瓊脂稀釋法測(cè)定抗菌藥物最低抑菌濃度MIC資料全

1、瓊脂稀釋法測(cè)定抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)|瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50笆左右的定量MH瓊脂中，制成含 不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的 瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。本法優(yōu)點(diǎn)是可在一個(gè)平板上同時(shí)作多株菌MIC測(cè)定，結(jié) 果可靠，易發(fā)現(xiàn)污染菌；缺點(diǎn)是制備含藥瓊脂平板費(fèi)時(shí)費(fèi)力。培養(yǎng)基制備使用MH瓊脂，按商品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎(chǔ)加1%添加 劑；其它鏈球菌使用含5% (V/V)綿羊血的MH瓊脂(當(dāng)試驗(yàn)磺胺藥時(shí)，使用溶解的馬血)。含藥瓊脂平板制備根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將已倍比稀釋的不同

2、濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解，并在4550笆水 浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度34mm。通常按1：9比例配制藥 物瓊脂平板，根據(jù)需要來(lái)選擇藥物濃度圍。配制好的含藥瓊脂平板應(yīng)裝入密封塑料袋中，置 28笆冰箱可貯存5天。接種物制備與接種制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的菌懸液，再1： 10稀釋，以多點(diǎn)接種器吸取制備好菌 液(約12ul)接種于瓊脂平板表面，每點(diǎn)菌數(shù)約為104CFU，形成直徑為58mm的菌斑。 接種好后置35笆孵育1620h (甲氧西林耐藥葡萄球菌、萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌孵育時(shí)間應(yīng)滿 24h)，觀察結(jié)果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細(xì)菌置5%二氧化碳、幽門螺桿菌置微需氧

3、環(huán)境中孵 育。結(jié)果判斷將平板置于暗色、無(wú)反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。 在含甲氧芐胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見(jiàn)輕微細(xì)菌生長(zhǎng)，與生長(zhǎng)對(duì)照比較抑制80%以上細(xì)菌 生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為終點(diǎn)濃度。如果出現(xiàn)有2個(gè)以上菌落生長(zhǎng)于含藥濃度高于終點(diǎn)水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平 板上不長(zhǎng)而高濃度藥物瓊脂平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗(yàn)。原理：將抗菌藥物配制到瓊脂培養(yǎng)基中成：128 u g/ml 、 64 u g/ml 、 32 u g/ml 0.06 ug/ml對(duì)倍稀釋的濃度系列多點(diǎn)接種器將制備好的細(xì)菌菌懸液迅速點(diǎn) 種到瓊脂表面，經(jīng)35C16-20小時(shí)培養(yǎng)

4、肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng)，以未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)平板的 最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MlC)抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備1估算抗菌藥物最小稱量瓊脂稀釋法最高藥物濃度為128ug/ml藥物和培養(yǎng)基的體積比1:14,即藥物濃度將成15倍稀釋，因此保存液為128ug/mlX15 = 1920ug/ml如果1次用量為10ml ,則：抗菌藥物最小稱量=1920ug/ml*10ml抗菌藥物的效價(jià)抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備2抗菌藥物稀釋選擇合適的抗菌藥物稀釋液進(jìn)行藥物稀釋, 稀釋液需要量見(jiàn)下列公式：怦沈、蕓兒抗菌藥物實(shí)際稱量*效價(jià)稀釋液體積保存液濃度(i920ug/ml)抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備3實(shí)際操作：先計(jì)算完成一批試驗(yàn)需幾次完成,每次

5、用 量多少，然后可一起稱量,一起稀釋,然后 按每次需要量分裝在試管中，貼上標(biāo)簽，注 明藥物名稱，濃度,體積數(shù)及配制日期，置 與C-20C保存,備用。培養(yǎng)基需氧菌MH肉湯或瓊脂苛氧菌嗜血桿菌屬：Haemophilus test medium base + 補(bǔ)充園子SR158鏈球菌屬：MHA瓊脂+5%脫纖維羊血卡他莫拉菌屬：MHA瓊脂+5%脫纖維 羊血淋球菌：CC Agar Base+L53厭氧菌Wilkins chalgren anaerobe 瓊月旨菌液準(zhǔn)備1生長(zhǎng)法：無(wú)菌環(huán)取4-5個(gè)苗落大小形態(tài)一致的菌落 頂部后接種于4-5mlMH肉湯內(nèi)35P培養(yǎng)4-6小時(shí)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，亦可過(guò) 夜培養(yǎng)，但不允

