酶的提取與分離純化

第六章酶的提取和別離純化1、酶的提取與別離純化技術路線2、細胞破碎3、酶的提取4、酶的別離方法GoGoGoGo5、酶的組合別離純化策略Go6、酶的濃縮、枯燥與結晶Go.第一節(jié)酶的提取、別離純化技術路線細胞破碎酶提取酶別離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細胞發(fā)酵液離心別離，過濾別離，沉淀別離，層析別離，電泳別離，萃取別離，結晶別離等。.酶的純化過程，約可分為三個階段：(1)粗蛋白質(crudeprotein):采樣→均質打破細胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質以外的物質。(2)局部純化(partiallypurified):初步的純化，使用各鐘柱層析法。(3)均質酶(homogeneous):目標酶的進一步精制純化，可用制備式電泳或HPLC。酶別離純化不同階段本章目錄.第二節(jié)：細胞破碎許多酶存在于細胞內。為了提取這些胞內酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1〕機械破碎2〕物理破碎3〕化學破碎4〕酶解破碎JY92-IID超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機.機械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿外表活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而到達細胞破碎細胞破碎方法及其原理本章目錄.進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑〔直徑小于1mm〕一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內含物。在珠液別離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內，漿液流出從而實現連續(xù)操作。破碎中產生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法〔Beadmill〕原理：.實驗室規(guī)模的細胞破碎設備有Mickle高速組織搗碎機、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細胞破碎可采用膠質磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機〔瑞士WAB公司和德國西門子機械公司制造〕。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產物的失活、減少由于高破碎率產生的細胞小碎片不易別離而給后續(xù)操作帶來的困難。.采用高壓勻漿器〔由高壓泵和勻漿閥組成，英國APV公司和美國Microfluidics公司均有產品出售〕。2.高壓勻漿法〔High-pressurehomogenization〕——大規(guī)模細胞破碎的常用方法利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破碎，細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。原理：.在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及高濃度的細胞，常采用屢次循環(huán)的操作方法。易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌，含有包含體的基因工程菌〔因包含體堅硬，易損傷勻漿閥〕不宜采用高壓勻漿法。

