豚鼠耳蝸血管交感神經(jīng)支配的逆行追蹤與免疫組化相結(jié)合的雙標(biāo)

1、豚鼠耳蝸血管交感神經(jīng)支配的逆行追蹤與免疫組化相結(jié)合的雙標(biāo)申宇鵬，邱建華，喬莉，劉順?biāo)臁娟P(guān)鍵詞】螺旋蝸軸動脈；交感神經(jīng)；酪氨酸單氧化酶；免疫構(gòu)造化學(xué)；豚鼠【Keyrds】spiraldilarartery;sypathetinerve;tyrsine3nrygenase;iunhistheistry;guineapigs【摘要】目的：研究豚鼠耳蝸螺旋蝸軸動脈擔(dān)當(dāng)交感神經(jīng)支配的詳細(xì)泉源環(huán)境及與該交感神經(jīng)纖維調(diào)治成效相干的神經(jīng)遞質(zhì).要領(lǐng)：在正常豚鼠單側(cè)耳蝸螺旋蝸軸動脈局部滴加逆行追蹤劑辣根過氧化物酶(HRP)或熒光金(FG)，不雅察雙側(cè)交感頸上神經(jīng)節(jié)、星狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)HRP或FG逆標(biāo)神經(jīng)元的漫衍；接納逆

2、標(biāo)與免疫組化相結(jié)合的雙重標(biāo)識表記標(biāo)幟要領(lǐng)不雅察追蹤陽性神經(jīng)元是否表達(dá)酪氨酸羥化酶(TH)、神經(jīng)肽Y(NPY)、鈣基因相干肽(GRP)或P物質(zhì)(SP).效果：同側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)可見逆行追蹤陽性神經(jīng)元胞體，對側(cè)頸上及雙側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)卻未見陽性細(xì)胞；陽性神經(jīng)元多同時呈TH,NPY陽性，但未見GRP或SP雙標(biāo)的陽性神經(jīng)元.結(jié)論：豚鼠頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)存在TH及NPY陽性神經(jīng)元支配同側(cè)耳蝸血管，去甲腎上腺素和神經(jīng)肽Y大概是交感神經(jīng)節(jié)后纖維調(diào)治耳蝸血流的遞質(zhì)或調(diào)質(zhì).【關(guān)鍵詞】螺旋蝸軸動脈；交感神經(jīng)；酪氨酸單氧化酶；免疫構(gòu)造化學(xué)；豚鼠0弁言耳蝸正常的血液供給對維持其生理成效及內(nèi)環(huán)境不變具有緊張意義，已證明耳蝸微血管

3、存在龐大的調(diào)治機(jī)制，交感神經(jīng)體系、體循環(huán)血壓、局部代謝產(chǎn)物、藥物及血管活性肽等都市影響耳蝸血流.現(xiàn)有研究不雅察到哺乳動物耳蝸擔(dān)當(dāng)富厚的交感神經(jīng)支配1，且這些交感神經(jīng)纖維大多是去甲腎上腺素能的.angeann等2在體外實行不雅察到耳蝸的重要供血動脈如：基底動脈、小腦前下動脈及螺旋蝸軸動脈的緊縮都受到交感神經(jīng)的調(diào)治.邱建華等3不雅察到豚鼠螺旋蝸軸動脈及其放射狀動脈四周均有差異程度的酪氨酸羥化酶(tyrsinehydrxylase,TH)免疫反響陽性神經(jīng)纖維的漫衍.本研究旨在明白豚鼠耳蝸螺旋蝸軸動脈擔(dān)當(dāng)交感神經(jīng)節(jié)后纖維支配的詳細(xì)泉源環(huán)境以及與該交感神經(jīng)纖維調(diào)治成效相干的神經(jīng)遞質(zhì)，為進(jìn)一步研究交感神經(jīng)