6、許超過(guò)18小時(shí)用肉湯/生理鹽水枝正至0. 5麥?zhǔn)瞎軡舛?- 2X108CFU/ml菌液準(zhǔn)備2直接菌落懸浮法：從孵育了 18-24h新鮮培養(yǎng)物的平板上，用 無(wú)菌環(huán)取單個(gè)菌落接種于無(wú)菌肉湯/生理鹽水內(nèi) 校正至0. 5麥?zhǔn)瞎軡舛?-2X10FU/inl 推薦用于苛氧菌和簪在的MRS菌液準(zhǔn)備3對(duì)絕大多數(shù)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，上述用生長(zhǎng)法或直 接菌落懸浮法制備的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳?液,應(yīng)該再用無(wú)菌肉湯或生理鹽水行1: 10 稀釋,此時(shí)菌液濃度l-2*107CFU/mL調(diào) 整好的菌液應(yīng)該在制備后的15分鐘內(nèi)完成 點(diǎn)種菌液準(zhǔn)備4如一次實(shí)驗(yàn)需完成50株或100株細(xì)菌，則細(xì) 菌要編上工作序號(hào)1-50或1-100,并在結(jié)果

7、 記錄紙上要一一對(duì)應(yīng)寫(xiě)上工作序號(hào)和菌種 編號(hào)瓊脂稀釋法藥敏平板的制備1配制融化的MH瓊脂或適合其他苛氧菌、厭 氧菌等特訊細(xì)菌的培養(yǎng)基，待冷卻到48- 5OC,澆制藥物平極.取滅菌的9 Omni平板12只，用記號(hào)筆在平板 底部作好“點(diǎn)種標(biāo)記”、“藥物名稱”.“藥物濃度”，濃度從0.06ug/(nl12811 g/ml,每種濃度1只平板共12個(gè)濃度系列。瓊脂稀釋法藥敏平板的制備2取11支無(wú)菌玻璃試管(13X 100mm),每支試 管標(biāo)記為：960, 480, 240, 120, 60, 30,15, 7. 5, 3. 75, 1.875, 0. 935 u g/m,并于上述每根管子中用 無(wú)菌移液管

8、加無(wú)菌稀釋液L 5ml瓊脂稀釋法藥敏平板的制備3將保存在-20C冰箱中的1920ug/ml濃度的抗 菌藥物保存液取出融化后，用無(wú)菌移液管吸取2. 5ml加入到128 u g/ml標(biāo)記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1. 5山1加入到960標(biāo)記的試管內(nèi)， 混勻后再吸取2. 51111加入到64 u g/ml標(biāo)記的平板 內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1. 5m 1再加入到480 u g/ml標(biāo)記 的玻璃試管內(nèi)；混勻后再吸取2. 5ml依次類推，直至最后個(gè)。,06 u g/ml標(biāo)記的平皿 內(nèi)加入1虬則抗備藥物稀釋完成瓊脂稀釋法藥敏平板的制備4準(zhǔn)備2只無(wú)藥的平板,作點(diǎn)種前和點(diǎn)種后質(zhì) 控對(duì)照所有藥物平板應(yīng)保持表面干