.在15-25kHz的頻率下操作。其原理可能與空化現象〔cavitationphenomena〕引起的沖擊波和剪切作用有關?？昭ㄅ萦捎谑艿匠暡ǖ难杆贈_擊而閉合，從而產生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質中的懸浮細胞上造成了剪切應力，促使細胞液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。3.超聲破碎法〔Ultrasonication〕一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差，該法在實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。但超聲波產生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質失活。..4.酶溶法〔EnzymaticLysis〕〔1〕外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內切酶、殼多糖酶等溶菌酶主要用于細菌類細胞壁溶解酶是幾種酶的復合物.對酵母細胞采用酶法破碎時，先參加蛋白酶作用蛋白質-甘露聚糖結構，使二者溶解，再參加葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質體，這時假設緩沖液的滲透壓變化，那么細胞膜破裂，釋出胞內產物。利用溶酶系統(tǒng)處理細胞時必須根據細胞壁的結構和化學組成選擇適當的酶，并確定相應的次序。酶溶法的優(yōu)點：選擇性釋放產物，條件溫和，核酸泄出量少，細胞外形完整。缺點：溶酶價格高，溶酶法通用性差〔不同菌種需選擇不同的酶〕，產物抑制的存在。在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。.誘發(fā)微生物產生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以到達細胞自溶的目的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH值、激活劑和細胞代謝途徑等。缺點是：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降?！?〕自溶法〔Autolysis〕.某些化學試劑，如有機溶劑、變性劑、外表活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細胞壁或膜的通透性〔滲透性〕，從而使胞內物質有選擇地滲透出來。4.化學滲透法〔Chemicalpermeation〕該法取決于化學試劑的類型以及細胞壁膜的結構與組成。.如TritonX-100是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質具有很強的親和力，能結合并溶解磷脂，破壞內膜的磷脂雙分子層，使某些胞內物質釋放出來。其他的外表活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉等也可使細胞破碎?！?〕外表活性劑可促使細胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細胞的破碎。.處理G-細菌，對細胞外層膜有破壞作用。G-細菌的外層膜結構通常靠二價陽離子Ca2+或Mg2+結合脂多糖和蛋白質來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現洞穴。這些區(qū)域由內層膜的磷脂來填補，從而導致內層膜通透性的增強。〔2〕EDTA螯合劑.能分解細胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細胞破裂，胞內物質被釋放出來。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級醇等?！?〕有機溶劑〔4〕變性劑鹽酸胍〔Guanidinehydrochloride〕和脲〔Urea〕是常用的變性劑。變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。.通用性差；時間長，效率低，一般胞內物質釋放率不超過50%；有些化學試劑有毒。化學滲透法優(yōu)點：缺點：對產物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質仍滯留在胞內；細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液別離和進一步提取。.將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實驗室，適應范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低及活性保存率高等優(yōu)點，但不適應于對冷凍敏感的生化物質。5.其他方法1.X-press法.將細胞放在高滲透壓的介質中〔如一定濃度的甘油或蔗糖溶液〕，達平衡后，轉入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內，引起細胞溶脹，甚至破裂。僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預先用酶處理或在培養(yǎng)過程中參加某些抑制劑〔如抗生素等〕，使細胞壁有缺陷，強度減弱。2.滲透壓法〔Osmoticpressure〕.將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復屢次而到達破壁作用。由于冷凍，一方面使細胞膜的疏水鍵結構破裂，另一方面胞內水結晶，使細胞內外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復屢次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質變性。3.反復凍結-融化法.使細胞結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對枯燥細胞進行處理時，胞內物質就容易被抽提出來。氣流枯燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空枯燥多用于細菌。4.枯燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥.三、破碎率的測定與破碎技術的研究方向

細胞破碎后，大量帶電荷的內含物被釋放到水相，使導電率上升。

1.破碎率的測定直接測定法目的產物測定法導電率測定法采用染色的方法把破碎的細胞與未破碎的細胞區(qū)別開來。如破碎的革蘭氏陽性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細胞呈紫色，而受損害的細胞呈亮紅色。將破碎后的細胞懸浮液離心別離細胞碎片，測定上清液中目的產物〔如蛋白質或酶〕的含量或活性，并與100%破碎率所獲得的標準數值比較，計算其破碎率。.細胞破碎與固液別離緊密相關。2.破碎技術的研究方向多種破碎方法相結合與上游過程相結合與下游工程相結合化學法、酶法、機械法相結合。如用溶解酶預處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa壓力下勻漿4次，總破碎率接近100%。而單獨采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有32%。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基、生長期、操作參數〔如pH、溫度、通氣量、攪拌轉速、稀釋率等〕等因素都對細胞壁膜的結構與組成有一定的影響。細胞的破碎與上游培養(yǎng)過程有關。此外，用基因工程的方法對菌種進行改造，以提高胞內物質的提取率也是非常重要的。在生長后期，參加某些能抑制或阻止細胞壁物質合成的抑制劑〔如青霉素、環(huán)絲氨酸等〕，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，新分裂的細胞其細胞壁有缺陷，利于破碎；選擇較易破碎的菌種作為寄主細胞，如革蘭氏陰性細菌；在細胞內引進噬菌體基因，培養(yǎng)結束后，控制一定條件〔如溫度等〕，激活噬菌體基因，使細胞自內向外溶解，釋放出內含物。.定義：酶的提取是指在一定的條件下，用適當的溶劑或溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。原那么：酶提取時首先應根據酶的結構和溶解性質，選擇適當的溶劑。一般說來，極性物質易溶于極性溶劑中，非極性物質易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質易溶于堿性溶劑中，堿性物質易溶于酸性溶劑中。第三節(jié)酶的提取.酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質結合或含有較多的非極性基團，那么可用有機溶劑提取。提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。.酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質結合牢固或含有較多非極性基團的酶本章目錄.大多數蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現象。.+

