細胞相容性評價(醫(yī)學(xué)相關(guān))課件

材料的生物相容性評價材料科學(xué)與工程系1優(yōu)質(zhì)課件材料的生物相容性評價1優(yōu)質(zhì)課件第四節(jié)細胞相容性評價2優(yōu)質(zhì)課件第四節(jié)細胞相容性評價2優(yōu)質(zhì)課件2.1簡介細胞和生物材料的相互作用有兩種主要的方式：特異性和非特異性的相互作用。非特異性的作用通常很難控制，因為這種相互作用所基于的性質(zhì)對于多數(shù)細胞類型來講是共同擁有的，這些性質(zhì)包括細胞的表面性質(zhì)，如細胞膜表面的負電荷性，細胞膜表面的親脂性膜蛋白，和能夠介導(dǎo)細胞在生物材料表面非特異性粘附的親脂性細胞外基質(zhì)蛋白。相反，特異性的相互作用更加容易控制，這是因為它們的相互作用是基于特定的化學(xué)和生物學(xué)結(jié)構(gòu)，如能夠和細胞表面受體結(jié)合的配體。“生物仿生化”的和“生物活性”的材料能夠控制這些精細的相互作用。3優(yōu)質(zhì)課件2.1簡介細胞和生物材料的相互作用有兩種主要的方式：特異性2.2細胞相容性的評價方法細胞生物相容性評價是生物材料生物相容性評價的一項重要內(nèi)容，是指應(yīng)用體外細胞培養(yǎng)的方法，通過檢測材料或者其浸提液對細胞生長情況的影響來評價材料對細胞的毒性。細胞毒性試驗作為檢測生物材料毒性的手段，具有簡便、敏感性高、節(jié)省動物、節(jié)約經(jīng)費、縮短生物材料研究周期等優(yōu)點，目前幾乎所有的生物材料都必須通過相關(guān)實驗來檢測其是否具有細胞毒性，已被廣泛應(yīng)用于生物相容性評價。4優(yōu)質(zhì)課件2.2細胞相容性的評價方法細胞生物相容性評價是生物材料生在ISO10993-5標準中對試驗的主要步驟、細胞株和細胞培養(yǎng)基、陰性和陽性對照都作了原則要求，并推薦了瓊脂覆蓋法和分子擴散法（即濾過法）。近年來進一步發(fā)展細胞毒性試驗，從形態(tài)學(xué)方法檢測細胞損傷、細胞損傷測定、細胞生長測定和細胞代謝特性測定等角度提出了不少試驗方法，并從定性評價逐漸向定量測定發(fā)展，一些常用的細胞毒性實驗方法如下：5優(yōu)質(zhì)課件在ISO10993-5標準中對試驗的主要步驟、細胞株和細（一）細胞形態(tài)學(xué)評價：細胞形態(tài)學(xué)評價一種發(fā)展最早的定性細胞損傷檢測方法，材料導(dǎo)致細胞損傷從而發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變，通過顯微鏡下觀察到變圓或裂解細胞所占的百分比來估算細胞毒性級別。目測該細胞毒性試驗方無法定量細胞毒性大小，由于該方法可直觀地觀察到材料細胞毒性的大小，所以目前仍被廣泛用于生物材料細胞毒性的評價。6優(yōu)質(zhì)課件（一）細胞形態(tài)學(xué)評價：細胞形態(tài)學(xué)評價一種發(fā)展最早的定性細胞損（二）細胞膜完整性測定：生物材料對細胞的毒性作用也反映在細胞膜的變化中，細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整對于將細胞與其周圍環(huán)境分離起重要作用。中性紅攝取試驗法。檢測原理是未受損的細胞可攝取中性紅染料并將其蓄積在溶酶體內(nèi)，活細胞攝入中性紅的水平與活細胞的數(shù)量成正比。乳酸脫氫酶釋放法。LDH是一種存在于活細胞中穩(wěn)定的胞質(zhì)酶，其滲出增加提示細胞膜的穩(wěn)定性遭到破壞。通過測定進入介質(zhì)的LDH釋放的滲透性能夠檢測細胞膜的完整性，進而反映細胞活性。7優(yōu)質(zhì)課件（二）細胞膜完整性測定：生物材料對細胞的毒性作用也反映在細胞（三）細胞代謝活性評價：線粒體琥珀酸脫氫酶作為生物學(xué)終點的評價方法應(yīng)用最廣泛。線粒體病變被認為是表示細胞受損傷最靈敏的指征之一，所以可以十分靈敏地反映出材料對細胞造成的毒性損害程度。MTT法是一種快速評定細胞毒性和細胞增殖的比色分析法，常用于細胞代謝和功能的測定。在MTT試驗法的基礎(chǔ)上發(fā)展了XTT試驗法。XTT法實驗時間短、步驟簡便，目前已廣泛用于生物材料的相容性評價。由于該法較MTT法具有明顯的優(yōu)點，已被納入國際標準ISO10993-5:2009中，但實驗成本較MTT法高。MTT法、XTT法、CCK-8法8優(yōu)質(zhì)課件（三）細胞代謝活性評價：8優(yōu)質(zhì)課件（四）細胞增殖率評價：觀察材料或材料浸提液與細胞接觸后細胞生長速度和增殖率的改變，主要有克隆形成試驗。（五）細胞增殖相關(guān)蛋白檢測（六）細胞周期的檢測9優(yōu)質(zhì)課件（四）細胞增殖率評價：觀察材料或材料浸提液與細胞接觸后細胞生綜上所述，評價生物材料的體外細胞生物相容性試驗方法較多，亦各有其特點。各試驗方法之間雖然存在一定的相關(guān)性，但是很難達到完全一致性。因此在選擇試驗方法時，必須根據(jù)“最接近應(yīng)用狀況”的原則，合理地選擇樣品與細胞的接觸方式和檢測生物學(xué)終點的評價指標或評價方法。綜合運用分子水平評價方法，闡明材料對細胞的作用機制，全面地評價生物材料對細胞的毒性作用，將是生物材料細胞生物相容性評價的發(fā)展方向。10優(yōu)質(zhì)課件綜上所述，評價生物材料的體外細胞生物相容性試驗方法較多，亦各2.3細胞培養(yǎng)技術(shù)司徒鎮(zhèn)強《細胞培養(yǎng)》11優(yōu)質(zhì)課件2.3細胞培養(yǎng)技術(shù)司徒鎮(zhèn)強《細胞培養(yǎng)》11優(yōu)質(zhì)課件1.研究的對象是活細胞能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等2.3.1細胞培養(yǎng)的優(yōu)點2.研究條件可以人為控制選擇對象：均一性、重復(fù)性（類型/性質(zhì)/階段）調(diào)節(jié)條件：化學(xué)、物理、生物等因素條件研究方法：各種研究技術(shù)、記錄方法12優(yōu)質(zhì)課件1.研究的對象是活細胞2.3.1細胞培養(yǎng)的優(yōu)點2.研究條3.研究的范圍比較廣泛學(xué)科多：細胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等對象廣：各種動物：低等動物--高等動物--人類