4、對耳蝸血流的調(diào)治作用奠基底子.1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料選用康健、耳廓反射敏捷的白色豚鼠12只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實行動物中央提供，體質(zhì)量(28050)g，牝牡不拘，自由攝取食水.將豚鼠隨機(jī)分為3組：辣根過氧化物酶(hrseradishperxidase,HRP)追蹤組；熒光金(flurgld,FG)追蹤組和比較組.追蹤用HRP及顯色劑四甲基聯(lián)苯胺(tetraethylbenzidine,TB)購自德國Rhe公司；免疫構(gòu)造化學(xué)AB試劑盒、兔抗神經(jīng)肽Y(NPY)及P物質(zhì)(SP)抗體(1100)購自武漢博士德生物成品；FG及兔抗TH,鈣基因相干肽(GRP)抗體(15000)均購于美國Siga公司.1.2要

5、領(lǐng)切片經(jīng)0.02l/L的磷酸鹽緩沖液(pH5.4)漂洗10in，用含50L/L牛血明凈卵白、50L/L正常羊血清和4g/LTritnX100的磷酸鹽緩沖液關(guān)閉2h，洗濯后別離參加兔抗TH,GRP(15000),NPY或SP(1100)多克隆抗體，4孵育48h，抗體稀釋液用含10L/L牛血明凈卵白、10L/L正常羊血清和4g/LTritnX100的磷酸鹽緩沖液配制.生物素標(biāo)識表記標(biāo)幟的羊抗兔IgG室溫孵育2h，AB復(fù)合液室溫孵育30in，DAB顯色后，略微脫水，透明，封片，lypus光學(xué)顯微鏡不雅察并照相，雙標(biāo)染色歷程中留意漂洗液pH值以制止HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟產(chǎn)物洗脫.2效果2.1FG逆行追蹤豚

6、鼠耳蝸螺旋蝸軸動脈局部滴加FG后7d，同側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)可見FG標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元，在323n引發(fā)光下發(fā)出金黃色熒光.FG標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元數(shù)目約在516個，絕大部門位于頸上神經(jīng)節(jié)頭側(cè)或中部，巨細(xì)不等(圖1).部門FG標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元可見到顯著的軸突及相對空缺的核區(qū).對側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)及雙側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)未見FG標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元.2.2HRP逆行追蹤耳蝸螺旋蝸軸動脈局部滴加HRP后48h，經(jīng)鎢酸鈉TB法呈色，同側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)可見HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元.標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元呈深藍(lán)綠色，核區(qū)顯著淡染，少數(shù)神經(jīng)元可見突起，高倍鏡下可見胞漿內(nèi)的藍(lán)綠色顆粒(圖2A)；手術(shù)同側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)

7、元的數(shù)目約為412個，巨細(xì)不等，形態(tài)各異，其漫衍與FG追蹤組相似，險些全部位于頸上神經(jīng)節(jié)頭側(cè)半，對側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)及雙側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)未見HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元.比較組雙側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)及星狀神經(jīng)節(jié)切片經(jīng)TB法染色，均未創(chuàng)造標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元.2.3HRP逆標(biāo)與TH,NPY免疫組化染色相結(jié)合的雙重標(biāo)識表記標(biāo)幟將部門HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟的切片繼承行TH或NPY的免疫組化反響.頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)有大量的TH陽性神經(jīng)元和NPY陽性神經(jīng)元，多數(shù)HRP追蹤陽性神經(jīng)元同時呈TH陽性，HRPTH雙標(biāo)神經(jīng)元胞體內(nèi)可同時見到深藍(lán)綠色顆粒和棕黃染色顆粒(圖2B,).多數(shù)HRP追蹤陽性神經(jīng)元也呈NPY陽性(圖2D).2.4HRP逆

8、標(biāo)與SP,GRP免疫組化染色相結(jié)合的雙重標(biāo)識表記標(biāo)幟將部門HRP追蹤的切片行SP及GRP免疫組化反響.頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)可見GRP陽性神經(jīng)元，數(shù)目顯著少于TH，NPY陽性神經(jīng)元；頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)偶可見到SP陽性細(xì)胞，但SP陽性終末比力麋集，未見HRPSP或HRPGRP雙標(biāo)神經(jīng)元.3討論耳蝸的供血重要來自椎基底動脈體系的小腦前下動脈分出的迷路動脈、耳蝸總動脈、耳蝸自動脈及前庭耳蝸動脈4.耳蝸自動脈沿蝸底向蝸頂呈螺旋樣走行，形成螺旋蝸軸動脈，其在差異位置發(fā)出的各級動脈和放射狀動脈提供了包羅蝸軸在內(nèi)3/4的耳蝸血流.已有研究證明，耳蝸螺旋蝸軸動脈和骨螺旋板四周存在酪氨酸羥化酶及多巴胺羥化酶陽性纖維漫衍,漫衍于