=

-+

=

-■鹽溶液提取〔鹽溶Salting-in〕：Ionicstrength溶解度+-NaClNaClKCl-+++++------+++++-------------------------++++++++++++++++++++-+++++------+++++-----分子在其等電點時，容易互相吸引，聚合成沉淀；參加鹽離子會破壞這些吸引力，使分子散開，溶入水中。.■酸溶液提取有些酶在酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，易用酸溶液提取。本卷須知：pH值不能過低，以免使酶變性失活。.■堿溶液提取有些酶在堿性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，應采用堿溶液提取。本卷須知：pH值不能過高，以免使酶變性失活。.■有機溶液提取有些酶與脂質物質結合牢固，或含有較多的非極性集團，可以采用與水可以混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑提取。本卷須知：pH值不能過低，以免使酶變性失活。.影響酶提取的主要因素☆溫度在適當的范圍內，提高溫度可以加快酶的提?。弧頿H防止在等電點；☆提取液的體積增加提取液的用量，可以提高酶的提取率；但是過量的提取液，會使酶的濃度降低，對進一步別離純化不利.第四節(jié)酶的別離方法1、沉淀別離2、離心別離3、過濾與膜別離4、層析別離GoGoGoGo5、電泳別離Go6、萃取別離Go本章目錄.沉淀法是最古老的別離和純化生物物質的方法，目前仍廣泛應用在工業(yè)上和實驗室中。一、沉淀別離1、定義：沉淀別離是通過改變某些條件或添加某種物質，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質別離的技術過程。.由于其濃縮作用常大于純化作用，因而沉淀法通常作為初步別離的一種方法，用于從去除了菌體或細胞碎片的發(fā)酵液中沉淀出生物物質，然后再利用色層別離等方法進一步提高其純度。沉淀法由于本錢低、收率高(不會使蛋白質等大分子失活)、濃縮倍數高可達l0-50倍和操作簡單等優(yōu)點，是下游加工過程中應用廣泛的值得注意的方法。.2、沉淀的種類鹽析沉淀法等電點沉淀法有機溶劑沉淀熱沉淀法復合沉淀法選擇性變性沉淀法.1、鹽析沉淀法〔一〕定義：是利用不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質別離的過程。.〔二〕原理1.高濃度鹽離子使蛋白質外表雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱.2.中性鹽比蛋白質具更強的親水性，因此將與蛋白質爭奪水分子..蛋白質外表特性蛋白質溶解：相似者相溶親水性和疏水性：有利因素：親水性，包括氫鍵、極性基團、離子化側鏈、親水蛋白所占的%等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基團、疏水蛋白所占的%等。如纖維蛋白原。.鹽析的根本原理圖.三、鹽析劑中性鹽的選擇鹽析常用的中性鹽：硫酸銨最常用。其優(yōu)點是：溶解度大，25℃時飽和溶解度為4.1mol/L，即767g/L;0℃時飽和溶解度為3.9mol/L,即676g/L，在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以析出來；分段效果比其它鹽好，不容易引起其它蛋白質變性；價廉易得。.四、鹽析劑用量確實定例：以硫酸銨鹽析糖化酶

糖化酶的鹽析曲線.五、分部鹽析法1.分部鹽析法2.鹽析曲線3.兩種酶的別離..六.鹽析的影響因素1.蛋白質的種類蛋白質的種類不同，Ks〔鹽析系數〕值會有所不同；分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；.2.蛋白質的初始濃度不同濃度的蛋白質溶液產生沉淀所要求的臨界鹽濃度不同。蛋白質濃度大時，中性鹽的極限沉淀濃度低，共沉作用強，分辨率低，但用鹽量減少、蛋白質的溶解損失小。相反，蛋白質濃度低時，中性鹽的極限沉淀濃度高，共沉作用小，分辨率高，但用鹽量增大、蛋白質的回收率低。.3.無機鹽種類