一種動物：不同年齡--不同組織：正常或異常（腫瘤4.研究的費用相對較經(jīng)濟

可提供大量、同一時期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實驗對象13優(yōu)質(zhì)課件3.研究的范圍比較廣泛4.研究的費用相對較經(jīng)濟

可提供大量、人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同。當細胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中久了，必然發(fā)生變化。1.與體內(nèi)主要不同

相對孤立、單一，缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響2.主要表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)

分化減弱或不明顯,細胞趨向單一化2.3.2細胞培養(yǎng)的缺點14優(yōu)質(zhì)課件人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同。當細胞被置于體外提示對于體外培養(yǎng)的細胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持動物體內(nèi)原細胞一定的性狀、結(jié)構(gòu)和功能又具有某些改變的特定的細胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細胞完全等同。15優(yōu)質(zhì)課件提示對于體外培養(yǎng)的細胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持動物體初代培養(yǎng)/原代培養(yǎng)（primaryculture）

從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。初代培養(yǎng)物一旦進行傳代培養(yǎng)后，就成為細胞系。通常10代以內(nèi)的培養(yǎng)物用作原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)（sub-culture）

不論是否稀釋，在體外培養(yǎng)條件下，將細胞從一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)器皿。2.3.3常用術(shù)語16優(yōu)質(zhì)課件初代培養(yǎng)/原代培養(yǎng)（primaryculture）傳代培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)（anchorage-dependentculture）

細胞或培養(yǎng)物只有貼附于不起化學(xué)作用的物體（玻璃或塑料等無活性物體）的表面時才能生長、生存或維持功能。不能表明細胞屬于正?；驉盒赞D(zhuǎn)化懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）細胞或細胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖的一種培養(yǎng)方式。

淋巴細胞、血液腫瘤細胞等。17優(yōu)質(zhì)課件貼壁培養(yǎng)（anchorage-dependentcultu細胞株（cellstrain）

通過篩選或克隆化從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標志的細胞。這些特性（有一定的標記染色體、特殊的抗原性等）在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。亞株（substrain）

由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀有一定不同的細胞群。18優(yōu)質(zhì)課件細胞株（cellstrain）18優(yōu)質(zhì)課件細胞凋亡（apoptosis）細胞內(nèi)死亡程序的開啟而導(dǎo)致細胞自殺的過程。與機體正常發(fā)育、形態(tài)形成、消除多余細胞等生理過程密切相關(guān)。主要形態(tài)特征為細胞皺縮、染色質(zhì)聚集與周邊化，以及凋亡小體的形成。ATCC（Americantypeculturecollection）

美國模式培養(yǎng)物收集中心/美國菌種保藏中心。除收集細菌、病毒外，還保藏有大量的細胞株（系）。19優(yōu)質(zhì)課件細胞凋亡（apoptosis）ATCC（Americant體外轉(zhuǎn)化（invitrotransformation）

細胞在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生與原代細胞形態(tài)、抗原、增殖或其它特性的可遺傳的變化，但不具有致瘤性。匯合（confluence）

在瓶中培養(yǎng)的細胞彼此匯合形成單層。細胞融合（cellfusion）

在體外培養(yǎng)條件下，經(jīng)化學(xué)試劑（PEG）、病毒（滅活仙臺病毒）或物理方法（電脈沖）誘發(fā)，使不同種的體細胞融合產(chǎn)生雜交細胞。20優(yōu)質(zhì)課件體外轉(zhuǎn)化（invitrotransformation）匯細胞周期（cellcycle）

細胞從前一次分裂結(jié)束開始至本次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時相過程。DNA合成期（S期）、有絲分裂期（M期）、有絲分裂完成至DNA合成開始的間隙期（G1期）、DNA復(fù)制結(jié)束至有絲分裂開始的間隙期（G2期）。群體倍增時間（populationdoublingtime）

在對數(shù)生長期進行計算的細胞增加一倍所需的時間。細胞代時（cellgenerationtime）

單個細胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。21優(yōu)質(zhì)課件細胞周期（cellcycle）群體倍增時間（populat群體密度（populationdensity）

培養(yǎng)器皿內(nèi)，每單位面積或體積中的細胞數(shù)，多用細胞數(shù)/cm2表示。接觸抑制（contactinhibition）

當一個貼壁生長的體外正常細胞生長至與另一個細胞表面相互接觸時，便停止了分裂增殖，雖然相互緊密接觸，但不形成交叉重疊生長，也不再進入S期。飽和密度（saturationdensity）

在特定條件下，培養(yǎng)皿內(nèi)能達到的最高細胞數(shù)，當細胞達到飽和密度后細胞群體停止繁殖，貼壁培養(yǎng)：細胞數(shù)/cm2；懸浮培養(yǎng)：細胞數(shù)/cm3。22優(yōu)質(zhì)課件群體密度（populationdensity）接觸抑制（c2.3.4常用設(shè)備和培養(yǎng)基1.實驗用品超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管23優(yōu)質(zhì)課件2.3.4常用設(shè)備和培養(yǎng)基1.實驗用品23優(yōu)質(zhì)課件壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒24優(yōu)質(zhì)課件壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣24優(yōu)質(zhì)課件超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。25優(yōu)質(zhì)課件超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除滅菌器壓力（磅）溫度（度）5108.410115.215121.020126.025130.430134.526優(yōu)質(zhì)課件滅菌器壓力（磅）溫度（度）5108.410115.21512濾器27優(yōu)質(zhì)課件濾器27優(yōu)質(zhì)課件CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒(90℃，14h)。③箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。28優(yōu)質(zhì)課件CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2顯微鏡29優(yōu)質(zhì)課件顯微鏡29優(yōu)質(zhì)課件自動雙重純水蒸餾器純水儀30優(yōu)質(zhì)課件自動雙重純水蒸餾器純水儀30優(yōu)質(zhì)課件微孔板震蕩器酶標儀31優(yōu)質(zhì)課件微孔板震蕩器酶標儀31優(yōu)質(zhì)課件培養(yǎng)板32優(yōu)質(zhì)課件培養(yǎng)板32優(yōu)質(zhì)課件培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿33優(yōu)質(zhì)課件培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿33優(yōu)質(zhì)課件移液管，移液槍34優(yōu)質(zhì)課件移液管，移液槍34優(yōu)質(zhì)課件常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干35優(yōu)質(zhì)課件常用玻璃器皿清洗35優(yōu)質(zhì)課件塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的成品，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用：2%NaOH浸泡過夜自來水充分沖洗，洗潔精洗刷5%鹽酸溶液浸泡30分鐘自來水和蒸餾水沖洗（15－20遍）晾干備用,紫外線直接照射或輻照滅菌

36優(yōu)質(zhì)課件塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的成品，橡膠制品的清洗每次用后立即置入水中浸泡沖洗2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)自來水沖洗1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘晾干備用注意：橡膠器材需用鋁鉑包裝，放在鋁盒內(nèi)高壓蒸汽滅菌37優(yōu)質(zhì)課件橡膠制品的清洗每次用后立即置入水中浸泡沖洗2%NaOH或金屬制品的清洗

