一株短乳桿菌烈性噬菌體的分離鑒定與生化特性研究

1、一株短乳桿菌烈性噬菌體的分離鑒定與生化特性研究短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)是乳桿菌屬的成員之一，是一種專性異型發(fā)酵乳酸的乳酸菌，產生乳酸、二氧化碳、乙醇和乙酸，最適生長溫度為30 ，pH為461。短乳桿菌的菌株被證實具有良好的益生特性，具有促進腸道菌群健康和用作益生菌的潛力2-4。在食品發(fā)酵生產方面，由于其生長迅速，產酸性能好，且具有分泌細菌素等抑菌成分的能力5，常被用作發(fā)酵食品的發(fā)酵菌株或輔助發(fā)酵劑。在果蔬發(fā)酵中，短乳桿菌是起始發(fā)酵和主發(fā)酵階段主要的優(yōu)勢菌，對于發(fā)酵果蔬的品質形成發(fā)揮著多重作用，如改善食品風味、增進營養(yǎng)價值、產生風味物質、抑制雜菌生長等6-7。在發(fā)酵乳品

2、的生產中，短乳桿菌對干酪成熟的過程有一定的影響，能促進產品風味的形成8。在酸面團的發(fā)酵中，能促進面團的酸化和風味的形成，常與傳統(tǒng)面包酵母混合作為酸面團的發(fā)酵劑9-10。噬菌體是專性以細菌為宿主的病毒，分為烈性噬菌體和溫和噬菌體。烈性噬菌體是指能在短時間內完成吸附、侵入、增殖、成熟和裂解過程而實現增殖的噬菌體。乳酸菌發(fā)酵食品和益生菌菌劑生產中時常發(fā)生噬菌體污染，導致發(fā)酵產酸變慢，發(fā)酵周期延長，污染嚴重時會造成發(fā)酵菌株快速死亡，致使發(fā)酵失敗。烈性噬菌體的污染和增殖是導致發(fā)酵食品生產失敗的主要因素之一。如何防止噬菌體的污染是食品發(fā)酵生產過程需解決的一個重要問題。目前，發(fā)酵食品中乳酸菌噬菌體的研究主要

3、集中在乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)噬菌體11、植物乳桿菌(Lactococcusplantaraum)噬菌體12、干酪乳桿菌(Lactococcuscasei)噬菌體13等，而短乳桿菌噬菌體的研究較少，只有少數的文獻報道了相關的研究。DEASY等14從發(fā)酵的蔬菜中分離出短乳桿菌噬菌體，并研究了其在控制導致啤酒腐敗的短乳桿菌菌株方面的應用，結果表明其在啤酒中具有穩(wěn)定作用，能控制宿主菌的生長。鑒于短乳桿菌噬菌體對食品發(fā)酵的危害和目前短乳桿菌噬菌體的研究仍較缺乏，本實驗從發(fā)酵泡菜水環(huán)境中分離純化短乳桿菌烈性噬菌體，通過電鏡形態(tài)和核酸類型進行鑒定，并且研究了生物學特性，實驗結果為生

4、產中防治相關噬菌體的污染和進一步篩選抗噬菌體菌株奠定了基礎。1 材料與方法1.1 材料與試劑MRS培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱生物技術有限公司；柱法病毒DNA抽提試劑盒，廣州美基生物科技有限公司；Marker Q、RNase A、DNase I和T4連接酶，上海生工生物有限公司；DNA限制酶和DL 15 000 DNA marker，日本Takara公司；其余試劑為均為分析純。1.2 菌種和培養(yǎng)基1.2.1 菌種短乳桿菌CICC 6239，來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，用作于分離噬菌體的宿主菌。1.2.2 培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基：用于宿主菌的活化與培養(yǎng)。MRS-Ca培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中添加CaCl2至終

5、濃度為10 mmol/L，用于噬菌體的分離、純化與增殖。采用雙層平板法分離純化噬菌體時，下層平板采用1.5%(質量分數)瓊脂的MRS-Ca培養(yǎng)基，上層平板采用0.6%(質量分數)瓊脂的MRS-Ca培養(yǎng)基。1.3 儀器與設備UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；4-16K高速冷凍離心機，德國SIGMA公司；PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；EM-1200透射電子顯微鏡，日本Jeol公司。1.4 實驗方法1.4.1 噬菌體的分離與純化按1%的接種量將宿主菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng)至對數期前期(OD600nm約為0.

