發(fā)酵萃取耦合法制備丙酮丁醇的研究

發(fā)酵萃取耦合法制備丙酮丁醇的研究

由于缺乏可支配能源，利用酶或微生物生產(chǎn)可支配能源的工業(yè)生物技術(shù)已成為尋找環(huán)境友好能源的有效途徑。近年來,科學家研究發(fā)現(xiàn)基于微生物細胞生產(chǎn)的丁醇是一種極具潛力的新型生物燃料。丙酮丁醇發(fā)酵法(即ABE發(fā)酵,簡稱丙丁發(fā)酵)是生產(chǎn)丁醇的傳統(tǒng)方法,產(chǎn)物主要是丁醇、丙酮和乙醇(質(zhì)量比6∶3∶1),但影響此法溶劑產(chǎn)量的限制因素是發(fā)酵產(chǎn)物對微生物細胞的毒性,其中丁醇是毒性最大且是唯一的發(fā)酵濃度處于抑制性濃度范圍內(nèi)的溶劑。以己糖為碳源的培養(yǎng)物中,4～4.8g/L為丙酮丁醇羧菌生長受到抑制的臨界濃度;在工業(yè)發(fā)酵過程中,當丁醇濃度達到13g/L,溶劑生產(chǎn)基本停止,而此濃度也是傳統(tǒng)丙丁發(fā)酵所能達到的最大丁醇產(chǎn)量,因而造成低丁醇產(chǎn)量和低底物轉(zhuǎn)化率,導致丁醇生產(chǎn)成本的提高。丁醇低產(chǎn)量的解決可從下游工藝著手,即不斷移出發(fā)酵液中丁醇使產(chǎn)物抑制作用降低以提高丁醇產(chǎn)量。近年來,國內(nèi)外許多研究者圍繞此原理開展了利用氣提、液液萃取、滲透萃取、滲透蒸發(fā)工藝解決傳統(tǒng)丙酮丁醇發(fā)酵問題的研究工作。其中,發(fā)酵萃取耦合工藝的原理是將與水不互溶的有機萃取劑與發(fā)酵液混合,因丁醇在有機相中比在水相中溶解度大而濃縮在有機相中,待與發(fā)酵液分離后萃取相可經(jīng)精餾或反萃取使溶劑得到再生而循環(huán)使用,而丁醇產(chǎn)量和產(chǎn)率也因發(fā)酵液中產(chǎn)物抑制作用的消除而得到提高。萃取劑的選擇要滿足以下要求:較好的生物相容性(盡量不毒害生產(chǎn)菌種);與水相不互溶;對發(fā)酵產(chǎn)物選擇性分離,且分離系數(shù)較大;有機相用量盡量少;有機溶劑成本低廉。在常用的萃取劑中,Evans等篩選出油醇(丁醇分離系數(shù)3.2)為生物相容性較好的萃取劑,且向生物相容性好但分離系數(shù)低的油醇中加入生物相容性差分離系數(shù)高的癸醇(丁醇分離系數(shù)6.2)后,此種萃取劑使以CBM為培養(yǎng)基的丙丁發(fā)酵產(chǎn)物丁醇產(chǎn)量得到提高。但在工業(yè)化生產(chǎn)過程中,以固體培養(yǎng)基為丙丁發(fā)酵培養(yǎng)基時,將會面臨有機相和培養(yǎng)基的乳化的問題,而有機萃取相的配比、用量等工藝參數(shù)同樣是工業(yè)化生產(chǎn)所需要解決的問題。本文通過冷模試驗、生長影響試驗和小規(guī)模發(fā)酵試驗,確定了有機相條件和發(fā)酵萃取耦合工藝,為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)參數(shù)的探索奠定了基礎(chǔ)。1材料和機器1.1病毒丙酮丁醇梭菌(ClostridiumacetobutylicumSMB1),中國微生物菌種保藏中心。