外源aba對鎖陽莖切口愈合及抗氧化酶活性的影響

外源aba對鎖陽莖切口愈合及抗氧化酶活性的影響

傷口愈合是由木塞狀化和相關(guān)傷口形成的一個過程。木栓化細胞及相關(guān)的疏水結(jié)構(gòu)可抵抗真菌及細菌的侵入和防止水分的流失(Schreiber等2005)。馬鈴薯塊莖切口引起的超氧自由基可以參與過氧化物酶介導(dǎo)的將酚類單體加聚到芳香族木栓質(zhì)上的氧化偶聯(lián)反應(yīng),從而起到抵抗微生物入侵的作用(Kumar和Knowles2003)。而真菌和細菌的入侵以及塊莖的氧化又被公認(rèn)為是引起塊莖污染及褐變的主要原因。隨著草莓果實儲存時間的增加,果實中苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)活性及產(chǎn)生超氧化物的能力下降從而降低果實抵抗微生物侵染的能力(Jiang和Joyce2003)。外源脫落酸(abscisicacid,ABA)可誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖PAL活性的增加,并促進塊莖的切口愈合(Kumar等2010)。在切口愈合過程中內(nèi)源ABA含量不斷增加,而噴施氟啶酮可介導(dǎo)抑制創(chuàng)傷處ABA的合成以及PAL活性,更重要的是這種抑制作用可通過添加外源ABA而解除,從而恢復(fù)PAL活性和木栓化(Soliday等1978;Lulai等2008)。植物在遭受逆境脅迫時,其抗氧化防護能力會提高以使植物度過逆境(楊瑾等2011)。ABA是植物的抗逆誘導(dǎo)因子,因而被稱為植物的“脅迫激素”。ABA預(yù)處理可以增強植株在諸如冷害、高溫、鹽脅迫和水分脅迫條件下的抗氧化防護能力(許樹成等2008)。ABA還可介導(dǎo)應(yīng)答病原體入侵和創(chuàng)傷。鎖陽是多年生高等寄生植物,為我國重要的中藥和蒙藥植物資源。可作補腎、助陽、益精、潤腸藥物,主治陽痿遺精、腰膝酸軟、腸燥便秘(Ma等2008)。目前,鎖陽人工種植技術(shù)尚未成熟,隨著人們對鎖陽需求量日益增加,野生植物資源面臨枯竭。深入開展鎖陽組織培養(yǎng)研究勢在必行,本實驗室首次建立了鎖陽莖和種子的愈傷組織誘導(dǎo)體系(專利授權(quán)號:ZL200810240383.4;ZL2008-10240382.X)。制約鎖陽組織培養(yǎng)的主要因素是外植體的污染及愈傷組織的褐化。因此研究外源ABA對鎖陽莖切口愈合過程的影響,對防止鎖陽組織培養(yǎng)過程中愈傷組織的褐化以及鎖陽保鮮和鎖陽產(chǎn)品加工過程中的褐化具有借鑒作用。材料和方法1關(guān)于內(nèi)蒙古雙貴拉氏鎮(zhèn)鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗獨貴塔拉鎮(zhèn)。取30~50cm長完整新鮮的鎖陽,將鎖陽莖分為上(花序部)、中、下3個部位。2方法2.1aba重氮培養(yǎng)液及其制備方法切口愈合處理采用Kumar等(2010)的方法進行。將每個部位切成直徑1.7cm,厚3mm的若干個小圓片,在100μmol·L-1的ABA中浸泡5min,對照組在蒸餾水中浸泡,然后將鎖陽莖小片取出置于放有濕濾紙的培養(yǎng)皿中進行切口愈合(每個培養(yǎng)皿放9片,每個處理3個培養(yǎng)皿),然后蓋上蓋。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中(23℃)暗培養(yǎng)4d,期間保持濾紙的濕度在99%以上。已愈合的鎖陽莖置于烘箱中脫水(45℃)并分別在0、10、20、40和80min測定其重量的減少。以重量的減少率即失水率表示切口愈合的程度。