免疫組化病理診斷質量控制的探索

免疫組化病理診斷質量控制的探索

1免疫組化染色質量控制免疫組織化學染色在病理診斷中的作用得到了高度的認可。然而,免疫組化是一種多步驟、多因素決定的實驗方法,由于各實驗室采用的組織處理、染色方法、抗體來源和抗體克隆號的不同,染色結果有時會出現較大差異,不合格的染色切片時有發(fā)生。至今相當部分的實驗室對免疫組化標準化尚欠足夠重視,不合格的染色結果會影響病理醫(yī)師做出正確的診斷,因此,免疫組化染色結果的可靠性受到了極大的關注。在英國、北歐和美國相繼開展了免疫組化質量控制工作,建立了一套比較完善的質量控制方法和程序。為了提高我國免疫組化病理診斷質量和水平,中國病理工作者委員會免疫組化研究中心借鑒國外的先進經驗并結合我國的實際情況開始探索一種適合我國免疫組化質量控制的辦法。質量控制分為內部質控和外部質控兩部分,內部質控由實驗室內部自己進行規(guī)范管理完成,外部質控是在實驗室之間進行。免疫組化研究中心探索的是外部質量控制,其主要作用是能夠了解實驗室之間的質量差異,及時發(fā)現問題,糾正錯誤,同時發(fā)現和推廣理想的、標準化的染色方法,推動我們國內免疫組化在病理診斷中的應用與發(fā)展?，F將本次活動作一介紹。1.1免疫組化中的問題和建議(1)了解我國免疫組化的現狀;(2)發(fā)現免疫組化中存在的問題;(3)總結和推廣規(guī)范化的免疫組化技術;(4)改善和提高我國免疫組化質量,最終達到提高病理診斷準確性的目的。1.2免疫組化質控對行政責任的影響(1)自愿參加原則:在中國大陸或港澳臺等地區(qū)的任何參加免疫組化活動的病理實驗室或其他實驗室都是自愿的,沒有任何行政約束。(2)客觀公正原則:免疫組化質控活動是一項專業(yè)性和科學性很強的活動,對結果的評價必須是客觀的公正的,不受任何經濟和行政利益的影響。為了保證這一原則,評委必須由在免疫組化方面造詣很深專家的組成。(3)開放原則:任何病理實驗室都可以參加這項活動,由于最初幾次活動為摸索階段,因此,范圍較小,以后逐步擴大,達到飽和為止。1.3中心負責免疫組化專家隊伍建設由中國病理工作者委員會免疫組化研究中心負責組織此項活動。中心由一位主任和兩位副主任負責。該中心邀請全國免疫組化專家組成評委,評委人數十幾名。委托北京友誼醫(yī)院病理科作為活動的技術支持,包括提供測試用的組織芯片和標準對照片。1.4檢測片的簽署免疫組化質控活動每年將舉辦兩次。具體方法如下:(1)通過互聯網發(fā)布本次免疫組化質控測試通知,其中包括測試方法、注意事項、起止日期、抗體的數量和名稱、聯系方式,并附免疫組化質控參加表。(2)欲參加者必須預先填寫免疫組化質控參加表(每一種抗體填一張表,每次測試3～5種抗體),作為注冊。參加表的內容包括參加單位使用抗體和各種試劑以及染色方法、步驟的詳細情況,目的是為了便于分析染色不合格切片產生的原因。(3)免疫組化研究中心根據注冊情況向參加者郵寄免疫組化測試切片,即組織芯片。測試組織片的構成原則:①中性福爾馬林固定的組織;②組織細胞保存完好,無壞死出血等;③多種組織;④已知陽性和陰性反應的組織;⑤不同陽性程度的組織;⑥含內源性生物素高的組織。(4)參加者收到測試片后按要求對相關抗體進行染色。染色結束后將測試片寄回免疫組化研究中心。(5)免疫組化研究中心邀請評委對參加者測試片進行集體評議。評議內容包括:陽性信號的定位,信號的強度和分布,交叉反應,背景著色,復染情況。評議結果分為4級:優(yōu)(4分)、良(3分)、中(2分)、差(1分)。具體標準是:①優(yōu):測試片中所有組織染色非常理想或接近理想。即陽性信號很強,定位準確,分布恰當,沒有交叉反應和背景著色。