1.2氮氣成為厭氧環(huán)境RCM培養(yǎng)基:酵母粉3.0g/L,水解酪蛋白10.0g/L,牛肉膏10.0g/L,葡萄糖5.0g/L,淀粉10.0g/L,氯化鈉5.0g/L,醋酸鈉3.0g/L,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L,經(jīng)抽真空充氮氣后成為厭氧環(huán)境,121℃,15min滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基(9%的玉米培養(yǎng)基):玉米粉9g,定容至100mL,121℃,30min高溫滅菌。1.3油-0%醇,乙氧醇,總?cè)芤骸?0.混合溶液Ⅰ:15.00g/L總?cè)苜|(zhì)的混合溶液,含丁醇9.00g/L,丙酮4.50g/L,乙醇1.50g/L。混合溶液Ⅱ:35.00g/L總?cè)苜|(zhì)的混合溶液,含丁醇21.00g/L,丙酮10.50g/L,乙醇3.50g/L。有機相Ⅰ:油-0%癸醇:體積分數(shù)100%油醇,體積分數(shù)0%癸醇。有機相Ⅱ:油-20%癸醇:體積分數(shù)80%油醇,體積分數(shù)20%癸醇。有機相Ⅲ:油-40%癸醇:體積分數(shù)60%油醇,體積分數(shù)40%癸醇。丁醇、乙醇、丙酮(色譜純),美國Sigma-Aldrich公司。油醇、癸醇(化學純),北京恒業(yè)中遠化工有限公司。1.4hpx-97h型液相色譜儀;Agilent1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);AminexHPX-87H型液相色譜柱(美國Bio-Rad公司);GC-2010氣相色譜儀(日本島津公司);DB-WAXGC毛細管色譜柱(30m×0.25mm,美國Agilent公司);紫外-可見分光光度計2802PC(美國Unico公司)。2方法2.1在冷模型試驗中，確定了有機相比的比較方法2.1.1萃取溶劑的選擇按1∶5的相比(有機相和水相的體積比)分別將有機相Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ緩緩加入到混合溶液Ⅰ、Ⅱ上方,形成6種穩(wěn)定兩相,保持兩相平穩(wěn)置于37℃水浴搖床中進行萃取,搖床轉(zhuǎn)速為80r/min。分別于0.5,1,1.5,36h的萃取時間,從下層水相取樣并用HPLC測丁醇含量,計算不同萃取時間各有機相對水相中丁醇的萃取率。2.1.2搖床轉(zhuǎn)速測試將按2.1.1方法形成的6種穩(wěn)定兩相置于37℃水浴搖床進行萃取,搖床轉(zhuǎn)速為80r/min。于萃取時間1.5h從水相取樣,測丁醇、丙酮和乙醇含量,并計算1.5h各有機相對水相中各物質(zhì)的萃取率,對比各有機相對水相萃取1.5h后,丁醇、丙酮和乙醇的萃取率差別。2.1.3搖床萃取水據(jù)2.1.1方法,按照1∶1,1∶3,1∶5,1∶7(有機相∶水相)的相比將有機相加入到水相上方,并置于37℃水浴搖床進行萃取,搖床轉(zhuǎn)速為80r/min。于萃取時間1.5h從水相取樣,測丁醇、丙酮和乙醇含量,并計算1.5h各有機相對水相中丁醇、丙酮和乙醇的萃取率,對比萃取1.5h后,各有機相對水相中丁醇萃取率的差別。2.1.4計算有機丁醇、丙酮和乙醇提取率的方法有機相對水相中各物質(zhì)的萃取率=(水相中該物質(zhì)的起始含量-水相中測得的該物質(zhì)終含量)/水相中該物質(zhì)的起始含量×100%。2.2油-20%蘇-20%5將油-20%水相擴大成網(wǎng)后,油-40%b穩(wěn)定性成高效5-10h的油-20%/l0h,以4%的接種量分別向水相RCM培養(yǎng)基中接入活化的菌種ClostridiumacetobutylicumSMB1,再將油-20%癸醇和油-40%癸醇分別按照1∶5相比加到水相上,形成穩(wěn)定的兩相,并置于37℃,100r/min搖床開始培養(yǎng)至48h。