2.2鎖陽莖內(nèi)源aba含量隨切口愈合時間的變化規(guī)律采用López-Ráez等(2010)的方法,0.5g鎖陽莖提取其內(nèi)源ABA,然后進行超高效液相(WatersAcquityUPLC)分析,條件為:用含不同百分濃度的乙腈溶液沖洗柱子(BEHC182.1mm×50mm,1.7μm),開始用水溶液沖2min,8min后逐漸變成50%乙腈溶液,1min后升到90%,接著平衡柱子1min,0.2min后乙腈降到0,然后柱子在當(dāng)前溶劑狀態(tài)下平衡2.8min,總共運行時間15min。柱溫50℃,流速0.4mL·min-1,取樣量10μL。繪制鎖陽莖內(nèi)源ABA含量在不同部位隨切口愈合時間的變化圖。試驗設(shè)3次重復(fù)。2.3生化酶活性測定PAL的提取采用Kumar等(2010)的方法,用Sugimoto等(2000)的方法檢測上清液中的PAL活性,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中反式肉桂酸的濃度。PAL活性表示為每mg蛋白質(zhì)每min產(chǎn)生的反式肉桂酸的nmol數(shù)。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性的測定采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)還原法(Jiang和Zhang2002a),以抑制NBT光化還原50%的酶量為一個酶活力單位(U)。過氧化氫酶(catalase,CAT)的活性測定采用H2O2紫外吸收法(Jiang和Zhang2002b)。抗壞血酸過氧化物酶(ascorbateperoxidase,APX)活性測定采用紫外吸收法(Saruyama和Tanida1995)。以上實驗均設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果1aba的濃度對鎖陽莖愈合能力的影響鎖陽莖的切口愈合能力用抗失水力來表示,失水率越小表明其切口愈合能力越強,失水率越大表明其切口愈合能力越弱。隨脫水時間的增加,經(jīng)ABA處理的鎖陽莖3個部位的失水率均明顯低于對照組,并呈現(xiàn)出隨脫水時間延長有差距加大的趨勢(圖1)。表明ABA處理增強了鎖陽莖的抗失水力,有利于加快切口愈合。同時,外源ABA對鎖陽莖上部切口愈合能力的增強作用比對中部和下部的大。從圖2可以看出,隨著愈合天數(shù)的增加,鎖陽莖內(nèi)源ABA含量均呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢。3個部位內(nèi)源ABA含量為上部高于中部,中部高于下部。愈合第3天莖上部和中部升至最高,隨后又有所下降,而莖下部第4天達到最大。愈合第3天時莖上部的ABA含量比中部和下部分別高25.0%和90.2%。3aba對鎖陽莖pal活性的影響圖3可見,無論是ABA處理還是對照組鎖陽莖3個部位PAL活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,經(jīng)ABA處理的PAL活性均明顯高于對照組。愈合第1天,ABA處理的鎖陽莖上中下3個部位的PAL活性分別比對照組高47.1%、25.1%和73.8%。這表明ABA處理明顯增強了鎖陽莖的PAL活性。從而加速了切口愈合處的栓質(zhì)化。4aba對帶陽莖氧化酶活性的影響4.1陽莖內(nèi)部和中部sod活性的變化鎖陽莖SOD活性均隨愈合天數(shù)的增加而增加經(jīng)ABA處理的SOD活性明顯高于對照組。ABA處理的鎖陽莖上部和中部的SOD活性在愈合第1天迅速升高,之后增長趨于平穩(wěn),而下部的SOD活性在愈合第2天達到高峰,隨后略有下降(圖4)。這表明,ABA處理明顯增強了鎖陽莖切口愈合早期的SOD活性,SOD酶可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害,并及時修復(fù)受損細胞,從而提高了鎖陽莖抗氧化的能力。