兩性霉素b及其脂質(zhì)體效價(jià)的測(cè)定

兩性霉素b及其脂質(zhì)體效價(jià)的測(cè)定

兩性霉素b是大多數(shù)深層細(xì)菌感染的重要藥物。傳統(tǒng)的注射用兩性霉素B制劑在治療過程常產(chǎn)生較嚴(yán)重的毒副作用,應(yīng)用受到限制。隨著制劑技術(shù)的發(fā)展,新型的兩性霉素B脂質(zhì)體(liposomalamphotericinB,L-AMB)的毒性反應(yīng)已顯著降低,且療效與傳統(tǒng)的制劑相當(dāng)或較好,極大地促進(jìn)了兩性霉素在臨床中的應(yīng)用。對(duì)兩性霉素B的測(cè)定,有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC法測(cè)定其純度,但目前各國(guó)藥典均采用管碟法測(cè)定其效價(jià)。管碟法操作繁瑣,耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),影響因素多,重現(xiàn)性差。采用濁度法測(cè)定可克服上述不足。濁度法測(cè)定兩性霉素B效價(jià)的報(bào)道不多,本文建立了利用濁度法測(cè)定兩性霉素B及其脂質(zhì)體效價(jià)的方法。1儀器和試劑1.1儀器、飲料和儀器845x-安捷倫紫外可見光譜儀(HP);CZB-1抗生素比濁法測(cè)量?jī)x、玻璃培養(yǎng)杯(厚度1cm),北京潮聲公司;AE-240電子天平(Mettler公司);WGP-600隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱。1.2材料和培養(yǎng)基啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)9763和白念珠菌(Candidaalbicans)CMCC(F)98001由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)0334-843502,效價(jià)855μg/mg)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。兩性霉素B原料樣品(批號(hào)2001-05-01、AI030701、AO031203、AC021205)和兩性霉素B脂質(zhì)體(批號(hào)010101B、050205、050204、050106,每瓶10mg)由上海先鋒藥業(yè)公司提供;批號(hào)042810KD(每瓶50mg)為Nexstar公司產(chǎn)品;批號(hào)042091AD(每瓶50mg)為GileadSciences有限公司產(chǎn)品。新制培養(yǎng)基(蛋白胨7.5g,酵母膏2.0g,牛肉浸膏1.0g,氯化鈉5.0g,葡萄糖10.0g,加水制成1000ml,pH6.5),真菌培養(yǎng)基,酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD),YPD液體培養(yǎng)基,滅菌生理鹽水和磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)均按中國(guó)藥典2005年版二部附錄配制。二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)和曲拉通(TritonX-100)為分析純?cè)噭?價(jià)格測(cè)定2.1主流管的方法按中國(guó)藥典2005年版二部方法測(cè)定。2.2濁度法2.2.1菌苔蘚的培養(yǎng)取啤酒酵母新鮮斜面培養(yǎng)物,接種于YPD斜面上,置35～37℃培養(yǎng)18～23h,用滅菌生理鹽水洗下菌苔,加生理鹽水稀釋,使其在650nm波長(zhǎng)處的吸光度約為1.0。取菌液2～3.3ml加至培養(yǎng)基100ml中,搖勻,為實(shí)驗(yàn)菌液。2.2.2溶液的制備(1)甲基甲酰胺溶液配制取兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)品適量,精密稱定,用DMSO適量溶解,二甲基甲酰胺稀釋成100μg/ml的溶液,作為儲(chǔ)備液備用;精密量取儲(chǔ)備液適量,用二甲基甲酰胺稀釋制成5μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。(2)甲基甲酰胺溶液取兩性霉素B原料適量,精密稱定,用DMSO適量溶解,二甲基甲酰胺稀釋成約100μg/ml的溶液;精密量取適量,用二甲基甲酰胺稀釋制成約5μg/ml的供試品溶液;用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。(3)甲基甲酰胺溶液精密稱取兩性霉素B脂質(zhì)體適量,加5%曲拉通(TritonX-100)的乙醇溶液(每相當(dāng)于1mg兩性霉素B的制劑中加1ml),振搖,再加二甲基亞砜適量溶解(必要時(shí)可超聲),混勻,用二甲基甲酰胺稀釋制成約100μg/ml的溶液;精密量取適量,用二甲基甲酰胺稀釋制成約5μg/ml的溶液;磷酸鹽緩沖液(pH6.0)稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。