分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識

經(jīng)典word整理文檔，僅參考，雙擊此處可刪除頁眉頁腳。本資料屬于網(wǎng)絡(luò)整理，如有侵權(quán)，請聯(lián)系刪除，謝謝！分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識分子生物學(xué)是在生物化學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)展起來的，以研究核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等生命本質(zhì)的學(xué)科，在核酸、蛋白質(zhì)分子水平研究發(fā)病、診斷、醫(yī)治和預(yù)后的機(jī)制。其中基因工程（基因技術(shù)，基因重組）是目前分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)，這些技術(shù)能夠改造或擴(kuò)增基因和基因產(chǎn)物，使微量的研究對象達(dá)到分析水平，是研究基因調(diào)控和表達(dá)的方式，也是分子水平研究疾病發(fā)生機(jī)制、基因診斷和基因醫(yī)治的方式。轉(zhuǎn)化（tran子結(jié)構(gòu)完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化，得以增量，便于分析。外來基因引發(fā)細(xì)胞生物性狀改變的進(jìn)程叫轉(zhuǎn)化（transformation），以噬菌體把外源基因?qū)爰?xì)菌的進(jìn)程叫轉(zhuǎn)染（transfection）。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一種宿主的進(jìn)程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)移到基因組另一處的進(jìn)程叫轉(zhuǎn)位（transposition），這些游動的基因叫轉(zhuǎn)位子。一、基因工程的經(jīng)常使用工具（一）載體載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增、表達(dá)的工具。載體有質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性結(jié)尾質(zhì)粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復(fù)制；有可選擇的，便于挑選、鑒定的遺傳標(biāo)記；有供外源DNA插入的位點(diǎn)；本軀體積小等特點(diǎn)。質(zhì)粒存在于多種細(xì)菌，是染色體（核）之外的獨(dú)立遺傳因子，由雙鏈環(huán)狀DNA組成，幾乎完全袒露，很少有蛋白質(zhì)結(jié)合。質(zhì)粒有嚴(yán)緊型和松弛型之分。嚴(yán)緊型由DNA多聚酶Ⅲ復(fù)制，一個細(xì)胞可復(fù)制1-5個質(zhì)粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復(fù)制，一個細(xì)胞可復(fù)制30-50個質(zhì)粒，若是用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料，復(fù)制更多的質(zhì)粒。質(zhì)粒通過改造品種繁多，經(jīng)常使用的有pBR32二、pUC系列等。這些質(zhì)粒都含有多個大體基因，如復(fù)制起動區(qū)（復(fù)制原點(diǎn)Ori），便于復(fù)制擴(kuò)增；抗抗生素標(biāo)記（抗氨芐青霉素Ap、抗四環(huán)素Tc等）或大腸埃希菌部份乳糖操縱子（LacZ）等，便于基因重組體的挑選；基因發(fā)動rr子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉(zhuǎn)錄終止序列，便于插入的外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)。質(zhì)粒上還有許多限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，即基因插入位點(diǎn)，又叫基因重組位點(diǎn)，基因克隆位點(diǎn)。經(jīng)常使用噬菌體載體有單鏈?zhǔn)删wM13以上載體各有特點(diǎn)，便于選擇，靈活應(yīng)用。（二）工具酶工具酶是基因重組技術(shù)不可缺少的工具。要緊有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等。