洗滌劑刷洗

流水沖洗去離子水浸泡24小時三蒸水浸泡24小時

干燥備用38優(yōu)質(zhì)課件金屬制品的清洗洗滌劑刷洗38清潔液的配制39優(yōu)質(zhì)課件清潔液的配制39優(yōu)質(zhì)課件2細胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20g加水至1000ml40優(yōu)質(zhì)課件2細胞培養(yǎng)用液的配制40優(yōu)質(zhì)課件消化液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用41優(yōu)質(zhì)課件消化液：41優(yōu)質(zhì)課件培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。

成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染42優(yōu)質(zhì)課件培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、

DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。43優(yōu)質(zhì)課件合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分44優(yōu)質(zhì)課件血清中含有：44優(yōu)質(zhì)課件一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死．但支持細胞生長一般需加10％血清．對于血清支持細胞生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚．血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學(xué)特性是細胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞．45優(yōu)質(zhì)課件一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細胞株，近20多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產(chǎn)物的程序。46優(yōu)質(zhì)課件無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，向無清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的。適用于某種細胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細胞株的生長。即使同源組織的不同細胞株，所需補加物也不同。無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清。47優(yōu)質(zhì)課件向無清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的。適用于某種血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌48優(yōu)質(zhì)課件血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。48優(yōu)質(zhì)課件抗生素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗生素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定49優(yōu)質(zhì)課件抗生素的使用：49優(yōu)質(zhì)課件2.3.5無菌操作1.培養(yǎng)室和超凈臺的消毒消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。2.洗手和著裝進入無菌培養(yǎng)室原則上需徹底洗手并按外科手術(shù)要求著裝；無菌服、帽子和口罩每次實驗后，均需清洗、消毒；操作前要用75％酒精或0.2％新潔爾滅消毒手和前臂。50優(yōu)質(zhì)課件2.3.5無菌操作1.培養(yǎng)室和超凈臺的消毒50優(yōu)質(zhì)課件

3.無菌培養(yǎng)操作火焰消毒在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。操作時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。51優(yōu)質(zhì)課件3.無菌培養(yǎng)操作51優(yōu)質(zhì)課件無菌培養(yǎng)操作工作臺面上的用品要放置有序、布局合理，一般酒精燈位于中間，右手使用的在右側(cè)，左手使用的在左側(cè)。移液管、尖吸管不應(yīng)交叉使用，防止交叉污染。52優(yōu)質(zhì)課件無菌培養(yǎng)操作52優(yōu)質(zhì)課件2.3.6培養(yǎng)細胞的污染不僅指微生物，而且包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物。包括微生物、細胞和化學(xué)物質(zhì)。53優(yōu)質(zhì)課件2.3.6培養(yǎng)細胞的污染不僅指微生物，而且包括所有混入培養(yǎng)微生物污染的檢測微生物污染的種類可分成細菌、真菌、病毒和支原體。無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等是主要的污染源。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。54優(yōu)質(zhì)課件微生物污染的檢測微生物污染的種類可分成細菌、真菌、病毒和支原細菌和真菌的污染和檢測肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法55優(yōu)質(zhì)課件細菌和真菌的污染和檢測55優(yōu)質(zhì)課件真菌污染培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物肉眼可見，短期內(nèi)培養(yǎng)液不混濁鏡下可見在細胞之間有綜合交錯穿行的絲狀、管狀及樹枝狀菌絲，并懸浮漂蕩在培養(yǎng)液中，也可通過染色加以判斷。細胞被霉菌污染的鏡檢圖細胞被白色念球菌污染的鏡檢圖56優(yōu)質(zhì)課件真菌污染培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物細胞被霉菌污染的鏡檢圖57優(yōu)質(zhì)課件57優(yōu)質(zhì)課件細胞被真菌污染的鏡檢圖細胞污染的電鏡照片58優(yōu)質(zhì)課件細胞被真菌污染的鏡檢圖細胞污染的電鏡照片58優(yōu)質(zhì)課件細菌污染多為大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單胞菌等污染污染后，培養(yǎng)基顏色短期變黃，出現(xiàn)渾濁鏡下可見大量圓球狀顆粒漂浮物，細胞生長停止并有中毒表現(xiàn)可通過革蘭染色和肉湯接種加以鑒定多發(fā)生在接種的48h以內(nèi)59優(yōu)質(zhì)課件細菌污染多為大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單胞菌等污染59優(yōu)質(zhì)課支原體的污染和檢測支原體高污染率的原因：支原體最小直徑0.2m，無細胞壁，約有1%可透過濾菌器(0.22-0.45m)；支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化；過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式，研究人員忽略污染問題。支原體的檢測熒光染色法電鏡檢查DNA分子雜交檢查或支原體培養(yǎng)60優(yōu)質(zhì)課件支原體的污染和檢測支原體高污染率的原因：60優(yōu)質(zhì)課件2.3.7細胞培養(yǎng)技術(shù)

1.細胞的原代培養(yǎng)是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、細胞的衰老、死亡等生命現(xiàn)象。幼稚狀態(tài)的組織和細胞，如動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養(yǎng)61優(yōu)質(zhì)課件2.3.7細胞培養(yǎng)技術(shù)

1.細胞的原代培養(yǎng)是將機體內(nèi)的某組意義原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點是細胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多數(shù)細胞表現(xiàn)出原來組織的特性。利用原代培養(yǎng)做各種實驗（藥物測試、細胞分化及病毒學(xué)方面）效果很好。原代培養(yǎng)也是建立各種細胞系（株）必須經(jīng)過的階段。62優(yōu)質(zhì)課件意義原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點是細胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變實驗材料實驗動物：孕鼠或新生小鼠液體：細胞生長液（內(nèi)含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡鹽溶液

70%乙醇器材：滅菌鑷子、剪刀、滅菌培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)瓶、小瓶、燒杯、吸管、酒精燈63優(yōu)質(zhì)課件實驗材料實驗動物：孕鼠或新生小鼠63優(yōu)質(zhì)課件原代細胞培養(yǎng)方法胰酶消化法組織塊直接培養(yǎng)法冷消化溫消化一次性消化分次消化

消化法：采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個細胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。64優(yōu)質(zhì)課件原代細胞培養(yǎng)方法胰酶消化法冷消化溫消化一次性消化分次消化貼塊法消化法原代培養(yǎng)方法分類65優(yōu)質(zhì)課件貼塊法消化法原代培養(yǎng)方法分類65優(yōu)質(zhì)課件分次消化

消化法的分類66優(yōu)質(zhì)課件分次消化消化法的分類66優(yōu)質(zhì)課件組織塊培養(yǎng)步驟圖解67優(yōu)質(zhì)課件組織塊培養(yǎng)步驟圖解67優(yōu)質(zhì)課件操作步驟1---取材用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。剔除胚胎周圍的包膜（若胚胎較大，應(yīng)剪去頭、爪），將胚胎放于無菌的含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中。漂洗胚胎，去掉平衡鹽溶液。繼續(xù)用平衡鹽溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。68優(yōu)質(zhì)課件操作步驟1---取材用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。68優(yōu)質(zhì)操作步驟2---切割將部分胚胎轉(zhuǎn)移至一個無菌小瓶中，用平衡鹽溶液漂洗。然后用眼科手術(shù)剪刀小心地絞碎胚胎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置，使組織塊自然沉淀到管底，棄上清。69優(yōu)質(zhì)課件操作步驟2---切割將部分胚胎轉(zhuǎn)移至一個無菌小瓶中，用平衡70優(yōu)質(zhì)課件70優(yōu)質(zhì)課件胰酶消化法操作步驟

