左旋三葉粟堿誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞自噬機(jī)制研究

左旋三葉粟堿誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞自噬機(jī)制研究

beclin1是一種跡象。對(duì)腫瘤來(lái)說(shuō),自噬是一把“雙刃劍”,適度的自噬可促進(jìn)細(xì)胞生存,而過(guò)度的自噬(即自噬性細(xì)胞死亡)將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。Beclin1與腫瘤之間的關(guān)系正如自噬與腫瘤之間的關(guān)系,Beclin1對(duì)腫瘤也發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用。一方面,Beclin1作為一種抑癌蛋白,可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡;另一方面,在實(shí)體瘤中,當(dāng)新生血管還未形成時(shí),腫瘤細(xì)胞往往缺乏營(yíng)養(yǎng),Beclin1的適度表達(dá)可誘導(dǎo)有限的自噬水平,為腫瘤細(xì)胞提供必要的物質(zhì)和能量而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和生存。肺癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)、致死人數(shù)最多的惡性腫瘤之一,也是我國(guó)第一大癌癥,其發(fā)病率及死亡率增長(zhǎng)最為迅速。我國(guó)的肺癌居惡性腫瘤死亡的第一位,約占22.7%,其中非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)約占肺癌的80%。目前肺癌的主要治療手段是化療,但化療的毒副作用如骨髓抑制等卻限制了其應(yīng)用。因此,研發(fā)新型活性高、毒副作用小的抗肺癌藥物一直是腫瘤治療領(lǐng)域的重要任務(wù)。一葉萩堿(securinine)又被稱(chēng)為一葉堿、葉萩堿,是大戟科植物葉底珠Securinegasuffruticosa(Pall)Rehd嫩枝葉或根的主要生物堿。該生物堿最早由原蘇聯(lián)學(xué)者從俄羅斯烏蘇里地區(qū)植物中分離獲得,但其化學(xué)結(jié)構(gòu)卻是由我國(guó)學(xué)者從本土資源提取分離并最終確定了。一葉萩堿在一葉萩植物中的生物合成具有十分獨(dú)特的旋光現(xiàn)象,分為左旋一葉萩堿(圖1)和右旋一葉萩堿2種旋光異構(gòu)體。有報(bào)道稱(chēng)左旋體的藥理活性較強(qiáng),約為右旋體的10倍。早期,TypoB等的初步研究認(rèn)為其是一種主要作用于脊髓的中樞興奮藥,對(duì)再障、面部神經(jīng)麻痹及伴有抑郁的神經(jīng)衰弱等有一定療效。最新的研究結(jié)果表明,一葉萩堿還具有抗腫瘤的生物活性,對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞具有明顯的抑制作用,其中左旋一葉萩堿可通過(guò)上調(diào)自噬基因Beclin1從而誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞自噬性凋亡。但關(guān)于一葉萩堿抗肺癌的研究則鮮有報(bào)道。本研究根據(jù)已有研究結(jié)論,結(jié)合當(dāng)前抗腫瘤研究的新熱點(diǎn),觀察左旋一葉萩堿是否誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞自噬及其可能的分子機(jī)制。1材料和方法1.1材料、試劑與儀器左旋一葉萩堿由暨南大學(xué)提供,結(jié)構(gòu)式如圖1所示,DMSO溶解配制成100mmol/L的儲(chǔ)存液,4℃保存?zhèn)溆?人非小細(xì)胞肺癌系A(chǔ)549由皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存;青霉素、鏈霉素0.25%Tripsin-EDTA、PBS、CCK-8、單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);RPMI1640(美國(guó)GIBCO);DMSO(美國(guó)SIGMA);TRIzol(美國(guó)Invitrogen);cDNA第一鏈合成試劑盒(Fermentas);TaqDNAPolymerase(DNA聚合酶)(Fermentas)超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇州凈化);CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO);生物倒置顯微鏡(日本OLYMPUS);熒光顯微鏡(LeicaDMIRB公司);臺(tái)式低速離心機(jī)(中國(guó)上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng));酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek);高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sorvall,);紫外光度儀(日本SHIMADZU);熒光定量PCR循環(huán)儀(中國(guó)中山達(dá)安)。1.2納入實(shí)驗(yàn)養(yǎng)牛目1%5%co,5.4%見(jiàn)表1將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的A549細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),將培養(yǎng)瓶放入37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液為含10%~15%滅活小牛血清的RPMI1640,含1%的雙抗(青霉素及鏈霉素)。每2~3d傳代一次,并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.3培養(yǎng)基的制備用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液,以每孔(0.8~1)×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放入CO2孵箱,在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后,使用平板離心機(jī)棄去上層培養(yǎng)液,每孔加入用1640完全培養(yǎng)基配制成濃度為10、40μmol/L的左旋一葉萩堿200μL,每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔(陰性對(duì)照組加等量的1640完全培養(yǎng)基)。放入CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)36h后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。