穿刺淋巴結組織he染色切片及免疫組化染色切片的質量控制與標準化操作

穿刺淋巴結組織he染色切片及免疫組化染色切片的質量控制與標準化操作

在淺表淋巴結穿刺活動和超聲和ct的指導下，淺表淋巴結穿刺活動期的傷口較小，安全風險較高。2007年山東大學附屬省立醫(yī)院病理科對穿刺淋巴結組織的HE切片的制片及免疫組化染色過程實行標準化操作和嚴格的質量控制,使HE和免疫組化切片質量穩(wěn)定,并且與未實行嚴格質量控制的2006年的資料進行了比對性研究。1材料和方法1.1穿刺淋巴結標本隨機選取來自山東大學附屬省立醫(yī)院2007-01-01-12-30穿刺淋巴結標本245例,其中頸部淋巴結75例,縱隔淋巴結46例,腹膜后淋巴結54例,腹股溝淋巴結45例,鎖骨下淋巴結25例。同時隨機選取2006-01-01-12-30同一部位和數(shù)量的標本作對照組。1.2leica公司儀器包括萊卡2135切片機(德國Leica公司)、萊卡TP1050全自動脫水機(德國Leica公司)、直徑18cm不銹鋼高壓鍋(蘇泊爾)和1500W電爐。試劑包括福州邁新生物技術開發(fā)公司即用型第2代免疫組化EliVisionTMplus試劑盒,抗體包括LCA、CD20、CD45RO、CD30、CD15、CD29、CD3和CD4等。1.3方法1.3.1免疫組化切片穿刺淋巴結組織離體后立即放入4%的中性甲醛中固定。取材時,如果1例標本有多條穿刺組織,應把每一條組織分別用濾紙包好,放入脫水盒中,每盒1條組織,以保證包埋時組織在一個平面上,以便切片是每條組織的最大面。4%中性甲醛固定2h,70%乙醇30min,80%乙醇30min,90%乙醇30min,100%乙醇Ⅰ30min,100%乙醇Ⅱ30min,二甲苯Ⅰ15min,二甲苯Ⅱ15min,蠟缸Ⅰ30min,蠟缸Ⅱ30min。蠟缸溫度60℃。切片厚2～3μm,每個蠟塊連切6～8張切片,1張染HE切片,其余貼片于涂APES(3-Aminopropyltriethoxysilane)的載玻片上,以備做免疫組化用。免疫組化的切片60℃烤箱烤片2h。優(yōu)良HE切片的判定標準:穿刺淋巴結組織結構完整,無裂隙,細胞無收縮,形態(tài)清晰,染色質分明,核質染色對比良好。1.3.2抗體標準溶液切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2甲醇液室溫作用15min后水洗;蒸餾水洗2次,將1000mLpH6.0的檸檬酸緩沖液倒入直徑20cm的高壓鍋中,用電爐加熱至沸騰,然后將切片放入高壓鍋內,蓋上鍋蓋,扣上高壓閥,加熱至噴氣開始計時,繼續(xù)加熱1.5～2min,高壓鍋離開電爐,自然冷卻至室溫。取出切片,用pH7.2～7.4的PBS沖洗2次,每次2min,然后加一抗,37℃溫箱孵育2h,用pH7.2～7.4的PBS沖洗2次,每次2min,依次加二抗至DAB顯色。每一種抗體均設陽性及陰性對照。優(yōu)良免疫組化染色切片的判定標準:組織結構完整,陽性物質定位準確;背景干凈、清晰,無非特異性著色,無脫片;敏感性高、特異性強。1.4統(tǒng)計方法采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗,以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2穿刺淋巴結組織245例穿刺淋巴結組織中,2007年優(yōu)良切片為182例(75.2%),2006年為149例(61.7%),兩者差異有統(tǒng)計學意義,P<0.05。245例穿刺淋巴結組織中,2007年完成免疫組化制片208例,優(yōu)良切片為157例(75.4%),脫片18例(9%);而2006年完成免疫組化制片為143例,優(yōu)良切片89例(62.3%),脫片45例(31.4%),兩者差異有統(tǒng)計學意義,P<0.05。245例穿刺淋巴結組織,2007年能做出明確診斷的有141例,其中轉移癌47例,結核病24例,反應性增生23例,非霍奇金淋巴瘤32例,霍奇金淋巴瘤15例。2006年能做出明確診斷的有113例,兩者差異有統(tǒng)計學意義,P<0.05。3免疫組化切片的制備由于缺乏實驗的標準化,導致各實驗室免疫組織化學的實驗結果差異較大。因此,標準化和質量控制勢在必行。穿刺淋巴結組織由于組織細小,細胞豐富,處理不當易使組織收縮、變脆。我們前期研究總結出穿刺淋巴結組織制片的最佳條件,即嚴格控制固定、脫水、透明、進蠟過程的時間及所用試劑的濃度。穿刺淋巴結的固定選用4%中性甲醛固定時間可縮短至2h。脫水應從低濃度乙醇開始,逐漸過渡到無水乙醇,無水乙醇脫水時間不能過長,否則組織變硬變脆,不易制片。二甲苯透明應在常溫下進行,加溫透明易使組織變脆。組織在第一級蠟中的時間不能超過30min,因為第一級蠟中含有較多的二甲苯。本研究采用了預留免疫組化切片的方法,即做HE切片時,一并切出6～8張免疫組化切片備用,避免進行二次切片時,因把組織修小而影響診斷。預留免疫組化切片后,免疫組化制片成功率明顯提高,245例穿刺淋巴結組織,2007完成制片208例,而未預留免疫組化切片的2006年只完成143例。未完成制片的原因:1)二次切片時重新修平切面而把組織切小;2)組織處理不當而造成制片困難;3)臨床取組織太小無法完成制片?？乖迯偷臉藴驶怯绊懨庖呓M化結果的重要因素之一。其常用的主要方法有胰蛋白酶消化法、微波加熱法及高壓鍋加熱法。我們以往實驗證實,高壓鍋加熱法最理想。高溫高壓加熱時間的長短很重要,從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在3min內,時間過長,可能會使染色背景加深。檸檬酸緩沖液不能重復使用,且容量必須保證所有切片都能浸泡到,整個染色過程不要讓切片干涸。實驗對照是確保免疫組化結果準確的重要方法,為證實抗體和檢測試劑盒效價可靠,染色操作是否正確,一般需要進行實驗對照,以避免試劑失效或操作失當而出現(xiàn)假陰性和假陽性,確保染色結果的可靠性。嚴格來說,每一批組織都應該設陽性對照。組織中的內對照是最好的陽性對照,這就要求診斷醫(yī)師做好配合,選有內對照的蠟塊做免疫組化。并同時選用已知染色陰性的組織切片染色作為陰性對照。本研究在穿刺淋巴結組織的免疫組化中,每一種抗體都設陽性及陰性對照,確保了結果的準確性。通過對穿刺淋巴結組織的HE制片及免疫組化染色過程實行規(guī)范化標準化操作及嚴格的質量控制,提高了HE切片及免疫組化染色的質量;通過預留免疫組化切片,確保有足夠的組織完成免疫