---消化、接種培養(yǎng)視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。加入3-5ml細胞生長液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。靜置5-10min，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。1000rpm，離心5-10min，棄上清液。加入平衡鹽溶液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。加入細胞生長液l-2ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。將細胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。71優(yōu)質(zhì)課件胰酶消化法操作步驟---消化、接種培養(yǎng)視組織塊量加入5-胰酶消化法操作步驟

---消化、接種培養(yǎng)也可將此步驟簡化為：視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振蕩一次。靜置，吸去上清，用細胞生長液漂洗消化后的組織塊，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使細胞分離，靜置，使未分散的組織塊下沉。取細胞懸液接種至加了細胞生長液的培養(yǎng)瓶中（調(diào)整細胞濃度到5×105/ml左右），37℃下培養(yǎng)。（注意：省略了離心、計數(shù)等步驟）72優(yōu)質(zhì)課件胰酶消化法操作步驟---消化、接種培養(yǎng)也可將此步驟簡化為組織塊直接培養(yǎng)法操作步驟組織塊接種：將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附于瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將細胞生長液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。37℃靜置3-5h，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入細胞生長液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。73優(yōu)質(zhì)課件組織塊直接培養(yǎng)法操作步驟組織塊接種：73優(yōu)質(zhì)課件原代細胞培養(yǎng)結(jié)果細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長如接種的細胞密度適宜，5-7d即可形成單層74優(yōu)質(zhì)課件原代細胞培養(yǎng)結(jié)果細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長72

傳代細胞培養(yǎng)細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3-6次培養(yǎng)的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細胞分散，從容器中取出，以1:2或1:3以上的比率轉(zhuǎn)移到新的容器中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。75優(yōu)質(zhì)課件2傳代細胞培養(yǎng)細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期細胞傳代方法根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種。1.懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞慢慢沉淀在瓶壁后，將上清培養(yǎng)液去除1/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2.半懸浮生長細胞傳代（HeLa細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3.貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用消化液是0.25％胰蛋白酶液。76優(yōu)質(zhì)課件細胞傳代方法根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種。76優(yōu)質(zhì)課件消化法傳代培養(yǎng)步驟77優(yōu)質(zhì)課件消化法傳代培養(yǎng)步驟77優(yōu)質(zhì)課件選取生長良好的細胞，在超凈工作臺的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入2-3

ml的D-Hanks液，輕輕振蕩漂洗細胞，以除去懸浮在細胞表面的碎片.加入適量0.1-0.25％胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液用Hanks液洗滌1次，加入適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細胞，使其成細胞懸液。以1:2或1:3進行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察：細胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細胞的生長情況。貼壁生長細胞傳代方法78優(yōu)質(zhì)課件選取生長良好的細胞，在超凈工作臺的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培3培養(yǎng)細胞生長測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。

任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。方法：細胞計數(shù)法臺盼藍染色法生長曲線法四唑鹽（MTT）比色法79優(yōu)質(zhì)課件3培養(yǎng)細胞生長測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。細胞計數(shù)用細胞計數(shù)法測定細胞生長動力學(xué)是目前采用的最普遍的方法。血細胞計數(shù)板人工計數(shù)細胞計數(shù)器血細胞計數(shù)板：常用的是改良的紐巴氏(Neubauer)血細胞計數(shù)板。80優(yōu)質(zhì)課件細胞計數(shù)用細胞計數(shù)法測定細胞生長動力學(xué)是目前采用的最普遍的方實驗原理：血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2

大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0×10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。存活測試為利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。81優(yōu)質(zhì)課件實驗原理：81優(yōu)質(zhì)課件具體操作：

1.將計數(shù)板及蓋片用75%酒精擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板。

2.吸取少許混合均勻的細胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。3.計算板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按公式計算：細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液82優(yōu)質(zhì)課件具體操作：

注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按4個16格總數(shù)4×104個/ml83優(yōu)質(zhì)課件4個16格總數(shù)4×104個/ml83優(yōu)質(zhì)課件由于死細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進入?yún)s不被排出，因而細胞呈色。而活細胞反之，能排出進入細胞內(nèi)的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細胞對染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開兩種細胞。臺盼藍染細胞時，時間不宜過長（約2min）。臺盼藍排除檢測法84優(yōu)質(zhì)課件由于死細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進入?yún)s不被排①將1滴細胞懸液(貼壁細胞可經(jīng)0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細胞懸液)與2滴臺盼藍液混合后，滴入細胞計數(shù)板。②2min后，在顯微鏡下計數(shù)至少200個細胞。未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞。計算活細胞百分比?；铙w染色與細胞計數(shù)85優(yōu)質(zhì)課件①將1滴細胞懸液(貼壁細胞可經(jīng)0.25％胰蛋白酶溶液消化后，細胞生長曲線的繪制細胞生長曲線(cellgrowthcurve)是觀測細胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標，可根據(jù)細胞生長曲線分析細胞增殖速度，確定細胞傳代、細胞凍存或具體實驗的最佳時間。它以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標作坐標圖。86優(yōu)質(zhì)課件細胞生長曲線的繪制細胞生長曲線(cellgrowthc1)培養(yǎng)細胞首先在2４孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細胞。計數(shù)并記錄接種的細胞懸液之密度。接種時間記為0h。2)計數(shù)細胞密度從接種時間算起，每隔24

h計數(shù)３孔內(nèi)的細胞密度，算出平均值。為提高準確率，對每孔細胞可計數(shù)2-3次。如此操作至第七天結(jié)束。3)繪制曲線

以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度

為縱坐標，將全部結(jié)果在坐標紙

上繪圖，即得所培養(yǎng)細胞的生長

曲線。87優(yōu)質(zhì)課件1)培養(yǎng)細胞3)繪制曲線87優(yōu)質(zhì)課件四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍四唑鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比，用酶標儀測定OD570nm值。MTT法簡單快速、準確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。四唑鹽（MTT）比色法88優(yōu)質(zhì)課件四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍四唑鹽（MTT）比色法88優(yōu)質(zhì)操作步驟100L單細胞懸液接種于96孔板(5×104)。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間加入2mg/ml的MTT液（50L/孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150L/孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10min，使結(jié)晶物溶解。酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長570nm）。記錄結(jié)果。89優(yōu)質(zhì)課件操作步驟100L單細胞懸液接種于96孔板(5×104)。4.貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）90優(yōu)質(zhì)課件4.貼附生長細胞的生長過程游離期90優(yōu)質(zhì)課件游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。

10分鐘—4小時91優(yōu)質(zhì)課件游離期：91優(yōu)質(zhì)課件貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細胞株平均在10分鐘-4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團）92優(yōu)質(zhì)課件貼壁期：92優(yōu)質(zhì)課件93優(yōu)質(zhì)課件93優(yōu)質(zhì)課件潛伏期