6、3)得到宿主菌液。分離樣品于5 000g離心5 min后，取上清液經0.22 m無菌微孔濾膜過濾后，取5 mL加入到含有5 mL兩倍濃度的MRS-Ca培養(yǎng)基中，然后加入宿主菌液100 L；用5 mL無菌蒸餾水替代樣品濾液作為空白對照。30 培養(yǎng)1216 h，觀察樣品管是否澄清。將已澄清的增殖液離心后，上清液過0.22 m無菌微孔濾膜過濾。取0.5 mL上述濾液加入到5 mL MRS-Ca液體培養(yǎng)基中，然后加入宿主菌液100 L，30 培養(yǎng)至完全澄清，采用0.22 m無菌微孔濾膜過濾，得到增殖液。采用雙層平板法分離噬菌體，增殖液用MRS-Ca培養(yǎng)基作10倍梯度稀釋，取合適稀釋度的稀釋液0.5 m

7、L與8 mL上層培養(yǎng)基(加熱融化后預冷至45 )混合，再加入0.2 mL的對數期前期的宿主菌液，混合后傾倒于預先倒好底層培養(yǎng)基的平板上，凝固后于30 培養(yǎng)24 h，觀察上層平板中形成的噬菌斑。用無菌牙簽挑取上層平板中含有清晰單個噬菌斑的小瓊脂塊，轉移到0.5 mL MRS-Ca培養(yǎng)基中，渦旋振蕩后，加入0.2 mL宿主菌液，然后與8 mL上層培養(yǎng)基混合后，傾倒于底層平板上，30 培養(yǎng)24 h形成噬菌斑。將雙層平板分離，挑取噬菌斑純化和增殖重復操作5次，得到純化后的噬菌體。1.4.2 噬菌體效價的測定采用雙層平板法測定噬菌體效價，待測增殖液用MRS-Ca培養(yǎng)基作10倍梯度稀釋，取合適稀釋度的稀釋

8、液100 L與等體積的宿主菌液混合后，加入到8 mL加熱融化后預冷至45 的上層培養(yǎng)基中，混合均勻傾倒于下層平板上，凝固后于30 培養(yǎng)24 h，通過平板上形成的噬菌斑數量計算噬菌體效價(pfu/mL)。1.4.3 透射電鏡觀察參考文獻15的方法并稍作修改后用于透射電鏡的觀察：純化后的噬菌體負染色后采用透射電子顯微鏡觀察毒粒形態(tài)。高效價(1010pfu/mL)的增殖液20 L滴加到覆蓋有聚醋酸甲基乙烯脂膜的銅網上，靜置20 min后，用2%的醋酸鈾酰染色10 min，待干燥后用透射電子顯微鏡在120 V下觀察并拍照。1.4.4 DNA提取與限制性酶切16高效價(1010pfu/mL)的增殖液5

9、mL中加入RNase A和DNase I至終質量濃度分別為1 g/mL，于37 保溫30 min，8 000g離心5 min后，取上清液采用病毒DNA抽提試劑盒提取噬菌體DNA。噬菌體基因組采用RNase A、Mung Bean Nuclease、DNase I和限制酶EcoR I和BamH I進行酶切，酶切產物于65 水浴中保溫10 min，然后用0.8%瓊脂糖電泳，GelRed染色后，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Quantitiy One軟件分析和估算酶切條帶的分子質量大小。噬菌體DNA用T4連接酶處理后置于4 冰箱12 h，連接產物用EcoR I和BamH I進行酶切，酶切產物瓊脂糖凝膠電泳，