②良:測試片中所有組織染色都很好,或信號稍弱,但是有輕度背景染色。③中:測試片中所有組織染色普遍太弱,或其中有一個組織出現假陰性或假陽性。④差:測試片中所有組織染色非常弱,其中幾個組織出現假陰性或假陽性。所有評委的分數之和為切片的最后得分。如果得分是“差”和“中”,視為染色不合格,將由質控中心提出改進建議。(6)在網上(或E-mail)公布測試總體結果,不公布參加者單位名稱,同時將每個參加者的結果通知參加者本人。還包括評委對其技術問題的原因分析及相關的改進建議。(7)給質控合格的單位頒發(fā)合格證書。(8)對每次質控活動的結果進行總結。(9)互動,若對質控活動內容有何疑問,可發(fā)郵件至ccp@.1.4.1表1顯示了測試的阻力1.4.2免疫組化微組織(1)根據每次測試的抗體數量發(fā)給每個單位相應數量的組織芯片,每張芯片有多個微組織,這些微組織中均含有陰陽性對照及不同陽性程度的組織。(2)組織芯片為福爾馬林固定,石蠟包埋切片,染色前無需烤片,可從脫蠟、水化處理開始,按各實驗室自己平日的實際情況進行免疫組化染色。(3)按切片標識分別染色指定的抗體,請不要自行更改抗體。2質量控制活動總結2.1級甲等醫(yī)院參加/分級分布從2004年4月開始,至今共進行了4次質控活動,第1次是為了摸索經驗,只選擇了16家三級甲等醫(yī)院參加。第2次、第3次和第4次分別有53、59和63個不同級別醫(yī)院和試劑公司,一共有134個單位參加。參加單位來自全國30個省、自治區(qū)、直轄市和澳門特別行政區(qū),南方省份參加單位73個,北方61個,參加兩次以上的單位37個。2.2抗團抗染色的結果見表1。2.3問題和原因分析2.3.1出現非修復條件下的產物共有88張切片。原因:①修復的溫度或時間不夠或未修復,即抗原暴露不充分;②一抗?jié)舛冗^低或修復的溫度或時間不夠;③修復的溫度或時間不夠或顯色時間短;④檢測系統問題;⑤顯色時間短。2.3.2內源性生物素的染色共有35張切片。原因:未完全封閉內源性生物素。2.3.3背景太深共有29張切片。原因:①顯色時間太長;②一抗?jié)舛冗^高;③修復時間過長;④抗體過期。2.3.4染色非常深，信號擴散共有14張切片。原因:①一抗?jié)舛冗^高;②顯色時間過長。2.3.5顏色不均共有8張切片。原因:抗體覆蓋不均或沖洗不徹底。2.3.6紅細胞成像內源性氧化酶共有7張切片。原因:內源性過氧化物酶未被消耗。2.3.7異常的腎小管裝飾共有2張切片。原因不明。2.3.8不要再染色共有4張切片。2.3.9cd117染色合格率共有30張切片。同一種抗體譜系有差異。在4次質控活動中,CD117染色合格率最低,僅為42%。其原因是多方面的,主要原因是抗原修復不夠(5張切片),還有使用單克隆抗體(1張切片)和抗體過期(1張切片)。2.4推薦的抗癲癇修復方法見表2。3免疫組化染色成功率及存在問題免疫組化質控活動涵蓋我國30個省、自治區(qū)、直轄市和僅供參考,具體需根據各實驗室的情況選擇澳門特別行政區(qū)參加。包括全國大中小醫(yī)院以及生物試劑公司共134個單位,因此,評審結果能夠基本反映出我國目前免疫組化的技術水平,是一份有價值的參考資料。眾多單位自愿參加質控活動,充分表明廣大的病理工作者對免疫組化現狀的關注和要求改進免疫組化質量的愿望。此次免疫組化染色的總體質量較好,約3/4的切片達到優(yōu)良,但仍有約1/4切片染色不佳,需要改進。染色成功率與抗體有一定關系,成功率高的是CK、CD30、HMB-45、vimentin,合格染色達到90%以上;CD117染色成功率最差,合格染色僅達到42%。經過4次免疫組化質控檢測,染色質量有改進趨勢。如第一次質控ER合格率57%,