流式細(xì)胞術(shù)在科研中的應(yīng)用

1、 流式細(xì)胞術(shù)在科研中 的應(yīng)用 什么是流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀實(shí)物BD FACSVantageBD-Calibur 流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù)非熒光信號(hào)顆粒度細(xì)胞大小前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對(duì)復(fù)雜性外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖熒光信號(hào)熒光強(qiáng)度（FL）：細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱）一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可測出三個(gè)FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個(gè)或三個(gè)激

2、光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個(gè)FL。熒光信號(hào)雙色直接染色流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn)圖和直方圖。幾個(gè)概念：%Gated：陽性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽性細(xì)胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強(qiáng)度，與被檢測物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)，在正態(tài)分布時(shí)一般用該值。Geo Mean：幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽性細(xì)胞為偏態(tài)分布時(shí)一般用該值。散點(diǎn)圖 密度圖二維等高圖直方圖圖 報(bào)告中常見的幾種流式細(xì)胞圖圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析點(diǎn)圖分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析圖中100101（M1）為陰性細(xì)胞，101以上

3、的（M2）為陽性細(xì)胞 當(dāng)前流式細(xì)胞分析發(fā)展趨勢從相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)到絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù) 從相對(duì)定量到絕對(duì)定量分析從單色到多色熒光分析 從細(xì)胞膜成分到細(xì)胞內(nèi)成分分析從細(xì)胞分析到可溶性成分的流式細(xì)胞分析 今天主要內(nèi)容：流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞凋亡檢測中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤細(xì)胞DNA倍體中的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的分選功能流式細(xì)胞術(shù)在蛋白檢測中的應(yīng)用細(xì)胞凋亡檢測1、半胱氨酸蛋白酶3檢測法（早早期）2、Annexin V-FITC/PI 法（早期）3、Apo2.7檢測法（早期）4、TUNEL 法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的流式細(xì)胞術(shù)檢測流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的分析細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)

4、水解酶改變：如Caspase-3活化細(xì)胞膜不對(duì)稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI細(xì)胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實(shí)驗(yàn)（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相關(guān)蛋白：FasBcl-2細(xì)胞凋亡Active Caspases-3細(xì)胞凋亡Caspases-3細(xì)胞凋亡Annexin 凋亡檢測（Annexin V/PI法） PIAnnexin V-FITCDNA倍體的流式分析細(xì)胞DNA含量檢測細(xì)胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙啶），染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個(gè)原理，可測出細(xì)

5、胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測。 單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞，4N代表G2/M期細(xì)胞，兩者中間代表S期細(xì)胞。這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖 DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期G2MG0G1s 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細(xì)胞數(shù)量2N4N2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體含量與凋亡關(guān)系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處理時(shí)，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA

6、片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 圖 FCM測試細(xì)胞周 期分布和凋亡流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選功能分選：用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺(tái)式機(jī)一

7、般分選速度為每秒鐘300個(gè)細(xì)胞，大型機(jī)分選速度可達(dá)到每秒上萬個(gè)細(xì)胞488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell SortingCharged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector流式分選與分子生物學(xué)研究除了將分選得到的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)研究外，F(xiàn)CM分選系統(tǒng)可為PCR、FISH等分子技術(shù)提供純度較高的特異性細(xì)胞群，減少研究中的干擾因素，獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Cytometric Beads Array (CBA)流式液相多重蛋白定量技術(shù)導(dǎo)言常規(guī)的蛋白分

8、析方法：ELISA：一次反應(yīng)只能檢測一個(gè)指標(biāo)Western blot：不能對(duì)蛋白精確定量不足之處：檢測多個(gè)指標(biāo)需耗費(fèi)大量樣本分批操作導(dǎo)致組間差異大操作繁瑣，耗時(shí)耗力如何能夠從單個(gè)微量樣本中一次檢測多個(gè)目標(biāo)蛋白，并加以定量，獲得高精確度的數(shù)據(jù)呢？針對(duì)于此，BD-Pharmingen成功研發(fā)了基于流式細(xì)胞儀檢測平臺(tái)的液相多重蛋白定量技術(shù)BD Cytometric Bead Array，簡稱CBA CBA技術(shù)簡介CBA是一系列帶有不同強(qiáng)度紅色熒光、包被有捕獲抗體的微球，類似ELISA的捕獲孔板，可以捕獲液相樣本（血清、血漿或者細(xì)胞培養(yǎng)上清液等）中相應(yīng)的抗原，再結(jié)合PE標(biāo)記檢測抗體，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)

9、，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測，便可同時(shí)對(duì)樣本中的多種可溶性蛋白成分進(jìn)行定量+Analyte of interestFluorescent detection Ab capture Bead capture AbBeadBD Cytometric Bead Array123不同強(qiáng)度紅色熒光的捕獲微球，在FCM FL3檢測不同的目標(biāo)蛋白PE 標(biāo)記的檢測抗體，在FCM FL2檢測。 PE的熒光強(qiáng)度即反映靶蛋白的含量456Human Th1/Th2 Lymphokine CBATh1/Th2 panel: IL2, IL4, IL5, IL10, TNF, IFN用 FL3熒光的強(qiáng)度不同區(qū)別 種不同的

10、微球（beads）Direct sandwich immunoassayFL2 (PE) detector reagent樣本處理6 cytokines from a 50 L sampleThree pipetting steps3 hour total incubationQuantitative results and complete report generationSoftware assisted quantitative analysis, with curve fitting algorithmResult reporting included in softwareHuma

11、n Th1/Th2 Lymphokine CBA Chemokine-I CBA Assay Standard0 pg/mlCBA Assay Standard 10 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard20 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard40 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard80 pg/mlCBA Assay Standard cont.C

12、hemokine-I CBA Assay Standard156 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard312 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard625 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard1250 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard2500 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay StandardHuman Th1/Th2 Lymphokine CBA 標(biāo)準(zhǔn)曲線5000 pg/ml2500