限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶之分，Ⅱ型能嚴(yán)格識別核酸序列，并在識別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶。識別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉(zhuǎn)對稱。切口分開端和粘端，產(chǎn)生3′－OH和5′－P結(jié)尾。內(nèi)切酶品種多，利歷時應(yīng)注意溫度、緩沖液用量（一樣1μgDNA/2-5單位酶）等反映條件。識別序列…AGCT……TCGA……GAATTC……CTTAAG……AGCT……TCGA……GAATTC……CTTAAG…四核苷酸平端切口六核苷酸粘端切口連接酶有T4噬菌體DNA噬菌體RNADNA連接酶可連接2+平端，也連接粘端。反映需有Mg和ATP存在，。最適溫度37℃，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa的穩(wěn)固性和粘性結(jié)尾的退火溫度，一樣平端連接用20-25℃，粘端連接用12℃左右。聚合酶有DNA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發(fā)覺外，發(fā)覺大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和TaqDNA聚合酶都有逆轉(zhuǎn)錄活性）。大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產(chǎn)生的一個大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，無3′→5′外切酶活性?？捎糜谌笨诜g（Nicktranslation）法標(biāo)記核酸，也可用于DNA序列測定，修補(bǔ)DNA鏈等。核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應(yīng)的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)。結(jié)尾轉(zhuǎn)移酶在Mg存在下，選擇3′－OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸，在Co存在下，選擇3′－OH端雙鏈DNA接器）。堿性磷酸酶去除5′－P，可避免二分子DNA片段5′端P基團(tuán)自身空間障礙，阻礙DNA分子之間的連接，一樣用堿性磷酸酶處置載體DNA除去5′端P基團(tuán)，在連接酶作用下目的基因的5′端P先與載體3′端OH連接，再通過復(fù)制修復(fù)另一條鏈，使二條鏈完全連接。該方式大大提高了連接效率（圖18-1）。圖18-1經(jīng)堿性磷酸酶處置后載體DNA與目的基因DNA的連接二、目的基因常把需研究的基因稱為目的基因，需分析的基因稱靶基因，在基因克隆進(jìn)程中有時二者均稱為插入基23對染色體上，較難從直接法取得。簡短的目的基因可在了解一級結(jié)構(gòu)或通過了解多肽鏈一級結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的核苷酸序列基礎(chǔ)上人工合成。但多數(shù)的目的基因由mRNA合成cDNA（complementaryDNA，反轉(zhuǎn)錄DNA）取得。CDNA通過各類方式與載體連接，克隆可取得全長cDNA或片段，用于探針制備、序列分析、基因表達(dá)等研究。因此以cDNA為研究材料反映了mRNA的轉(zhuǎn)錄及對以后翻譯的阻礙情形，即反映某一基因（DNA）外顯子的情形。（圖18-2）圖18-2目的基因cDNA的合成三、基因庫的成立成立基因庫的目的是為了便于目的基因的保留、擴(kuò)增和純化。基因庫是利用工具酶，通過基因重組技術(shù)和轉(zhuǎn)化、挑選而成立，也是基因克隆的進(jìn)程。事實(shí)上是利用低等生物如細(xì)菌、病毒、噬菌體等生長快，繁衍力強(qiáng)的特點(diǎn)，而作為一種核酸擴(kuò)增挑選的載體，把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重組于其中，經(jīng)挑選，克隆取得目的基因與載體重組的重組基因，成為便于保留，取用方便的基因庫。基因庫交流是研究室之間交流目的基因的經(jīng)常使用方式。（一）基因重組基因重組方案很多，簡單的可用同一種限制性內(nèi)切酶別離在載體和目的基因切出相對應(yīng)的切口，便于連接。也可用結(jié)尾連接酶合成連接器（圖18-3）。最近幾年，Okayama方案為實(shí)驗(yàn)室普遍采納，該方式可取得全長的cDNA。