它們的功能和作用方式可能比較相似，推測(cè)該基因可能參與文心蘭的抗病反應(yīng)。Krkov等的研究表明，AtNPC2通過水楊酸信號(hào)通路調(diào)控?cái)M南芥對(duì)丁香假單胞菌的抗性5。本研究發(fā)現(xiàn)與擬南芥AtNPC2同源的文心蘭OhNPC1表達(dá)受軟腐病的顯著誘導(dǎo)，說明該基因在文心蘭軟腐菌侵染響應(yīng)中可能發(fā)揮

60、重要的調(diào)控作用。此外，Song和Goodman的研究中發(fā)現(xiàn)，水稻OsPLC1定位在煙草和洋蔥表皮的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，該基因的表達(dá)受病原菌脅迫誘導(dǎo)，通過調(diào)控Ca2+信號(hào)通路參與植物抗病反應(yīng)33。在本研究中，與OsPLC1同源性較高的OhPLC3也被預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞質(zhì)，且在軟腐病侵染初期顯著上調(diào)表達(dá)，暗示OhPLC3可能發(fā)揮了與它同源的OsPLC1類似的作用，參與文心蘭對(duì)軟腐病侵染的應(yīng)答過程。上述研究表明，PLCs在抗病防御反應(yīng)中起重要調(diào)控作用，但是不同PLCs的功能和作用方式不同，OhPLC家族成員在軟腐菌侵染響應(yīng)中的功能仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。本研究基于南茜文心蘭應(yīng)答軟腐病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)OhPLC家