10、分析噬菌體基因組的包裝機制。1.4.5 最佳感染復數的測定宿主菌接種到MRS-Ca中培養(yǎng)至對數中期(OD600nm=0.5)，采用平板菌落計數法測定活菌數。噬菌體新鮮增殖液經稀釋后，與宿主菌液按不同比例混合，使感染復數(multiplicity of infection，MOI)為10、1、0.1、0.01、0.001，30 100 r/min搖床上培養(yǎng)6 h后，8 000g離心5 min后，取上清液測定效價。1.4.6 一步生長曲線的測定取培養(yǎng)至對數中期(OD600nm=0.5)的宿主菌液10 mL，8 000g離心5 min棄上清液，用1 mL MRS-Ca培養(yǎng)基重懸菌體，按感染復數0.5

11、加入相應效價的噬菌體增殖液1 mL，于30 吸附30 min，8 000g離心5 min收集菌體細胞，重懸于100 mL MRS-Ca培養(yǎng)基中，于30 靜置培養(yǎng)，每隔0.5 h取樣測定上清液中的效價。一步生長曲線以時間為橫坐標，噬菌體效價的對數值為縱坐標繪制。1.4.7 物理與化學因素對噬菌體的影響1.4.7.1 溫度對噬菌體存活的影響噬菌體增殖液(108pfu/mL)各取2 mL裝入到離心管中，分別在不同溫度條件下處理，在0.5、1、2、5、10、20、30 min時取樣測定效價，結果以效價隨時間變化的曲線表示。1.4.7.2 pH對噬菌體存活的影響用1 mol/L的HCl和NaOH調整噬菌

12、體增殖液(108pfu/mL)的pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，30 靜置30 min后，取樣測定效價，結果以效價隨pH變化的曲線表示。1.4.7.3 化學消毒劑對噬菌體存活的影響噬菌體增殖液(108pfu/mL)中分別加入無水乙醇至終體積分數為30%、50%、75%，分別加入1%的次氯酸鈉溶液至終質量濃度為100、250、500 mg/L，在不同時間點取樣測定效價，結果以效價隨時間變化的曲線表示。1.4.8 數據處理與分析實驗測定重復3次，結果采用平均值標準差的形式表示。數據的統(tǒng)計學分析采用SPSS 20進行，不同處理件的數據采用單因素方差分析(one

13、-way ANOVA)進行，P0.05表示有顯著性差異。采用OriginPro 8.5.1進行繪圖。2 結果與分析2.1 噬菌體的分離與鑒定將經0.22 m濾膜過濾后的發(fā)酵泡菜水樣品與對數期的宿主菌菌液混合后，培養(yǎng)至澄清，培養(yǎng)液以10倍比例稀釋后，采用雙層平板法檢測，可見噬菌斑的形成。挑取單個噬菌斑經過雙層平板反復純化5次后，可在雙層平板上觀察到清晰透明的圓形噬菌斑，直徑約為12 mm。該純化后的噬菌體命名為B23。經負染色后的B23在透射電鏡下觀察其形態(tài)，如圖1所示。噬菌體B23無包膜，由頭部和尾部組成，全長(380.22.3) nm。頭部可觀察到典型的多面體結構，頭部直徑(106.78.1

14、) nm；尾部觀察到可彎曲的長尾，尾部長(216.72.7) nm，寬(24.71.2) nm，未觀察到尾部的長度可收縮。根據以上形態(tài)特征，按照國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)的分類標準17，噬菌體B23屬于尾噬菌體目(Caudovirales)、長尾噬菌體科(Siphoviridae)。圖1 噬菌體B23的負染色透射電鏡形態(tài)Fig.1 Transmission electron micrograph of phage B23 with negative staining2.2 噬菌體基因組的核酸類型與

15、限制性酶切如圖2-a所示，噬菌體B23的基因組經RNase A處理后瓊脂糖電泳未發(fā)現有明顯的降解，而B23基因組可以被DNase降解，表明噬菌體B23基因組的核酸類型是DNA而不是RNA，B23基因組不能被Mung Bean nuclease降解，表明不是單鏈核酸。綜合以上結果可知其基因組為雙鏈DNA。噬菌體B23的基因組和經T4連接酶過夜處理后的基因組用BamH I和EcoR I酶切后的瓊脂糖電泳圖譜如圖2-b所示。噬菌體B23的基因組能被限制性內切酶切開，經BamH I酶切可產生8條條帶，EcoR I酶切可產生10條條帶，根據酶切片段大小估算噬菌體B23的基因組大小約為52.4 kb(圖2