1.4cck-8活性細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液;將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;棄去培養(yǎng)基,PBS清洗2次,用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度,每孔加入200μL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組;將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、36、48h;將96孔板進(jìn)行CCK-8染色,λ=450nm,測(cè)定OD值;每孔加入10μLCCK-8,在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3h;搖床10min輕輕混勻;λ=450nm,酶標(biāo)儀讀出每孔的OD值,計(jì)算抑制率;IR(%)=[(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值]×100%。1.5熒光顯微鏡試驗(yàn)選擇生長(zhǎng)良好的A549細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)24h后參照本實(shí)驗(yàn)室以前的CCK-8試驗(yàn)結(jié)果,分別用含左旋一葉萩堿濃度為0、20μmol/L的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h,取出后PBS洗2遍,每孔加入MDC(終濃度50μmol/L)于37℃、5%CO2,的恒溫培養(yǎng)箱中溫育30min,再置于熒光顯微鏡下1h內(nèi)觀察和攝片。1.6pcr檢測(cè)dna純度和總量1在mRNA的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組加入左旋一葉萩堿濃度分別為10、20、40μmol/L;紫外線(xiàn)分光光度計(jì)測(cè)OD280和OD260值,對(duì)提取的RNA純度及總量進(jìn)行計(jì)算。取10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物,1.5%瓊脂糖凝膠電泳,完成電泳后經(jīng)凝膠掃描儀掃描,并以GADPH校正進(jìn)行相對(duì)量分析,兩者積分光密度的比值表示其數(shù)值,3次重復(fù)試驗(yàn)后取平均值。PCR引物序列由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司驗(yàn)證并合成,選擇GAPDH為內(nèi)參照。各基因引物序列如表1所示。1.7兩組間數(shù)據(jù)分析比較應(yīng)用SPSS18.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,組間分析比較采用t檢驗(yàn),以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1藥物劑量對(duì)抑制率的影響左旋一葉萩堿作用A549細(xì)胞24h后,細(xì)胞生長(zhǎng)均不同程度地受到抑制,呈時(shí)間-濃度依賴(lài)性,隨著藥物劑量的增加,抑制率呈上升趨勢(shì),與陰性對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由圖2可以看出,隨濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng)其抑制作用增強(qiáng),48h抑制率較24、36h明顯增高(P<0.05)。48h時(shí)左旋一葉萩堿的IC50=21.204μmol/L。2.2異常核分裂特性陰性對(duì)照組:未用藥的A549細(xì)胞生長(zhǎng)良好,形狀不規(guī)則,呈梭形或多角形,細(xì)胞核大,核異型,核質(zhì)比高,可見(jiàn)異常核分裂;濃度為10、40μmol/L左旋一葉萩堿加藥組:左旋一葉萩堿作用A549細(xì)胞48h后與對(duì)照組相比細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,且高濃度組細(xì)胞形態(tài)變化更加顯著,用藥后細(xì)胞貼壁能力明顯下降,細(xì)胞成懸浮生長(zhǎng)狀態(tài),細(xì)胞變小變圓,且細(xì)胞內(nèi)顆粒明顯增多,如圖3所示。2.3光強(qiáng)度和點(diǎn)結(jié)構(gòu)如圖4所示,陰性對(duì)照組MDC染色熒光強(qiáng)度很弱且點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)很少;左旋一葉萩堿20μmol/L處理組MDC染色熒光強(qiáng)度及點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)均較陰性對(duì)照組明顯增加。2.4不同濃度苯甲腈對(duì)beclin1表達(dá)的影響用RealtimePCR在mRNA水平檢測(cè)Beclin1的表達(dá)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中Beclin1表達(dá)基本缺失,但用不同濃度左旋一葉萩堿處理48h后出現(xiàn)Beclin1表達(dá)的上調(diào),且隨濃度的增加表達(dá)增強(qiáng)(圖5)。Beclin1表達(dá)水平的變化和細(xì)胞自噬活動(dòng)的變化呈水平相關(guān),說(shuō)明左旋一葉萩堿誘導(dǎo)A549細(xì)胞Beclinl基因的激活并引起自噬。3誘導(dǎo)細(xì)胞自噬近年來(lái)研究表明,Beclin1是抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵基因,表現(xiàn)在它可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞中高度保守的一種生理現(xiàn)象,并依賴(lài)于溶酶體。過(guò)度的自噬作用最終將導(dǎo)致細(xì)胞死亡,即自噬性細(xì)胞死亡(autophagicceldeath),稱(chēng)為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡(凋亡被稱(chēng)為I型程序性細(xì)胞死亡)。這種形式的細(xì)胞死亡表現(xiàn)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)大量包裹著細(xì)胞漿和細(xì)胞器的空泡結(jié)構(gòu)和溶酶體對(duì)空泡內(nèi)成分的降解。細(xì)胞中Beclin1高表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,甚至誘導(dǎo)高水平的自噬性細(xì)胞死亡。在治療腫瘤的化療藥物中,它莫昔芬、神經(jīng)酰氨都是通過(guò)上調(diào)Beclin1并抑制AKT激酶的活化從而上調(diào)自噬水平,誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡發(fā)生。Beclin1基因缺失或點(diǎn)突變將使細(xì)胞死亡能力明顯降低而導(dǎo)致腫瘤,Beclin1在多種人類(lèi)腫瘤中表現(xiàn)為單個(gè)等位基因的缺失和低水平表達(dá),已有報(bào)道卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、人非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸鱗癌細(xì)胞均存在Beclin1單個(gè)等位基因缺失或有不同程度的Beclin1表達(dá)下調(diào)。左旋一葉萩堿作為一種植物提取的活性成分,具有資源豐富的優(yōu)點(diǎn)。最近大量研究表明,左旋一葉萩堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有抑制作用,但有關(guān)左旋一葉萩堿抗肺癌作用的研究鮮有報(bào)道。本研究首先使用不同濃度的左旋一葉萩堿作用A549細(xì)胞不同時(shí)間,CCK-8