此時細胞有生長活動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6-24小時。對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性94優(yōu)質(zhì)課件潛伏期對數(shù)生長期：停止期（平臺期）：94優(yōu)質(zhì)課件95優(yōu)質(zhì)課件95優(yōu)質(zhì)課件5.培養(yǎng)細胞生長性狀的觀察1.常規(guī)觀察2.活細胞的觀察3.細胞生長狀況的觀察96優(yōu)質(zhì)課件5.培養(yǎng)細胞生長性狀的觀察1.常規(guī)觀察96優(yōu)質(zhì)課件975.1常規(guī)觀察細胞經(jīng)原代培養(yǎng)后及傳代或換液后均需進行連續(xù)的、動態(tài)性觀察。每日或隔日觀察一次，并做好相關(guān)記錄?；罴毎螒B(tài)數(shù)量移動情況97優(yōu)質(zhì)課件975.1常規(guī)觀察細胞經(jīng)原代培養(yǎng)后及傳代或換液后均需進行98常規(guī)觀察1.培養(yǎng)液2.細胞生長概況3.細胞形態(tài)變化4.微生物污染98優(yōu)質(zhì)課件98常規(guī)觀察1.培養(yǎng)液98優(yōu)質(zhì)課件99常規(guī)觀察——培養(yǎng)液

顏色和透明度的變化

正常培養(yǎng)液的顏色新鮮培養(yǎng)基，桃紅色，pH為7.2-7.4產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，淺黃色，偏酸

培養(yǎng)液很快變黃原因

細菌污染培養(yǎng)瓶洗刷不徹底接種細胞密度過大99優(yōu)質(zhì)課件99常規(guī)觀察——培養(yǎng)液顏色和透明度的變化99優(yōu)質(zhì)課件100常規(guī)觀察——細胞生長增殖潛伏期或適應(yīng)期：細胞系24h以內(nèi)；原代培養(yǎng)幾天-幾周。對數(shù)生長期：長滿80%及時傳代；培養(yǎng)液變黃。平臺期:細胞粗糙，細胞內(nèi)顆粒狀堆積物，細胞脫落。100優(yōu)質(zhì)課件100常規(guī)觀察——細胞生長增殖潛伏期或適應(yīng)期：細胞系24h以101常規(guī)觀察——細胞形態(tài)變化生長狀態(tài)良好的細胞透明度大折光性強輪廓不清有時可見到細胞分裂相101優(yōu)質(zhì)課件101常規(guī)觀察——細胞形態(tài)變化生長狀態(tài)良好的細胞101優(yōu)質(zhì)課102成纖維型細胞形態(tài)102優(yōu)質(zhì)課件102成纖維型細胞形態(tài)102優(yōu)質(zhì)課件103上皮型細胞形態(tài)103優(yōu)質(zhì)課件103上皮型細胞形態(tài)103優(yōu)質(zhì)課件104常規(guī)觀察——微生物污染微生物污染一般發(fā)生在傳代、換液和加藥后。在進行上述操作后24～48小時要密切注意是否有污染發(fā)生。104優(yōu)質(zhì)課件104常規(guī)觀察——微生物污染104優(yōu)質(zhì)課件105常規(guī)觀察——微生物污染細菌污染：培養(yǎng)液渾濁、可見細菌；霉菌、真菌污染：培養(yǎng)液渾濁、可見菌絲；支原體污染：培養(yǎng)液不渾濁，細胞生長變緩慢、胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，有中毒表現(xiàn)。105優(yōu)質(zhì)課件105常規(guī)觀察——微生物污染105優(yōu)質(zhì)課件2.3.8細胞凍存與細胞復(fù)蘇概述細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學(xué)特性變化，最大限度的保存細胞活力。106優(yōu)質(zhì)課件2.3.8細胞凍存與細胞復(fù)蘇概述106優(yōu)質(zhì)課件Spallanzani(1776)最早發(fā)表了“冷”處理對“細胞”生命活動影響的報道。1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存的事實。Polge等人(1949)發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存細胞的保護作用。Luyet(1951)與Lovelock(1953)等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)電解質(zhì)濃度增大是造成冷凍貯存細胞損傷的主要原因。Lovelock等人(1959)發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護劑，這就是現(xiàn)在人們熟知的二甲基亞砜(DMSO)。當前低溫液氮凍存貯存細胞已是細胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術(shù)，貯存時間幾乎是無限的。107優(yōu)質(zhì)課件Spallanzani(1776)最早發(fā)表了“冷”處理對“細胞凍存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在冷凍保護劑的溶液中，以一定的降溫速率降至零下某一溫度(<-70℃)，并在此溫度下對其長期保存的過程。復(fù)蘇(thawing)：以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程。108優(yōu)質(zhì)課件細胞凍存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸細胞凍存與復(fù)蘇原則：慢凍快融當細胞直接降到零度以下，可引起：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶，會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。凍存細胞時要緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。109優(yōu)質(zhì)課件細胞凍存與復(fù)蘇原則：慢凍快融當細胞直接降到零度以下，可引起：低溫保護劑的應(yīng)用采用甘油或二甲基亞砜（DMSO）做保護劑。常用DMSO，一種滲透性保護劑，易穿透細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點。延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分滲出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。常溫下DMSO對細胞的毒副作用較大，在4℃時，其毒副作用大為減弱，凍存時DMSO平衡應(yīng)在4℃下進行。110優(yōu)質(zhì)課件低溫保護劑的應(yīng)用采用甘油或二甲基亞砜（DMSO）做保護劑。常細胞凍存方法1.預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細胞。2.取對數(shù)生長期細胞（凍存前一天換液），經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液，用吸管吹打制成細胞懸液（5-10）×106個/ml)。3.加入1-1.5ml凍存細胞液于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。111優(yōu)質(zhì)課件細胞凍存方法1.預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%D程序降溫儀標準程序為：降溫速率-1~-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5~-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。細胞凍存盒：內(nèi)部充滿異丙醇，放入-70℃冰箱中，-1℃/min的降溫速率凍存細胞。112優(yōu)質(zhì)課件程序降溫儀標準程序為：降溫速率-1~-2℃/min；當溫度達細胞凍存一般程序1.先將凍存管放入4℃冰箱，約10min。2.接著置于-20℃冰箱，約30～60min。3.置于-80℃超低溫冰箱中放置12~16h。4.置于液氮罐中長期保存。113優(yōu)質(zhì)課件細胞凍存一般程序1.先將凍存管放入4℃冰箱，約10min。1細胞凍存簡易程序?qū)⒗鋬龉埽ü芸谝希┓湃爰啿即鼉?nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在30-40min內(nèi)降至液氮表面，停30min后，直接投入液氮中。114優(yōu)質(zhì)課件細胞凍存簡易程序?qū)⒗鋬龉埽ü芸谝希┓湃爰啿即鼉?nèi)，液氮罐115優(yōu)質(zhì)課件液氮罐115優(yōu)質(zhì)課件影響冷凍效果的因素1.冷凍速率細胞冷至-5~-15℃之間時，細胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)，細胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會向細胞外流動.