9、燥，不可有肉 眼可見(jiàn)的水珠（可在35 C孵箱內(nèi)倒置平板 開(kāi)蓋烘干15-20分鐘）瓊脂稀釋法藥敏平板的制備5如果需使用的藥物平板為lOOXIOOnim的方平板， 則每根玻璃管內(nèi)需加入2. 5ml的抗菌藥物稀釋液； 每次無(wú)菌吸管吸取的抗菌藥物量應(yīng)該為4. 5m 1 每只方平板應(yīng)加入2nd抗菌藥物試液無(wú)菌吸管內(nèi)應(yīng)存留下2. 5ml與下一個(gè)濃度的玻璃 試管內(nèi)的2. 5ml稀釋液進(jìn)行充分混勻藥敏培養(yǎng)基應(yīng)加入28皿1測(cè)試菌液的點(diǎn)種1預(yù)先將點(diǎn)種針和點(diǎn)種板高壓滅菌，并在孵箱內(nèi)烘干 (52孔、100孔、或21孔)將已調(diào)整好濁度(l-2X107CFU/ml)的菌液用微量 加樣器將菌液依次加入菌液點(diǎn)種板小孔加 并作

10、好 與藥期羊敲相應(yīng)的點(diǎn)種標(biāo)記,一般每小孔內(nèi)應(yīng)加入 菌液270 uL 每批試驗(yàn)均須保留有質(zhì)控菌位置和 無(wú)菌菌液位置用酒精棉球清潔多點(diǎn)接種器后，將點(diǎn)種針安裝在 多點(diǎn)接種器架子上，再將加好菌液的點(diǎn)種板安置 上多點(diǎn)接種器的點(diǎn)種板位置上測(cè)試菌液的點(diǎn)種2開(kāi)啟多點(diǎn)接種器進(jìn)行點(diǎn)種，因每一才艮點(diǎn)種 針直徑約因此點(diǎn)種到藥物平板上每點(diǎn) 的菌液量約為2ul,所以接種量為IO, CFU/點(diǎn)種時(shí)應(yīng)先點(diǎn)種對(duì)照前的質(zhì)控平板，然后 從最低藥物濃度開(kāi)始點(diǎn)種依次點(diǎn)種到藥物濃度最高的平板藥物平板的孵育上述接種好的平板應(yīng)在室溫下靜置至接種點(diǎn)上的 菌液被瓊脂完全吸收，再將藥敏平皿倒置，于 35C孵育16-20小時(shí)如葡萄球菌苯喳西林和甲氧

11、西林，則需33-35C, 絕對(duì)不能超過(guò)35C,孵育24小時(shí)、閱讀結(jié)果 萬(wàn)古霉素藥敏試驗(yàn)的腸球菌和葡萄球菌等需孵24 小時(shí)后，閱讀結(jié)果淋病奈瑟球菌需在5%CO2空氣環(huán)境中孵育20-24小 時(shí)，閱讀結(jié)果結(jié)果閱讀和判斷結(jié)果閱讀時(shí)，平板應(yīng)置于黑色不反光的表面上， 記錄的MIC是完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度, 單個(gè)菌落或接種物所致的輕微的不清晰現(xiàn)象可忽 略不計(jì)，如果在MIC判斷終點(diǎn)附近持續(xù)存在或多個(gè)菌落，或 者低濃度不長(zhǎng)，高濃度生長(zhǎng)；或者有俗稱的跳管 現(xiàn)象，就應(yīng)該檢查試驗(yàn)菌的純度，有否污染菌生 長(zhǎng)，并盡可能重復(fù)試驗(yàn)。按當(dāng)年的CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。質(zhì)控菌株質(zhì)控菌株藥敏其他金黃色制枸球菌ATCC29213+大豚埃希菌ATCC25922+大腸埃希菌ATCC35218+產(chǎn)R內(nèi)酰胺醇肺炎克甫伯菌ATCC700603+產(chǎn)超廣譜B內(nèi)耽胺酶銅綠展單胞菌ATCC27853+質(zhì)控甬株質(zhì)控菌株藥敏其他肺炎說(shuō)球菌ATCG49619糞腐球菌ATCC29212+檢測(cè)胸腺嗨臆流感嗜血桿南ATGC49766+氨卡四-林敏感株流感嗜血桿篇ATGC49247+產(chǎn)團(tuán)習(xí)