從0h起始,分別于0～48h每4h取1mL菌液,用蒸餾水稀釋3倍,用分光光度計測量600nm下菌液的OD值,制作48h內(nèi)不同癸醇比例影響下的菌體生長曲線,設(shè)置對照組為不加入任何有機相的水相中菌體生長曲線。2.3丙酮丁醇、乙醇、丙酮的產(chǎn)量測定0h接活化的生產(chǎn)菌種ClostridiumacetobutylicumSMB1于9%的玉米培養(yǎng)基中,分別于0,12和24h按1∶5相比將油-20%癸醇緩緩加在玉米培養(yǎng)基之上,37℃發(fā)酵72h后,取水相發(fā)酵液和有機相樣品,分別用HPLC法和氣相色譜法測量丁醇、乙醇、丙酮的產(chǎn)量。對照組設(shè)置為不加入任何有機相的丙酮丁醇發(fā)酵,試驗組和對照組均重復2次求平均值。最后綜合兩相產(chǎn)量,分別計算生產(chǎn)菌的丁醇、丙酮和乙醇總產(chǎn)量,計算公式:各產(chǎn)物總質(zhì)量濃度(g/L)=(有機相的該產(chǎn)物質(zhì)量濃度×有機相的體積+水相的該產(chǎn)物質(zhì)量濃度×水相的體積)/水相體積。2.4濾膜的制備水相樣品經(jīng)12000r/min離心10min,0.2μm濾膜過濾備用。流動相為0.05mmol/L的硫酸,流速為0.5mL/min,調(diào)節(jié)柱溫為15℃,進樣20μL后檢測45min。2.5氮氣條件下程序升溫有機相樣品經(jīng)12000r/min離心10min,0.2μm濾膜過濾后備用。載氣為氮氣,流速14mL/min,進樣量10μL。采用程序升溫:70℃,保持5min;升溫速率10℃/min,終溫130℃,保持3min;升溫速率20℃/min,終溫230℃,保持20min。進樣口溫度為250℃,檢測器溫度為250℃。3結(jié)果和分析3.1冷模型試驗決定了有機相萃取劑的提取效果3.1.1萃取率的提高如圖1和2所示,對15g/L混合溶液Ⅰ和35g/L混合溶液Ⅱ進行的丁醇的萃取結(jié)果均為,1.5h內(nèi)隨著時間的延長,有機相對水相中丁醇的萃取率相應提高;1.5～36h丁醇萃取率與1.5h幾乎相同,不再增大。這表明1.5h就可達到有機相最大萃取率,而此時混合溶液Ⅰ和Ⅱ中殘留的丁醇濃度分別為4.5g/L和10.5g/L,低于使溶劑完全停止生產(chǎn)的丁醇濃度。因而,油醇和癸醇組合使用的有機相可在較短時間內(nèi)使發(fā)酵液中的產(chǎn)物丁醇降低到不影響生產(chǎn)菌正常生產(chǎn)的濃度。3.1.2其它有機溶劑萃取如圖3和圖4所示,1.5h,各有機相對混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ進行的萃取結(jié)果為,對丁醇的萃取率均為50%以上,對丙酮和乙醇的萃取率分別在20%以下和10%以下。有機相對水相中丁醇和丙酮、乙醇萃取率的差別懸殊,反映了這種油-癸醇體系作為有機相對丁醇的特異性選擇萃取效果。這種針對于丁醇的選擇特異性萃取,就使水相中丁醇產(chǎn)物抑制作用得以及時消除,將會方便實際發(fā)酵中丁醇產(chǎn)量增大;雖然丙酮和乙醇也有部分被有機相移出水相之外,但產(chǎn)物消除造成的產(chǎn)量增大遠不如丁醇的效果,因此,使實際發(fā)酵過程中丁醇、丙酮、乙醇以越來越大于6∶3∶1的比例產(chǎn)出,而這正符合了工業(yè)生產(chǎn)中盡量提高丁醇/丙酮產(chǎn)量比的要求。