16、-c)?；蚪M經T4連接酶處理后，BamHI酶切后的條帶數比未連接基因組的酶切條帶有減少，表明噬菌體B23基因組的包裝機制是黏末端連接。2.3 最佳感染復數的測定將噬菌體B23和宿主菌按不同的比例混合后，用雙層平板法檢測上清液中子代噬菌體的效價，結果如表1所示。當感染復數從10降至0.001時，子代噬菌體的效價逐漸增加，到0.001時達到最大，為(8.970.13) lgpfu/mL；而感染復數從0.001到0.000 1 變化時，效價出現降低的趨勢。因此，噬菌體B23的最佳感染復數為0.001。a-RNase A、Mung Bean nuclease和DNase I酶切后的電泳圖(1-噬菌體

17、B23基因組；2-基因組經RNase A酶切；3-基因組經Mung Bean nuclease酶切； 4-基因組經DNase I酶切)；b-限制性酶切后的電泳圖(M1-marker Q；5-基因組BamH I 酶切；6-基因組經T4連接酶處理后再用BamH I酶切； M2-DL 15 000 DNA marker；7-基因組EcoR I 酶切；8-基因組經T4連接酶處理后再用EcoR I 酶切)；c-基因組分子質量大小分析圖2 噬菌體基因組的酶切電泳圖及分子質量分析Fig.2 Agarose gel electrophoresis of phage B23 genome and analysi

18、s of its molecular weight表1 噬菌體B23最佳感染復數的測定Table 1 Determination of multiplicity of infection注：小寫字母表示不同MOI得到的效價有顯著性差異(P0.05)2.4 一步生長曲線噬菌體B23的一步生長曲線如圖3所示。從00.5 h時，噬菌體效價無明顯的變化，而從0.52 h時，噬菌體效價迅速增加，2 h以后效價基本不出現較大的變化進入平臺期。從以上的效價隨時間的變化趨勢可知，噬菌體B23的潛伏期為30 min，裂解期為90 min，每個宿主細胞產生的子代噬菌體，即裂解量為(103.29.0) pfu/ce

19、ll。圖3 噬菌體B23的一步生長曲線Fig.3 One-step growth curve of phage B232.5 物理與化學因素對噬菌體的影響溫度對噬菌體存活的影響如圖4所示，試驗選擇了巴氏滅菌常用的63 和72 ，以及50 條件下，檢測噬菌體效價隨時間的變化。當溫度為72 時，噬菌體效價下降很快，處理1 min后，效價損失了將近60%，2 min后，存活率為未處理時的14.6%，5 min 后效價接近于0，活性基本喪失。當溫度為63 時，效價隨時間的下降過程較72 平緩，2 min后效價下降至5.48 lgpfu/mL，5 min后為3.12 lgpfu/mL，10 min后的處

20、理上清液在雙層平板上培養(yǎng)后觀察不到有噬菌斑的出現。當溫度為50 時，噬菌體滅活的速度較慢，處理10 min后，效價下降至5.62 lgpfu/mL，30 min 后效價接近為0，表明噬菌體被滅活。圖4 溫度對噬菌體B23存活的影響Fig.4 Effect of temperature on viability of phage B23圖5顯示了pH值對噬菌體存活的影響。在pH 3.08.0，噬菌體效價穩(wěn)定，與初始效價相比無顯著性差異，表明噬菌體B23的耐酸性較好，在酸性和中性環(huán)境中維持了良好的裂解活性，符合其宿主短乳桿菌的生境特點。當pH高于8.0時，噬菌體的效價下降明顯，pH 10.0時效價

21、僅為初始效價的一半，表明噬菌體的耐堿性環(huán)境能力較弱。圖5 pH對噬菌體B23存活的影響Fig.5 Effect of pH on viability of phage B23常用消毒劑乙醇和次氯酸鈉對噬菌體B23的滅活作用如圖6所示。用75%的乙醇處理，噬菌體活性迅速下降，作用5 min，噬菌體效價跌至0.46 lgpfu/mL，10 min時完全喪失活性。當乙醇體積分數為50%時，噬菌體效價下降較慢，處理5 min效價為5.11 lgpfu/mL，10 min時為2.17 lgpfu/mL，20 min后完全滅活。而當采用30%的乙醇處理，在測定的30 min范圍內，噬菌體效價下降程度有限，