4.2aba對3個部位cat活性的影響隨著愈合天數(shù)的增加鎖陽莖3個部位CAT活性均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢,愈合第2天各處理CAT活性均升至最高,ABA處理后的CAT活性明顯高于對照組(圖5)。愈合第2天,ABA處理后的鎖陽莖上中下3個部位的CAT活性分別比對照組高68.1%、48.8%和28.2%。這表明,ABA處理明顯增強了鎖陽莖上中部的CAT的活性,CAT活性的增強可加速分解切口處的過氧化氫,使切口處的細胞免受氧化損傷。4.3aba對鎖陽莖apx活性的影響由圖6可見,隨愈合天數(shù)的延長,對照組和ABA處理組的鎖陽莖3個部位APX活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,并都在處理后第1天升至最高。ABA處理的鎖陽莖3個部位的APX活性均明顯高于對照組。這表明ABA處理明顯增強了鎖陽莖的APX活性,影響程度由大到小依次為莖上部、中部和下部。APX活性的升高進一步加速了鎖陽莖分解過氧化氫,從而有利于鎖陽莖抵抗氧化損傷,增強其抗氧化能力。aba對鎖陽莖切口愈合過程中pal和抗氧化酶活性的影響植物應(yīng)答創(chuàng)傷切口時產(chǎn)生封閉的木栓化細胞層和周皮,以增強植物抗失水和抗微生物入侵的能力(Schreiber等2005)。木栓化過程包括聚酚醛(SPP)或聚芳香(SPA)的合成及積累于切口相關(guān)的細胞壁上,木栓化的過程與木質(zhì)素合成的過程相似,也需要PAL的參與(Lapierre等1996)。PAL活性可由各種因素誘發(fā),如病菌入侵,昆蟲啃食,創(chuàng)傷暴露于低溫之下(Dixon和Paiva1995),并在切口愈合過程中在催化苯丙烷途徑中起著關(guān)鍵性作用(Kato等2000)。塊莖在應(yīng)答切口時會啟動轉(zhuǎn)錄上調(diào)機制即PAL機制,而產(chǎn)生反式肉桂酸和P-香豆酸單體,最終組成木栓質(zhì)層的聚酚醛類(SPP)或聚芳香類(SPA)(Lulai2007),從而促進切口愈合減少失水。SPP的積累可以使創(chuàng)傷的馬鈴薯塊莖抵抗細菌感染,而SPA是負責(zé)抗真菌性感染的(Kumar等2010)。此外,ABA處理可促進馬鈴薯塊莖切口處木質(zhì)化及PAL-1基因的表達,從而使PAL活性升高進而促進切口愈合(Kumar等2010)。本實驗中鎖陽莖經(jīng)ABA處理后的PAL活性提高,失水率明顯下降,表明ABA處理可能通過促進鎖陽肉質(zhì)莖切口細胞木栓化以加速切口愈合從而抵抗失水。植物處于正常發(fā)育狀態(tài)時,體內(nèi)ABA含量是處于合成與代謝的平衡水平(Destefano-Betran等2006)。鎖陽莖切口愈合過程中,通過內(nèi)源ABA的合成增加來應(yīng)答創(chuàng)傷,然后通過調(diào)控PAL活性來加速木栓化,從而提高了鎖陽莖的切口愈合能力,這與Kumar等(2010)的結(jié)果一致。當(dāng)植物受到逆境脅迫時,體內(nèi)活性氧增加,從而誘導(dǎo)了抗氧化酶類活性的升高和抗氧化物質(zhì)含量增加,進而更加有效清除活性氧,保護植物細胞免受傷害(鄒清成等2011)。當(dāng)植物受到氮脅迫(楊瑾等2011)、鹽脅迫(李向前等2010)以及生物脅迫(臺蓮梅等2010)時抗氧化酶活性都會升高。而ABA處理也會使其活性升高,ABA處理使玉米胚芽鞘(Gong等1998)包括SOD和POD在內(nèi)的所有抗氧化防護酶活性增加。Kumar等(2007)研究表明馬鈴薯塊莖切口可誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧化物,超氧化物可促進愈合初期SPA和SPP的加聚反應(yīng)從而促進愈合,但過多的超氧化物會使莖受到氧化損傷。本文研究結(jié)果顯示,ABA處理明顯增強了鎖陽莖的SOD、CAT和APX活性,這可能促進了鎖陽莖在切口愈合后期清除多余的超氧化物,使切口處細胞免受氧化損傷,從而提