-冷凍速度慢，細胞內(nèi)水分外滲多，細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰，但脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，甚至使細胞失去活性；

-冷凍速度快，細胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，隨著溫度的下降會發(fā)生細胞內(nèi)結(jié)冰，造成細胞膜及細胞器的破壞。116優(yōu)質(zhì)課件影響冷凍效果的因素1.冷凍速率116優(yōu)質(zhì)課件2.冷凍保存溫度液氮溫度（-196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。-70---80℃條件冷凍保存細胞，短期內(nèi)對細胞活性無明顯影響，時間延長，細胞存活率下降。3.復(fù)溫速率

是在細胞復(fù)蘇時溫度升高的速度一般復(fù)溫速度越快越好

1-2min內(nèi)從-196℃升溫至37℃（水浴鍋）。117優(yōu)質(zhì)課件2.冷凍保存溫度117優(yōu)質(zhì)課件4.冷凍保護劑可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。滲透性：甘油、DMSO非滲透性：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。甘油和DMSO并不能防止細胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預(yù)冷。118優(yōu)質(zhì)課件4.冷凍保護劑甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透細注意事項控制凍存細胞的質(zhì)量不宜將凍存的細胞放置在-20℃過長時間，易引起低溫損傷凍存小管宜用塑料凍存管119優(yōu)質(zhì)課件注意事項控制凍存細胞的質(zhì)量119優(yōu)質(zhì)課件保存細胞的復(fù)蘇方法快速解凍凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1min內(nèi)（不要超過3min）全部融化解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，24h后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中120優(yōu)質(zhì)課件保存細胞的復(fù)蘇方法快速解凍120優(yōu)質(zhì)課件準備水浴取凍存管，入水浴快速晃動至完全融化去除DMSO加入培養(yǎng)基制成細胞懸液，移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)121優(yōu)質(zhì)課件準備水浴121優(yōu)質(zhì)課件凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融冷到零度以下，細胞可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。122優(yōu)質(zhì)課件凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融冷到零度以下，細胞可以產(chǎn)生以下變化注意事項盡快使細胞恢復(fù)到常溫盡快離心棄去冷凍保護液，防止對細胞的毒害123優(yōu)質(zhì)課件注意事項盡快使細胞恢復(fù)到常溫123優(yōu)質(zhì)課件2.3.9細胞的運輸由于培養(yǎng)細胞株(系)的商品化，細胞培養(yǎng)室之間的交流、交換和購買已成為生命科學(xué)研究中的一個重要組成部分，培養(yǎng)細胞的運輸成為研究工作的一個重要環(huán)節(jié)。如果不了解所要細胞的性狀、培養(yǎng)液特點及培養(yǎng)注意事項，運輸時不注意使用特殊容器或溫度等，就可能影響細胞的生長，或出現(xiàn)差錯，或?qū)е屡囵B(yǎng)失敗等。裝運細胞的主要方法如下：冷凍儲存運輸充液法124優(yōu)質(zhì)課件2.3.9細胞的運輸由于培養(yǎng)細胞株(系)的商品化，細胞培細胞的運輸---冷凍儲存運輸利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰的運輸方法。保存效果較好，但缺點是比較麻煩，不宜長時間運輸，多需空運，代價較大。

125優(yōu)質(zhì)課件細胞的運輸---冷凍儲存運輸利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰的運細胞的運輸---充液法一般選擇生長良好的細胞，以生長1/3～1/2瓶底壁為宜，去掉舊培養(yǎng)液，補充新的培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，并用膠帶密封，放在一運送盒內(nèi)，用棉花等做防震防壓處理。運輸時間需4-5d，一般放在貼身口袋即可，到達目的地后倒出多余的培養(yǎng)液，只需保留維持生長所需的培養(yǎng)液置37℃培養(yǎng)，次日傳代。如果在市內(nèi)運輸或僅需數(shù)小時運輸路程，也可將細胞附著面朝上，或把培養(yǎng)液全部倒掉放在胸部口袋運送?？扛街诩毎砻娴呐囵B(yǎng)液，可使細胞短時間不受損。

126優(yōu)質(zhì)課件細胞的運輸---充液法一般選擇生長良好的細胞，以生長1/3～2.3.10細胞培養(yǎng)物的固定、染色培養(yǎng)物的常用固定方法染色方法127優(yōu)質(zhì)課件2.3.10細胞培養(yǎng)物的固定、染色培養(yǎng)物的常用固定方法121.常用固定方法固定細胞的目的：把組織和細胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來，避免組織和細胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等，使細胞的化學(xué)物質(zhì)和酶能準確定位，使細胞的各部分易于著色、適于觀察、長期保存和分析。128優(yōu)質(zhì)課件1.常用固定方法固定細胞的目的：128優(yōu)質(zhì)課件固定細胞的原則：盡可能選用新鮮培養(yǎng)物，根據(jù)檢測工具、對象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。培養(yǎng)物的準備和固定前處理：各種細胞培養(yǎng)物。雙蓋片懸滴和懸液培養(yǎng)物：離心--PBS漂洗2-3次，固定制片；蓋片單層培養(yǎng)物：蓋片從培養(yǎng)器中取出--PBS漂洗2-3次，固定129優(yōu)質(zhì)課件固定細胞的原則：129優(yōu)質(zhì)課件常用固定液簡單固定液：甲醇、乙醇、醋酸、甲醛、戊二醛、丙酮、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、鋨酸混合固定液：Mueller固定液、Flernming固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液130優(yōu)質(zhì)課件常用固定液簡單固定液：130優(yōu)質(zhì)課件常用固定液固定液用途固定液用途4%甲醛-PBS(1:9)大標本、染色體、線粒體、高爾基體戊二醛蛋白質(zhì)、微管和膜性結(jié)構(gòu)丙酮純冷丙酮固定細胞內(nèi)酶甲醇/醋酸(3:1)培養(yǎng)細胞、染色體，現(xiàn)用現(xiàn)配乙醇(70-100%)血纖維蛋白、色素、彈性纖維、細菌和白細胞FAA固定液蓋片單層培養(yǎng)的細胞醋酸(0.3-5%)減少其它固定劑引起的細胞收縮Carnoy固定液單層細胞1%苦味酸白蛋白、核蛋白、球蛋白、組蛋白和核酸Bouing固定液雙蓋片培養(yǎng)細胞的糖原鋨酸(1-2%)結(jié)膜、細胞結(jié)構(gòu)4%多聚甲醛-PBS腎纖維蛋白、細胞骨架蛋白131優(yōu)質(zhì)課件常用固定液固定液用途固定液用途4%甲醛-PBS(1:9)大FAA固定液：

90ml80%的酒精中加入冰乙酸和40%甲醛各5mlCarnoy固定液：60ml純乙醇中加入氯仿30ml及冰乙酸10mlBouing固定液：

75ml飽和苦味酸（100ml水中加入1.2-1.4g）過濾，加入25ml福爾馬林（40%甲醛，有沉淀時禁用），再加入5ml冰醋酸（最好用前加）4%多聚甲醛-PBS：