陰離子鹽析作用順序檸檬酸鹽>PO43－>SO42－>CH3COO－>Cl－>NO3－>SCN－陽離子鹽析作用順序〔一價〕NH4+>K+>Na＋(NH4)2SO4.4.溫度

在高離子強度溶液中，升高溫度有利于蛋白質的失水，使之溶解度下降。在低離子強度溶液或純水中，蛋白質的溶解度在一定溫度范圍內一般隨溫度升高而增大。.5.pH值

在接近蛋白質等電點的溶液中進行鹽析有利于蛋白質的沉淀。需要注意在高鹽溶液中蛋白質的等電點會發(fā)生偏移。.2、等電點沉淀法

等電點定義；在等電點時溶液的性質；.3.有機溶劑沉淀法蛋白質和酶的水溶液，在逐漸參加乙醇、丙酮等有機溶劑后，其溶解度可不同程度地顯著降低，從溶液中沉淀出來。這種向水溶液中參加與水混溶的有機溶劑，使生物大分子溶解度降低而分組沉淀的方法，稱為有機溶劑分級沉淀法。.〔一〕：有機溶劑沉淀法原理1.有機溶劑有較低的介電常數，會使溶液介電常數減小，增強偶極離子之間的靜電引力．從而使分子集聚而沉淀。2.有機溶劑本身的水合作用會破壞蛋白質外表的水合層，也促使蛋白質分子脫水而沉淀。.相距為r的兩個點，電荷q1和q2互相作用的靜電力F可以下式表示：K：由介質的特性決定，稱為介電常數，在真空中定為1,介電常數表示介質對帶有相反電荷的微粒之間的靜電引力與在真空中比照減弱的倍數。蛋白質和酶是極性分子，其分子間有靜電引力，水也是極性分子，能減弱蛋白質等分子間的作用力，使蛋白質較易溶解，所以水是蛋白質等極性物質的較好溶劑。.在蛋白質和油等極性物質的水溶液中參加乙醇、丙酮等與水溶性的有機溶劑可降低介電常數，因而降低了蛋白質和酶的溶解度而使之沉淀。.特點有機溶劑沉淀法的優(yōu)點在于其分辨率高于鹽析，參加的有機溶劑易除去，且有機溶劑密度低，利于沉淀物別離。其缺點主要是比鹽析更易使蛋白變性，需低溫操作。.本卷須知：