2.2.3比濁法測(cè)量,培養(yǎng)“高效水”的人才取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0ml,加入滅菌培養(yǎng)管中,再加入實(shí)驗(yàn)菌液9.0ml,置抗生素比濁法測(cè)量?jī)x內(nèi),于(37±1)℃培養(yǎng)。另取稀釋溶劑1.0ml,加9.0ml空白培養(yǎng)基,混勻,作為空白對(duì)照,儀器在線于530nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管啤酒酵母對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)不同培養(yǎng)時(shí)間下的吸光度值(A)。根據(jù)量反應(yīng)平行線原理計(jì)算供試品的效價(jià)值。3結(jié)果3.1測(cè)量條件的選擇3.1.1實(shí)驗(yàn)菌的確定兩性霉素B為抗真菌抗生素,因此選擇白念珠菌和啤酒酵母作為實(shí)驗(yàn)菌;在真菌培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基和新制培養(yǎng)基中培養(yǎng),加菌量分別為1%、2%、3%;抗生素濃度為0.0179～0.4478μg/ml。繪制菌株在不同加菌量、不同培養(yǎng)基及不同抗生素濃度的生長(zhǎng)曲線。根據(jù)菌生長(zhǎng)曲線及在不同抗生素濃度下菌液吸光度值的變化,發(fā)現(xiàn)白念珠菌和啤酒酵母在新制培養(yǎng)基中生長(zhǎng),對(duì)不同濃度的抗生素更敏感,即菌液的吸光度值差(⊿A)大;在其它培養(yǎng)基中菌液易沉降;因此選擇新制培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基。以白念珠菌為實(shí)驗(yàn)菌時(shí),抗生素的線性濃度范圍0.059～0.098μg/ml;以啤酒酵母為實(shí)驗(yàn)菌時(shí),抗生素的線性濃度范圍0.04～0.1μg/ml,啤酒酵母的線性濃度范圍寬,故選擇啤酒酵母作為實(shí)驗(yàn)菌。加菌量為1%時(shí),至適宜的菌液測(cè)定濃度時(shí)間長(zhǎng),測(cè)定時(shí)可利用的濃度范圍窄,2%～3.3%的加菌量較適宜測(cè)定。3.1.2dmso和dmf對(duì)菌生長(zhǎng)的影響對(duì)不同量的溶解溶劑DMSO及稀釋溶劑DMF進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,DMSO在8%以下、DMF在2%以下的磷酸鹽緩沖液(pH6.0)對(duì)菌生長(zhǎng)沒有影響;4%的DMF、10%的DMSO對(duì)菌生長(zhǎng)略有抑制;DMF加入量越大,對(duì)菌的抑制作用也越大,因此DMSO和DMF的最終加入量應(yīng)分別小于8%和2%。脂質(zhì)體測(cè)定時(shí),分別對(duì)以水、乙醚、乙醇、甲醇、2%或5%曲拉通(TritonX-100)的乙醇溶液等溶解溶劑進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體在2%和5%曲拉通乙醇溶液中澄清,且回收率滿足實(shí)驗(yàn)要求;此條件下曲拉通乙醇溶液對(duì)菌生長(zhǎng)無影響。3.1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析抗生素效價(jià)測(cè)定中,抗生素的不同濃度(C)與菌液的吸光度值(A)通常并不完全呈線性,此時(shí)需將其轉(zhuǎn)化為線性函數(shù)。利用不同的函數(shù)(A～C、A～lgC、lgA～C、lgA～lgC)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并利用SAS軟件對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸顯著性、剩余標(biāo)準(zhǔn)差等統(tǒng)計(jì)分析,不同直線間的平行性顯著性測(cè)驗(yàn)(t檢驗(yàn)),結(jié)果表明A～C、A～lgC、lgA～C三種函數(shù)的線性范圍寬,回歸顯著,剩余標(biāo)準(zhǔn)差小,直線的相關(guān)系數(shù)大,考慮到生物檢定一般習(xí)慣上用函數(shù)A～lgC,因此利用此函數(shù)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。3.1.4菌生長(zhǎng)曲線對(duì)不同加菌量(2%～3.3%)及菌的不同傳代次數(shù)進(jìn)行比較,以不同抗生素濃度下的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間t為橫坐標(biāo),繪制菌生長(zhǎng)曲線(A～t)(圖1)。由菌生長(zhǎng)曲線得出,不同抗生素濃度下的啤酒酵母,培養(yǎng)約4h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;比較不同抗生素濃度下的菌液A～t生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)傳代不同次數(shù)的菌液及不同的加菌量,菌的平穩(wěn)生長(zhǎng)時(shí)間均在6～8h,因此選擇測(cè)定時(shí)間為6～8h。