（二）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的是把有復(fù)制能力，但在細(xì)胞外無復(fù)制活性的目的基因-載體重組體裝入細(xì)胞（大腸埃希菌），使目的基因隨載體在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)步驟介紹如下：圖18-3基因重組方案之一⒈大腸埃希菌的處置（增加細(xì)胞膜通透性，便于基因進(jìn)入細(xì)胞）大腸埃希菌（cells）接種于Lbagar培育基，37℃培育一晚。挑選3~5個大菌落，接種于50mlLB培育基，37℃，振搖培育一晚后，在A測定，要求細(xì)菌繁衍必然量（一樣為細(xì)菌對數(shù)生長期），野生型（rec＋，5x10cells/ml）為，缺點(diǎn)型（r7ec-，5x10cells/ml）為。離心棄去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl懸浮菌體。冰浴20分鐘，低溫離72心。棄上清液，用冰50mmol/lCaCl懸浮。4℃可保留48小時，用于轉(zhuǎn)化，稱competentcells。2⒉質(zhì)粒（如經(jīng)基因重組成立的重組質(zhì)粒，基因庫等）的轉(zhuǎn)化將competentBRL公司DH10B菌株為例）置冰水浴。同時將Falcon2059（傳熱系數(shù)穩(wěn)固）塑料試管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059試管中，加10倍稀釋的巰基乙醇1μl，冰浴輕搖2分鐘，放置10分鐘。取質(zhì)粒加入試管，輕輕搖勻，冰浴30分鐘。其間備好42℃水浴。并將SOC培育基置42℃?zhèn)溆?。將試管置?2℃，輕搖45秒鐘，馬上置冰浴2分鐘。使competentcells熱脹冷縮，把質(zhì)粒導(dǎo)入菌體。加42℃SOC7℃培育1離心10分鐘，棄上清液，用200μlSOC培育基懸浮菌體。接種于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培育皿，37℃培育一晚。已轉(zhuǎn)化的菌體可形成菌落（因質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其產(chǎn)物的基礎(chǔ)上對菌落進(jìn)行鑒定。并在LB培育液中擴(kuò)大培育。基因庫的成立、轉(zhuǎn)化、挑選、擴(kuò)增、純化的進(jìn)程確實(shí)是基因克隆的進(jìn)程。LB培育基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl，高壓滅菌，。SOB培育基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，NaCl，高壓滅菌。另外預(yù)備2mol/L鎂溶液（1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻，過濾滅菌），臨用前加1ml于100ml培育基。SOC培育基（100ml）：臨用前加入1ml過濾滅菌的2mol/L葡萄糖。四、核酸的分離與純化核酸存在于多種細(xì)胞，如病毒、細(xì)菌、寄生蟲、動植物細(xì)胞；多種標(biāo)本中，如血液、組織、唾液、尿液等其它來源的標(biāo)本。因此分離方式復(fù)雜而多樣。又因各類的豐度不同，各類分析方式對核酸的純度與量的要求有不同，因此在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)付采納的方式有所了解和選擇。總的說來核酸的分離與純化是在溶解細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用苯酚等有機(jī)溶劑抽提（核酸溶于緩沖液，即水相），分離，純化；乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑沉淀，收成。溶解細(xì)胞的方式因標(biāo)本不同而不同，有效SDS加NaOH，有效蛋白酶，有的用超聲波破碎等方式，苯酚提取要緊使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機(jī)相，而核酸保留在水相，達(dá)到分離核酸的目的。實(shí)驗(yàn)上生物標(biāo)本中含量最多的確實(shí)是蛋白質(zhì)。為了除去分離進(jìn)程中殘留的有機(jī)溶劑，經(jīng)常使用的方式是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，通過離心回收核酸，然后用70％-80％乙醇洗滌沉淀，除去多余的鹽，以避免阻礙核酸RNA酶除去RNA，取得純的DNA，用DNA酶除去DNA而取得RNA。