(1)．有機溶劑的選擇

乙醇和丙酮是兩種最常用的有機溶劑，丙酮比乙醇的介電常數小些，即丙酮的沉淀能力較強。根據一般經驗，如30％一40％左右乙醇沉淀的物質，改用丙酮時濃度可減少10％左右，即用20％一30％的丙酮。.〔2〕溫度的控制有機溶劑沉淀的操作過程宜在低溫進行，而且最好在同一溫度下進行。參加的有機溶劑溫度要預冷到比操作溫度更低，因有機溶劑與水混溶時要放熱。在參加有機溶劑時攪拌要均勻適當，以防止局部濃度過高和溫度過高而導致的不良影響..〔3〕離子強度的控制離子強度在有機溶劑和水的混合液中是一個特別重要的因素。有時當離子強度很小時，物質不能沉淀，如補加少量電解質即可解決。一般可用醋酸銨、醋酸鈉或氯化鈉等．以溶劑能溶解且不影響提取物的質量為原那么。當鹽的離子強度到達一定程度時，能增加蛋白質或酶在有機溶劑中的溶解度。.(4)pH值的控制pH值影響蛋白質等在有機溶劑中的溶解度。蛋白質等分級沉淀更應嚴格控制pH值。有時為了防止帶相反電荷的蛋白質之間的相互結合，選擇pH值時可使大局部蛋白質帶有相同的凈電荷。.(5)．待別離物質的濃度控制蛋白質等物質濃度越大，參加有機溶劑后，由于溶解降低所引起的濃度差值也越大，蛋白質等沉淀量就越多。此外蛋白質等濃度大時，可減少變性，節(jié)省有機溶劑用量。.〔6〕金屬離子的影響金屬離子與蛋白質結合，其結果常使蛋白質的溶解度降低。利用金屬離子與生物大分子的反響，常有助于生物大分子的分組別離。例如，有些蛋白質與鋅離子等，可形成復合物，這種復合物在水和有機溶劑的混合物中的溶解度較低，易于形成結晶。.四、實例有機溶劑沉淀法制取食品級α-淀粉酶工藝流程說明：1.發(fā)酵液預處理2.壓濾3.濃縮4.沉淀5.壓濾6.枯燥.4.熱沉淀定義在較高溫度下，熱穩(wěn)定性差的蛋白質將發(fā)生變性沉淀，利用這一現象，可根據蛋白質間的熱穩(wěn)定性的差異進行蛋白質的熱沉淀，別離純化熱穩(wěn)定性高的目標產物。適用對象：熱穩(wěn)定性高的蛋白質.5、復合沉淀法在酶液中參加某些物質，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質別離的方法稱為復合沉淀法。.二、離心別離離心別離是借助于離心機旋轉所產生的離心力，使不同大小、不同密度的物質別離的技術過程。在離心別離時，要根據欲別離物質以及雜質的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當的離心機、離心方法和離心條件。.常速離心機又稱為低速離心機,其最大轉速在8000r/min以內，相對離心力〔RCF〕在1×104g以下，在酶的別離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的別離。也用于酶的結晶等較大顆粒的別離。高速離心機的最大轉速為〔1～2.5〕×104r/min，相對離心力到達1×104～1×105g，在酶的別離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的別離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機裝設有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。超速離心機的最大轉速達(2.5～12)×104r/min，相對離心力可以高達5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質等生物大分子以及細胞器、病毒等的別離純化；樣品純度的檢測；沉降系數和相對分子質量的測定等。.1、離心方法的選擇對于常速和高速離心機，由于所別離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和時間，就能到達別離效果。超速離心的離心方法：差速離心、密度梯度離心和等密度梯度離心.1、差速離心采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批別離的方法。主要用于別離大小和密度差異較大的顆粒。.2密度梯度離心樣品在密度梯度介質中進行離心，使沉降系數比較接近的物質得以別離的一種區(qū)帶別離方法。密度梯度系統(tǒng)：梯度介質有足夠大的溶解度，不與別離組分反響，不會引起別離組分的凝集、變性或失活。常用介質：蔗糖、甘油等。樣品鋪在密度梯度溶液外表，離心后形成假設干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。.3等密度離心當欲別離的不同顆粒的密度范圍在離心介質的密度梯度范圍內時，不同浮力密度的物質顆粒在離心力作用下一直移動到與各自浮力密度相等的位置〔等密度點〕，形成區(qū)帶。等密度離心常用的介質：銫鹽，如CsCl，Cs2SO4，CsBr.三、過濾與膜別離過濾是借助于過濾介質將不同大小、不同形狀的物質別離的技術過程。過濾介質多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結金屬和各種高分子膜等，可以根據需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質作為過濾介質

膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質

.過濾的分類及其特性(根據過濾介質截留的物質顆粒大小不同

)

類別截留顆粒大小截留的主要物質過濾介質粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細胞、植物細胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結金屬等微濾0.2～2μm細菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜.借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質顆?；蚍肿舆M行別離的技術稱為膜別離技術。膜別離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等。膜別離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。膜別離加壓膜別離微濾超濾反滲透電場膜別離電滲析離子交換膜電滲析