50ml蒸餾水中加入4g多聚甲醛，加熱至60-70oC，邊攪拌邊逐滴加入2M的NaOH至液體清澈透明；用1M的HCl調(diào)pH至7.4，冷卻后加入10mM的PBS至100ml鋨酸：在棕色試劑瓶中加入50-100ml的0.1MPBS（pH7.0-7.4），再將裝有1g鋨酸的安培瓶放入，擊碎安培瓶，搖晃使鋨酸溶解132優(yōu)質(zhì)課件FAA固定液：90ml80%的酒精中加入冰乙酸和40%甲2.染色方法染色是利用化學(xué)染料與細胞及各種細胞器發(fā)生化學(xué)作用和/或吸附作用，使各種細胞結(jié)構(gòu)能夠通過染色而改變其折射率，從而清晰的顯現(xiàn)出來。影響因素：所用的固定液染液的pH值：組織的酸性成分用pH偏高的染液，堿性成分用偏酸染液133優(yōu)質(zhì)課件2.染色方法染色是利用化學(xué)染料與細胞及各種細胞器發(fā)生化學(xué)作用1）Giemsa染色簡便、快速，適用于多種細胞和染色體染色染色液現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時間最好不超過48h；Giemsa液對pH敏感。母液制備：Giemsa粉0.5g，甘油22ml，在研缽內(nèi)將少量甘油和Giemsa粉混合研磨至無顆粒，加入剩余甘油，56oC保溫2h，加入33ml甲醇，棕色瓶保存。134優(yōu)質(zhì)課件1）Giemsa染色簡便、快速，適用于多種細胞和染色體染色1染色步驟（蓋片培養(yǎng)或涂片法）：1）Sorensenbuf和Giemsa染液9:1體積比混合即得到染色液2）用甲醇固定細胞標本10min，或醋酸/甲醇(1:3)固定30min3）用滴管將染色液布滿材料面（不要有氣泡）4）染色10-15min，用自來水將玻片沖洗干凈，空氣干燥，二甲苯透明5）光學(xué)樹脂膠封片后觀察結(jié)果：細胞核染成紫紅色或藍紫色胞漿染成粉紅色135優(yōu)質(zhì)課件染色步驟（蓋片培養(yǎng)或涂片法）：135優(yōu)質(zhì)課件2）蘇木精-伊紅染色染液制備：1）蘇木精染液(20×):蘇木精0.5g，銨礬(NH4)2SO4Al2(SO4)324g，H2O50ml，NaIO30.5g，甘油30ml，冰醋酸2ml。2）1%伊紅染液：1g伊紅溶于100ml蒸餾水。136優(yōu)質(zhì)課件2）蘇木精-伊紅染色染液制備：136優(yōu)質(zhì)課件染色步驟（蓋片培養(yǎng)法）：1）37oC溫PBS中漂洗3次，每次20-60sec，中性福爾馬林固定30min2）蒸餾水漂洗1次，用蒸餾水稀釋的1×蘇木精染液染色10min，自來水洗后置入1%NaHCO3中漂洗至藍紫色3）伊紅水溶液中染0.5-1min，蒸餾水洗后迅速通過丙酮2次，每次3-5min4）通過2:1和1:2丙酮/二甲苯各3次，每次1-2min；純二甲苯5-10min5）用光學(xué)樹膠封片（注意勿將蓋片的細胞面放反）后觀察結(jié)果：細胞核染成紅色，胞質(zhì)染成藍紫色137優(yōu)質(zhì)課件染色步驟（蓋片培養(yǎng)法）：137優(yōu)質(zhì)課件3）吖啶橙染色吖啶橙(acridineroange,AO)：常用熒光染料，可用于活細胞、固定細胞染色，可與細胞中DNA和RNA結(jié)合而發(fā)出不同顏色的熒光，DNA亮綠色，RNA橘紅色至火紅色。快速、簡便、并有一定特異性。染液配制：用生理鹽水將AO配成1%的母液，冰箱保存，用時則0.1M的PBS（pH4.8）稀釋成0.01%工作液。138優(yōu)質(zhì)課件3）吖啶橙染色吖啶橙(acridineroange,AO染色步驟（蓋片培養(yǎng)）：1）Hank’s液洗蓋玻片上的貼壁細胞3次2）用95%乙醇固定細胞標本15-30min，濾紙吸干3）1%醋酸作用30sec，PBS清洗1min4）用0.01%的AO染液染色1-5min，PBS清洗1min5）0.1MCaCl2分色0.5-2min，PBS清洗3次，每次數(shù)秒6）1:1的甘油:PBS封片，立刻觀察(用激發(fā)波405的濾光片)139優(yōu)質(zhì)課件染色步驟（蓋片培養(yǎng)）：139優(yōu)質(zhì)課件4）免疫熒光染色原理：用熒光素標記已知抗體或抗原，檢查細胞或組織標本中相應(yīng)的抗原或抗體。在熒光顯微鏡下，抗原抗體特異性結(jié)合部位的熒光素受激發(fā)光照射而發(fā)出明亮的熒光。熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）：發(fā)射熒光波長為490-619nm（黃綠色熒光）