所以,油-癸醇體系的有機相對丙丁發(fā)酵液中丁醇的萃取快速、特異,滿足發(fā)酵萃取工藝對有機相的要求。3.1.3有機相對混合溶液的萃取率如圖5所示,隨著相比增大,各有機相對混合溶液Ⅰ和Ⅱ中的丁醇萃取率增大趨勢顯著,且相比為1∶1,1∶3和1∶5時,各有機相對混合溶液Ⅰ和Ⅱ中的丁醇萃取率均在50%以上,保證了起始濃度在9～21g/L范圍的丁醇,被有機相萃取后留在水相中的濃度小于使溶劑生產(chǎn)完全停止的濃度;但當相比為1∶7時,除油-40%癸醇的有機相對混合溶液Ⅱ的萃取率略高于50%外,3種有機相對混合溶液Ⅰ和Ⅱ的丁醇萃取率均小于50%,難以符合工業(yè)化發(fā)酵萃取生產(chǎn)丁醇的萃取要求。因而,從丁醇萃取效果、有機相溶劑成本及盡量減少有毒溶劑用量的角度考慮,選擇相比為1∶5。3.2有機相通過毒性對菌體生長的影響由圖5可知,相比為1∶5時,癸醇比例為40%時對水相的丁醇萃取率要比20%時相應值大。但由圖6可以看出,分別按1∶5相比加入有機相油-20%癸醇和油-40%癸醇后,雖然菌種仍能在48h內(nèi)呈現(xiàn)出和對照菌種相似的生長趨勢,但仍低于對照組菌體密度值,可見有機相通過毒性對菌體生長略有抑制;而在0～48h生長過程中,油-20%癸醇為有機相的菌體密度總是略大于油-40%癸醇為有機相的菌體密度,這反映出癸醇比例越大將會對菌體毒性越大。因而選擇生物相容性更好的油-20%癸醇為有機相。3.3有機相對丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量比的影響0h加入有機相后,有機相在1h內(nèi)逐漸和玉米培養(yǎng)基完全混合,難以形成穩(wěn)定兩相,因而生產(chǎn)菌將受到有機相的毒害,溶劑生產(chǎn)能力降低,丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量下降。分別于12h和24h加入有機相,經(jīng)72h發(fā)酵后,試驗組和對照組的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別如圖7所示,24h加入有機相的試驗組,其丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量比對照分別提高了23.99%和13.33%,12h加入有機相的試驗組,其丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量比對照分別減小了62.72%和64.91%。24h加入有機相得到的丁醇總產(chǎn)量比對照提高了近1/4,這表明有機相確實發(fā)揮了從水相中萃出丁醇提高丁醇產(chǎn)量的作用,而相對于對照組的總?cè)軇┊a(chǎn)量的提高值(13.33%)少于丁醇產(chǎn)量的提高值(23.99%),這也印證了有機相對丁醇的選擇性萃取作用增大了丁醇/丙酮的產(chǎn)量比。12h加入有機相的試驗組得到丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量比對照下降了很多。通過觀察,發(fā)現(xiàn)12h加入有機相后未能形成穩(wěn)定的兩相,而是有機相和培養(yǎng)基混合在一起。因此,推測是由于乳化作用,使有機相有機會和培養(yǎng)基中的生產(chǎn)菌種接觸且毒害細胞,造成細胞生長受到抑制,正常生理功能被阻礙,溶劑產(chǎn)量降低。4優(yōu)化發(fā)酵條件本試驗通過冷模試驗、菌體生長曲線和發(fā)酵萃取試驗,確定