擴散膜別離透析.四、層析別離層析技術，亦稱色譜技術，是一種物理的別離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學性質的差異，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相那么流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而到達別離。。..層析別離方法層析方法分離依據吸附層析利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達到物質分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質的等電點特性與離子交換層析的特性結合在一起，實現組分分離.吸附層析是利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分別離的方法。吸附層析是各種層析技術中應用最早的技術。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設備簡單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲別離的混合溶液自柱頂參加，當樣品液全部進入吸附層析柱后，再參加洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。.分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數不同，而使各組分別離的方法。分配系數是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中溶解到達平衡時，該溶質在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數是一常數。在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物〔如濾紙、硅藻土、纖維素等〕吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。當某溶質在流動相的帶動流經固定相時，該溶質在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配。紙上層析分配薄層層析分配氣相層析

.離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團〔活性基團〕對各種離子的親和力不同而到達別離目的的一種層析別離方法。離子交換劑是含有假設干活性基團的不溶性高分子物質。通過在不溶性高分子物質〔母體〕上引入假設干可解離基團〔活性基團〕而制成。按活性基團的性質不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的別離純化。..凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而到達物質別離的一種層析技術。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經凝膠層析柱時，大分子物質由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內外，這就使小分子物質向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質量由大到小的順序先后流出層析柱，而到達別離的目的。..常用的凝膠：

葡聚糖凝膠

瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠

聚丙烯酰胺凝膠

.親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子別離純化的技術。酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補的RNA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的別離純化中有重要應用..載體的選擇選擇適當的載體是親和色譜能否成功的第一步，因此載體是負載著配基的固相支持物，它直接影響生物分子間的相互作用，理想的載體應具備：1．均一，有一定硬度，不溶于水；2．多孔網狀結構，易為大分子滲透；3．具有相當數量可供偶聯反響的基團；4．沒有吸附能力，不會發(fā)生非專一吸附；5．有足夠的化學穩(wěn)定性，經得起吸附洗脫和再生時所用的各種條件的處理；6．不受微生物腐蝕和降解；7．親水。.〔1〕、瓊脂糖凝膠瓊脂糖是D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖交替結合的鏈狀多糖。.由于瓊脂糖凝膠是一種熱可逆凝膠，凝膠受熱即失去穩(wěn)定性，最后溶解。因此，凝膠必須保存在低溫下，但不能凍結，因為凍結也破壞可逆結構。凝膠不能加熱消毒，宜濕態(tài)儲存。瓊脂糖耐受的溶劑和介質的條件.〔2〕、聚丙烯酰胺凝膠能經受有機溶劑及鹽類、去污劑、鹽酸胍、尿素的稀溶液處理，凝膠外表有許多酰胺基可供偶聯配基，它的缺點是結構緊密、孔小、有些配基在孔內，大分子鉆不進小孔，因而只能接觸到分布在凝膠外表上的配基，影響別離效果。.〔3〕、葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是由葡聚糖經環(huán)氧氯丙烷交聯而成的產物，它有良好的化學及物理穩(wěn)定性，但多孔性那么較瓊脂糖凝膠為低，并且經過偶聯配基的操作后，凝膠的膨脹度將進一步縮減，因而在親和色譜中的應用也受到一定限制。.配體的選擇配體是親和層析最重要成分。選擇好的配體有三個標準：一是能和欲別離蛋白質專一性結合，而且親和力越大越好；二是結合后又能解離，而且無損于蛋白質的生物活性；三是配體上必須含有適當的化學基團，通過這些基團可以用化學方法把配體偶聯到載體上，而且這種偶聯不損害配體與蛋白質的專一性結合。.親和層析的配體大體分三類：一是對特定蛋白質有親和力的小分子配體，如酶底物(或底物類似物)、調節(jié)配體、效應物．酶捕助因子等；二是對特定蛋白質有親和力的大分子；三是共價親和層析中的配體，它含有能與目的蛋白質共價可逆作用的局部。.根據欲別離組分與配基的結合特性,親和層析可以分為： 共價親和層析 疏水層析 金屬離子親和層析 免疫親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析.5、電泳別離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：

紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳

顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。.6