四乙基羅丹明（RB200）：發(fā)射熒光波長為540-660nm（橙紅色熒光）140優(yōu)質(zhì)課件4）免疫熒光染色原理：140優(yōu)質(zhì)課件染色步驟（間接熒光染色法）：1）用95%乙醇固定單層細胞標本10-30min，或冷丙酮固定5-10min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩2）滴加未標記的一抗液，37oC濕盒中30min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩3）滴加熒光標記二抗，37oC濕盒中30min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩4）去除玻片周圍及材料上的水分5）熒光顯微鏡下觀察141優(yōu)質(zhì)課件染色步驟（間接熒光染色法）：141優(yōu)質(zhì)課件5）細胞活體染色—臺盼藍用Hank’s液配制0.1%臺盼藍溶液用等比的0.5%胰酶和0.2%EDTA混合液消化貼壁細胞加入適量Hank’s液制成細胞懸液，每ml懸液中加入0.1%的臺盼藍溶液10ul并混勻細胞計數(shù)板計數(shù)1000個細胞中的活細胞（折光性強且不著色）和死細胞（染為藍色）數(shù)目142優(yōu)質(zhì)課件5）細胞活體染色—臺盼藍用Hank’s液配制0.1%臺盼藍溶6）細胞骨架染色微絲：PBS洗蓋片培養(yǎng)的細胞3次，每次0.5min2%的甲醛/PBS液固定3min0.5%的三硝基甲苯/PBS處理3次，每次10min，PBS漂洗3次用羅丹明（rhodamine）標記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin）（1:10）室溫中反應(yīng)15min，PBS漂洗3次60%甘油+熒光防淬劑封片后熒光顯微鏡觀察143優(yōu)質(zhì)課件6）細胞骨架染色微絲：143優(yōu)質(zhì)課件144優(yōu)質(zhì)課件144優(yōu)質(zhì)課件微管：PBS洗蓋片培養(yǎng)的細胞3次，每次0.5min3%的甲醛/PBS液室溫固定20min0.5%的三硝基甲苯/PBS處理3次，每次10min，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS投入冷丙酮中（-10~20oC）7min，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS145優(yōu)質(zhì)課件微管：145優(yōu)質(zhì)課件微管：向一干凈平皿中央滴一滴濃度為0.1-0.2mg/ml的一級抗微管蛋白抗體，令小蓋片細胞面向下扣在抗體液上，將平皿置37oC溫箱中45-60min（加水盒）。向平皿中緩緩加入PBS，浮起蓋片并用鑷子夾出，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS。向另一干凈平皿中央滴一滴熒光標記的二抗（0.1-0.2mg/ml），然后同操作⑤和⑥。滴甘油/PBS（1:9，pH8.5）少許于載物片上，把小蓋片的細胞面覆以大蓋片上，并熒光顯微鏡觀察。146優(yōu)質(zhì)課件微管：146優(yōu)質(zhì)課件三維細胞培養(yǎng)147優(yōu)質(zhì)課件三維細胞培養(yǎng)147優(yōu)質(zhì)課件細胞培養(yǎng)發(fā)展史自WillhelmRoux于1885年從雞胚中分離細胞首次建立體外細胞培養(yǎng),單層細胞培養(yǎng)技術(shù)已有百余年的歷史。一個多世紀以來,單層細胞培養(yǎng)有了蓬勃的發(fā)展,特別是在制藥或者疫苗生產(chǎn)等產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域,通過細胞的快速增殖,從而高效率地制造產(chǎn)品。但在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,我們對于細胞的體外培養(yǎng),關(guān)注的不僅僅是細胞的增殖速度,而更為重要的是它們經(jīng)過體外傳代培養(yǎng)后能否維持其在體內(nèi)增殖所具有的相同性狀。在很多情況下,單層細胞培養(yǎng)技術(shù)所取得的研究結(jié)果和細胞在體內(nèi)生長的情況不符合,因為細胞在體外環(huán)境下增殖,逐漸喪失了原有的性狀。動物實驗完全在體內(nèi)進行,但由于體內(nèi)多種因素的制約及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響使動物實驗變得復(fù)雜化,難以研究單一過程。另外,我們在動物身上所觀察到的結(jié)果,往往是最終呈現(xiàn)的表現(xiàn),而非研究者最為關(guān)心的中間過程。顯然,如何填補單層細胞培養(yǎng)和動物實驗的鴻溝,一直是生命科學(xué)家思索的問題。隨著組織工程的新興發(fā)展,三維細胞培養(yǎng)技術(shù)就應(yīng)運而生了。148優(yōu)質(zhì)課件細胞培養(yǎng)發(fā)展史自WillhelmRoux于1885年①什么是三維細胞培養(yǎng)②如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)③水凝膠三維細胞培養(yǎng)④更多問題2341149優(yōu)質(zhì)課件①什么是三維細胞培養(yǎng)②如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)③水凝膠三維什么是三維細胞培養(yǎng)建立體外三維培養(yǎng)模型將有助于跨越二維細胞培養(yǎng)與動物實驗之間的鴻溝。通過模仿體內(nèi)環(huán)境的特性，并利用傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)研究工具，三維細胞模型提供了獨特的視角來觀察干細胞的行為、組織器官和腫瘤的發(fā)展過程。這些研究模型有利于加速癌癥生物學(xué)和組織工程領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化研究。——KennethM.Yamada,andEdnaCukierman.ModelingTissueMorphogenesisandCancerin3D.[J]cell.130,601-610.1150優(yōu)質(zhì)課件什么是三維細胞培養(yǎng)建立體外三維培養(yǎng)模型將有助于跨三維細胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimensionalcellculture,TDCC)是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng),使細胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長,構(gòu)成三維的細胞載體復(fù)合物。151優(yōu)質(zhì)課件三維細胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimensionalc1什么是三維細胞培養(yǎng)3D2DVS152優(yōu)質(zhì)課件1什么是三維細胞培養(yǎng)3D2DVS152優(yōu)質(zhì)課件三維細胞培養(yǎng)亮點

①三維培養(yǎng)體系為細胞提供類似體內(nèi)生長環(huán)境的支架或基質(zhì)，細胞通過緊密連接和/或縫隙連接等連接方式建立細胞間及細胞與胞外基質(zhì)間的聯(lián)系，形成一定的三維結(jié)構(gòu)；

②三維培養(yǎng)細胞在基因表達、基質(zhì)分泌及細胞功能活動等方面與單層培養(yǎng)均有明顯差異，而與體內(nèi)細胞生長情況更為相似；因此，三維細胞培養(yǎng)既能保留體內(nèi)細胞微環(huán)境的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能體現(xiàn)細胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控制性，把體外無細胞及單層細胞培養(yǎng)體系與組織器官及整體研究聯(lián)系起來。153優(yōu)質(zhì)課件三維細胞培養(yǎng)亮點①三維培養(yǎng)體系為細胞提供類似體內(nèi)生長環(huán)2如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)水凝膠固體支架磁力懸浮154優(yōu)質(zhì)課件2如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)水凝膠固體支架磁力懸浮154優(yōu)質(zhì)課件2如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)固體支架三維培養(yǎng)：

組織工程支架作為組織工程的平臺，不僅提供了細胞生長的框架，使之形成特定的組織或器官形狀；而且作為細胞外基質(zhì)成分之一，是細胞間信號傳導(dǎo)和相互作用的媒介，同時也是細胞生長所必需的生物活性劑。目前用于組織工程支架的人工合成可降解聚合物主要包括脂肪族聚酯、聚偶磷氮、聚酸酐等。其中研究最多的是脂肪族聚酯，特別是聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）及其共聚物等。155優(yōu)質(zhì)課件2如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)固體支架三維培養(yǎng)：155優(yōu)質(zhì)課件2如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)磁力懸浮三維培養(yǎng)：

美國萊斯大學(xué)和德克薩斯大學(xué)M.D.Anderson癌癥中心的研究人員開發(fā)出一種生物裝配器（bioassembler）。這個系統(tǒng)使用磁力讓細胞懸浮，并促使細胞生長成三維的形狀。尤其適于培養(yǎng)肝臟和心臟這種細胞密度比較大的實體器官。156優(yōu)質(zhì)課件2如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)磁力懸浮三維培養(yǎng)：156優(yōu)質(zhì)課件2如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)將細胞培植在一定的細胞外基質(zhì)中,細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix,ECM）蛋白充當生長支架。水凝膠三維培養(yǎng)：157優(yōu)質(zhì)課件2如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)將細胞培植在一定的細3水凝膠三維細胞培養(yǎng)MatrigelCollagenIAgarose158優(yōu)質(zhì)課件3水凝膠三維細胞培養(yǎng)MatrigelCollagenIAg3水凝膠三維細胞培養(yǎng)從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠腫瘤中分離出BDMatrigel

基底膜基質(zhì)，其主要成分由層粘連蛋白，Ⅳ型膠原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等組成，還包含生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等。Matrigel在室溫條件下，聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，有利于體外細胞的培養(yǎng)和分化，以及對細胞形態(tài)、生化功能、遷移、侵染和基因表達的研究。可促進上皮細胞、肝細胞、Sertoli細胞、黑色素瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞、甲狀腺細胞及毛囊細胞等的貼壁與分化。同時，Matrigel還