比較培養(yǎng)6～8h不同時(shí)間點(diǎn)的A～lgC曲線(圖2),發(fā)現(xiàn)菌液的吸光度值A(chǔ)在0.4～1.3之間,便于測(cè)定,據(jù)此確定抗生素濃度的測(cè)定范圍。3.2噪聲法的建立和評(píng)價(jià)3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及效價(jià)值的測(cè)定精密量取5μg/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)分別稀釋成0.04、0.05、0.06、0.08和0.10μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液;用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)將供試品溶液稀釋成約0.08μg/ml的濃度;分別量取上述一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和供試品溶液1.0ml,加入滅菌培養(yǎng)管中,每個(gè)濃度3～6管,再分別加入實(shí)驗(yàn)菌液9.0ml,置抗生素比濁法測(cè)量?jī)x內(nèi),于(37±1)℃保溫培養(yǎng),6h后每4min記錄各管的A值;計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品的效價(jià);當(dāng)連續(xù)5點(diǎn)供試品的效價(jià)值誤差(RSD)小于2%時(shí),終止實(shí)驗(yàn),以5點(diǎn)的均值表示供試品的效價(jià)?？股貪舛仍?.04～0.10μg/ml時(shí),吸光度值A(chǔ)與抗生素濃度對(duì)數(shù)lg(100×C)成良好的線性關(guān)系(r=0.982～0.995),直線回歸顯著性(P<0.01)。分別精密量取100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品、脂質(zhì)體儲(chǔ)備液等體積置于同一容量瓶中,用二甲基甲酰胺稀釋制成5μg/ml的混合溶液,測(cè)定方法的回收率。平均回收率為103.5%(n=5),RSD為6.22%。對(duì)同一個(gè)樣品溶液測(cè)定,日內(nèi)RSD為1.64%;日間RSD為2.79%(n=8)。分別對(duì)4批兩性霉素原料和6批兩性霉素脂質(zhì)體進(jìn)行測(cè)定并與管碟法結(jié)果比較(表1),兩者無顯著性差異。3.2.2加標(biāo)回收率試驗(yàn)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇0.06和0.075μg/ml為二劑量法測(cè)定濃度;用磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液;每個(gè)濃度6管,于(37±1)℃保溫培養(yǎng),6h后每4min記錄各管的A值;按中國(guó)藥典2005年版二部生物檢定統(tǒng)計(jì)方法(附錄ⅩⅣ)中的2.2法計(jì)算供試品的效價(jià);當(dāng)連續(xù)5點(diǎn)供試品的效價(jià)值誤差(RSD)小于2%時(shí),終止實(shí)驗(yàn),以5點(diǎn)的均值表示供試品的效價(jià)。二劑量方法的平均回收率(制備樣品方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線法)為106.6%(n=2),RSD為1.97%。對(duì)同一個(gè)樣品溶液測(cè)定,日內(nèi)RSD為0.38%(n=2);日間RSD為0.87%(n=3)。分別對(duì)4批兩性霉素原料和6批兩性霉素脂質(zhì)體進(jìn)行測(cè)定并與管碟法結(jié)果比較(表1),兩者無顯著性差異。4測(cè)定菌液密度的控制兩性霉素B是含有多個(gè)小組分的共軛七烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,分子結(jié)構(gòu)中含有活性羧基、氨基及多個(gè)活性羥基,為兩性化合物,采用管碟法測(cè)定時(shí),受擴(kuò)散系數(shù)、啤酒酵母菌落顏色、培養(yǎng)基本底色、抑菌圈大小等諸多因素的影響。濁度法測(cè)定在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行,可避免上述因素的影響;用分光光度儀測(cè)量菌液的吸光度其精密度優(yōu)于管碟法中對(duì)抑菌圈的測(cè)定,且培養(yǎng)時(shí)間短,因此測(cè)定更為快速、準(zhǔn)確。采用一劑量法測(cè)定時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線低濃度范圍測(cè)定誤差較大(相對(duì)誤差3.79%～7.36%);高濃度范圍測(cè)定誤差較小(相對(duì)誤差1.18%～4.05%)