22、處理30 min后，效價還能維持在4.54 lgpfu/mL，表明噬菌體能耐受該濃度的乙醇。采用次氯酸鈉作為消毒劑的試驗中，500 mg/L的次氯酸鈉能迅速滅活，處理2 min 效價降至0.68 lgpfu/mL，5 min后完全滅活。采用250 mg/L也有較好的滅活效果，處理5 min效價為1.58 lgpfu/mL，10 min后完全滅活。當次氯酸鈉質量濃度為100 mg/L 時仍能有一定的滅活作用，處理20 min效價為3.24 lgpfu/mL，30 min后，殘存的效價為0.82 lgpfu/mL，表明實現了基本滅活。a-乙醇；b-洗氯酸鈉圖6 消毒劑對噬菌體B23的滅活作用Fig

23、.6 Inactivation of phage B23 by disinfectant3 討論噬菌體廣泛存在于食品發(fā)酵生產過程的環(huán)境中，噬菌體污染是導致發(fā)酵失敗的重要原因之一。與溫和噬菌體相比，烈性噬菌體由于能快速裂解發(fā)酵菌株細胞，造成菌株在短時間內大量死亡，使得發(fā)酵變慢甚至停滯，對發(fā)酵的危害更大。本研究以短乳桿菌為宿主菌，從發(fā)酵泡菜水中分離和純化烈性噬菌體。由于樣品中天然存在的噬菌體濃度很低，如果對樣品直接采用雙層平板法分離，培養(yǎng)后常常無法觀察到清晰的噬菌斑，造成分離失敗。本實驗采用生長至對數期中前期的宿主菌與過濾后的樣品共培養(yǎng)，與不加樣品的空白對照相比，通過觀察培養(yǎng)液是否變澄清，來判定樣

24、品中是否有該宿主菌的噬菌體，同時也對樣品中的目標噬菌體進行了富集，提高了分離的成功率。本文對短乳桿菌烈性的分離和生物學特性研究，為篩選抗噬菌體發(fā)酵菌株，建立防御噬菌體的方法和手段，開展相關研究奠定基礎。噬菌體的分類鑒定一般按照ICTV制定的方案17-18，依據為噬菌體的電鏡形態(tài)和核酸類型。目前已報道的短乳桿菌噬菌體14,19-20分屬于尾病毒目(Caudovirales)下的兩個不同的科，分別是肌尾噬菌體科(Myoviridae)和長尾噬菌體科(Siphoviridae)，其中屬于肌尾噬菌體科(Myoviridae)的短乳桿菌噬菌體較為多見。本研究中分離純化的噬菌體B23電鏡形態(tài)無包膜，由多面

25、體結構的頭部和可彎曲的長尾構成，B23的核酸為雙鏈DNA，以上特征符合尾病毒目(Caudovirales)的描述。此外，由于在電鏡形態(tài)中未觀察到尾部的長度可收縮，表明其屬于長尾噬菌體科(Siphoviridae)。具有雙鏈DNA的噬菌體其染色體呈線狀，在DNA復制過程中先形成多連體，然后在DNA包裝過程中切成所需要的長度，切出的末端可能為平末端，也可能為黏性末端21。黏性末端經連接酶處理后，堿基通過互補配對原則連接在一起，加熱處理后仍保持穩(wěn)定，再經過限制性酶切，會導致條帶數目減少；如末端為平末端，經連接酶處理后不穩(wěn)定，在較高溫度下連接會被加熱破壞而斷開，經限制酶切后條帶數與未連接時沒有變化22。本實驗分離的噬菌體B23的基因組經T4連接酶處理后，BamH I酶切后的條帶數減少，表明其包裝機制為黏末端連接。噬菌體侵染宿主細胞后，先經歷一段潛伏期，然后再進入裂解期。潛伏期長短和裂解量是衡量烈性噬菌體裂解能力的指標之一。目前關