目前開發(fā)了許多商品化的核酸分離柱，可簡單、快速地分離取得純度很高的DNA或RNA。其分離原理有的利用核酸的分子量不同，有的利用需分離核酸的特點(diǎn)與其特異性結(jié)合達(dá)到分離、回收的目的。（一）質(zhì)粒的分離與純化含質(zhì)粒的E.Colicells經(jīng)LB培育液250ml擴(kuò)大培育，倒入50ml15分鐘。棄去上清液。（棄去液拋棄前應(yīng)作消毒處置，以避免污染環(huán)境）。加lysisbuffer(50mmol/LGlucose，10mmol/lEDTA，25mmol/lTris-HCl，1-2ml使之懸浮。放置室溫5分鐘，加新配制SDS/NaOHmol/lNaOH8ml，20％SDs2ml，蒸餾水30ml）上下?lián)u勻，置冰水浴5分鐘。禁用混勻器，以避免DNA分子斷裂），加L醋酸鉀緩沖液（），上下?lián)u勻，冰浴5分鐘。4℃，3000rpm，離心15分鐘。沉淀蛋白質(zhì)。取上清液，加無水乙醇15離心，棄上清液。加約為沉淀物體積的倍TE（10mmol/lTris-Hcl，10mmol/lEDTA）溶解沉淀后，加倍的L醋酸銨?？捎没靹蚱骰靹颍帽?0分鐘。4℃，10000rpm離心5min，棄上清液。加沉淀物倍的10mmol/lTris-HCllEDTA緩沖液，1/10體積的5mg/mlRNase，37℃，30分鐘保溫。加等量的phenol（酚）/CIAA(480ml氯5分鐘。取上層液加酚/CIAA重復(fù)一次。取上層液加1/10體積5mol/lNaCl和2倍無水乙醇，―20℃留宿或―70℃2小時以上。4℃，10000rpm，離心10分鐘，棄上清液。加80％乙醇不搖動，直接10000rpm離心，棄上清液，真空干燥。加適量（約200μl）TE溶解。測定含量后備用。（二）重組質(zhì)粒中目的基因的分離與純化先取少量純化的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶切出目的基因，經(jīng)電泳分離，確認(rèn)。以200μl含2mgDNA（重組質(zhì)粒）為例：取10μl含100μgDNA，加90μlTE。按1μgDNA加2-5U限制性內(nèi)切酶，1/10體體積3mol/l倍無水分鐘離心，棄上清液（乙醇沉淀）。適量TE溶解沉淀（切斷的DNA質(zhì)粒與目的基因混合物），電泳分離（用相應(yīng)分子量DNA標(biāo)準(zhǔn)同時電泳），在紫外光下觀看結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量比較，確認(rèn)目的基因和內(nèi)切酶的切割成效。⒈電泳條件：EB(溴化乙錠μl)DNA電泳緩沖液：X50TAE(ml)20EB(μl)301000X50TAE：Trismabase54g；乙酸；EDTA20ml；蒸餾水至1000ml。EB：10mg/mlethidiumbromide。(EB有致癌性，操作應(yīng)警惕)。經(jīng)電泳確認(rèn)后，取適量DNA（重組質(zhì)粒）同上條件切開，用％低熔點(diǎn)（＜65℃熔解）瓊脂糖凝膠，電泳分離。在紫外光下，切出含目的基因區(qū)帶（凝膠），放入離心管中，提取純化。⒉從低熔點(diǎn)凝膠提取，純化DNA片段加與凝膠體積相等的TE（10mmol/lTris-HClEDTA），置65℃水浴5封在上層，取基層酚），輕分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液，加體積3mol/L醋酸鈉（）和倍體積無水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一樣凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方式回收DNA片段。（三）標(biāo)本DNA的分離與純化用5-10ml1xNTE(NaCl100mmol/L,Tris-HCl10mmol/l1mmol/L調(diào)整細(xì)胞為2×10個（組織7應(yīng)切碎置液氮冰凍，高速攪切成粉末后，加入緩沖液）。加1/10-1/20體積（V）10mg/ml蛋白酶（Sigma10％SDS，37℃2上封)混勻（至少710分鐘。取上清液，加2mlTE(Tris-HCl10mmol/L1mmol/L溶解沉淀。加1/30xNTE，蛋白酶K(10mg/ml)代替蛋白酶重復(fù)2-4步驟。測定含量。（四）樣品RNA的分離，純化含10個細(xì)胞液加等量純化溶液[4mol/L62-巰基乙醇]。整體積為細(xì)胞沉淀4-5倍，混勻。加體積2ml/L體積酚（重蒸水上封），體積CIAA，混勻器猛烈混合10秒鐘。冰水浴15分鐘。離心（不用剎車）。警惕掏出上清液。加等量丙酮（或2分鐘離心。棄上清液。用離心管約加純化溶液，重復(fù)10分鐘，棄上清液。