9、血管四周的去甲腎上腺素能纖維大概到場耳蝸微循環(huán)的調(diào)治.本研究不雅察到豚鼠耳蝸螺旋蝸軸動脈四周賜與神經(jīng)逆行追蹤劑后，同側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)可見逆行標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元，而對側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)及雙側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)未見逆行標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元.可見漫衍于耳蝸血管四周的交感神經(jīng)節(jié)后纖維重要泉源于同側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)，這與GilLyzaga等5報導(dǎo)的切除大鼠頸上神經(jīng)節(jié)后同側(cè)耳蝸內(nèi)去甲腎上腺素濃度落落82%相切合.也有研究報道星狀神經(jīng)節(jié)對耳蝸血流的調(diào)治起重要作用，但本研究未能在雙側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)不雅察到逆標(biāo)神經(jīng)元，這種征象大概與追蹤劑敏感性和動物存活時間有關(guān)，也大概由于星狀神經(jīng)節(jié)發(fā)出的節(jié)后纖維重要漫衍于椎基底動脈體系的較大分支來利用

10、其調(diào)治成效，而位于蝸軸內(nèi)的交感神經(jīng)纖維那么重要泉源于同側(cè)頸上神經(jīng)節(jié).同時我們還通過對逆標(biāo)神經(jīng)元行TH,NPY,GRP及SP的免疫組化染色不雅察到，這些漫衍于螺旋蝸軸動脈四周的交感神經(jīng)節(jié)后纖維泉源于同側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)的TH陽性神經(jīng)元，而且大多同時呈NYP陽性.這也提示了交感神經(jīng)節(jié)后纖維及其相干遞質(zhì)對耳蝸微循環(huán)起緊張的調(diào)治作用，這種調(diào)治作用大概是通已往甲腎上腺素、多巴胺及神經(jīng)肽類等多種神經(jīng)遞質(zhì)協(xié)同完成，也大概受到SP,GRP陽性的交感神經(jīng)節(jié)前纖維的上位調(diào)控.如今以為耳蝸微血管體系對機(jī)體灌注壓的改變存在明顯的自身調(diào)治反響，以保持耳蝸微循環(huán)的相對不變.atanabe等6不雅察到貓單側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)切除后同側(cè)

11、耳蝸側(cè)壁血管紋處微血管顯著擴(kuò)張，結(jié)合我們的研究效果可以推測交感頸上神經(jīng)節(jié)對耳蝸微血管的神經(jīng)支配到場了維持內(nèi)耳微循環(huán)不變的龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其詳細(xì)調(diào)治機(jī)制以及失交感神經(jīng)支配后耳蝸聽覺生理和血流的變革環(huán)境有待深化研究.【參考文獻(xiàn)】1LynJ,PayanRN.parisnfthevasularinnervatinftherathleaandvestibularsysteJ.HearRes,2000,141(12):189-198.2angeannP,nnebergerK.Neurgeniregulatinfhlearbldflursalngthebasilarartery,theanteririnferirerebellararteryandatbranhpintsfthespiraldilararteryJ.HearRes,2022,209(12):91-96.3邱建華，喬莉，劉順?biāo)?耳蝸血管交感及感覺神經(jīng)雙重調(diào)治的形態(tài)學(xué)證據(jù)J.聽力學(xué)及言語疾病雜志,2022,12(2):96-97.4NakashiaT,NaganaaS,Sne,etal.DisrdersfhlearbldflRevieJ.BrainRes,2022,43(1):17-28.5GilLyzagaP,VienteTrresA,AreA,etal.Effetfsuperire