大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性與三唑磷抗性的關(guān)聯(lián)剖析

大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性與三唑磷抗性的關(guān)聯(lián)剖析一、引言1.1研究背景水稻作為全球重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和質(zhì)量直接關(guān)系到全球糧食安全。大螟（SesamiainferensWalker），隸屬鱗翅目夜蛾科，是水稻生產(chǎn)中的重要害蟲之一，除危害水稻外，還對(duì)玉米、小麥、油菜、茭白等多種作物造成損害。在我國(guó)，大螟廣泛分布于各稻區(qū)，尤其在長(zhǎng)江以南地區(qū)危害較為嚴(yán)重。近年來，隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及水稻栽培方式的改變，大螟的發(fā)生與危害呈明顯上升趨勢(shì)，逐漸從次要害蟲轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕οx，給水稻生產(chǎn)帶來了巨大威脅。大螟幼蟲孵化后會(huì)群集在水稻葉鞘處進(jìn)行危害，隨著幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，它們會(huì)逐漸轉(zhuǎn)移到莖稈內(nèi)蛀食，進(jìn)而引發(fā)水稻出現(xiàn)枯鞘、枯心、枯孕穗、白穗、半枯穗以及蟲傷株等癥狀，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量。據(jù)相關(guān)資料顯示，在大螟危害嚴(yán)重的年份，水稻產(chǎn)量損失可達(dá)10%-30%，甚至更高。例如，在江蘇、浙江等地，由于大螟的爆發(fā)，部分稻田減產(chǎn)幅度達(dá)到了20%以上，不僅降低了農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入，還對(duì)糧食供應(yīng)造成了一定壓力?；瘜W(xué)防治作為控制大螟危害的重要手段，在過去幾十年中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。三唑磷作為一種有機(jī)磷類殺蟲劑，具有高效、廣譜、低殘留等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于大螟等害蟲的防治。然而，隨著三唑磷的長(zhǎng)期大量使用，大螟對(duì)其抗性問題日益凸顯。害蟲抗藥性的產(chǎn)生，不僅會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥使用量的增加，提高防治成本，還會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成更大的壓力，引發(fā)一系列環(huán)境問題。同時(shí)，高劑量的農(nóng)藥殘留也會(huì)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成威脅，危害人體健康。乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的重要作用靶標(biāo)。當(dāng)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類殺蟲劑與AChE結(jié)合后，會(huì)抑制其活性，導(dǎo)致乙酰膽堿在突觸間隙大量積累，從而使昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，最終死亡。在長(zhǎng)期的農(nóng)藥選擇壓力下，昆蟲AChE基因可能會(huì)發(fā)生突變，導(dǎo)致其氨基酸序列改變，進(jìn)而降低AChE與殺蟲劑的親和力，使昆蟲對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性。研究大螟AChE基因的多態(tài)性，有助于深入了解大螟對(duì)三唑磷產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制，為大螟的抗性監(jiān)測(cè)和治理提供理論依據(jù)。此外，明確大螟AChE基因多態(tài)性與三唑磷抗性之間的關(guān)系，還可以為開發(fā)新的殺蟲劑以及制定更加科學(xué)合理的害蟲防治策略提供參考。通過對(duì)大螟抗性機(jī)制的研究，能夠篩選出具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新作用靶標(biāo)，為新型殺蟲劑的研發(fā)提供方向。同時(shí)，基于抗性監(jiān)測(cè)結(jié)果，可以制定針對(duì)性的防治方案，避免盲目用藥，減少農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，開展大螟乙酰膽堿酯酶基因的多態(tài)性及三唑磷抗性分析具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在通過對(duì)大螟乙酰膽堿酯酶基因的多態(tài)性及三唑磷抗性進(jìn)行深入分析，明確大螟AChE基因多態(tài)性與三唑磷抗性之間的關(guān)系，揭示大螟對(duì)三唑磷產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制，為大螟的抗性監(jiān)測(cè)和治理提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。具體而言，本研究的意義主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：理論意義：從分子層面揭示大螟對(duì)三唑磷產(chǎn)生抗性的機(jī)制，有助于豐富昆蟲抗藥性理論，加深對(duì)害蟲抗藥性進(jìn)化的理解。通過研究大螟AChE基因的多態(tài)性，能夠了解基因變異與抗藥性之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步探究其他害蟲對(duì)有機(jī)磷類殺蟲劑的抗性機(jī)制提供參考，推動(dòng)昆蟲抗藥性研究領(lǐng)域的發(fā)展。實(shí)踐意義：準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)大螟的抗藥性水平，為制定科學(xué)合理的防治策略提供依據(jù)。通過對(duì)大螟AChE基因多態(tài)性的檢測(cè)，可以快速、準(zhǔn)確地判斷大螟種群的抗藥性狀況，從而指導(dǎo)農(nóng)民合理選擇農(nóng)藥種類和使用劑量，避免盲目用藥，提高防治效果，減少農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染。同時(shí)，本研究結(jié)果還可為開發(fā)新型殺蟲劑提供理論指導(dǎo)，為尋找新的作用靶標(biāo)和研發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好的殺蟲劑提供思路，有助于推動(dòng)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。二、大螟及其抗藥性概述2.1大螟的生物學(xué)特性大螟隸屬鱗翅目夜蛾科，在不同生長(zhǎng)階段呈現(xiàn)出獨(dú)特的形態(tài)特征。成蟲階段，雌蛾體長(zhǎng)約15mm，翅展達(dá)30mm左右，其頭部與胸部色澤淺黃褐，腹部則為淺黃色至灰白色，觸角呈絲狀，前翅近似長(zhǎng)方形，顏色淺灰褐，翅面中部有4個(gè)小黑點(diǎn)排列成四角形狀；雄蛾相對(duì)較小，體長(zhǎng)約12mm，翅展27mm，觸角為櫛齒狀。大螟的卵呈扁圓形，初產(chǎn)時(shí)為白色，隨后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榛尹S色，表面布滿細(xì)縱紋和橫線，這些卵聚生或散生，常排列成2-3行。末齡幼蟲體長(zhǎng)約30mm，較為粗壯，頭部顏色從紅褐色至暗褐色，共5-7齡。蛹長(zhǎng)13-18mm，體型粗壯，顏色呈紅褐色，腹部帶有灰白色粉狀物，臀棘處有3根鉤棘。大螟的生活史在不同地區(qū)因氣候條件差異而有所不同。在云、貴高原地區(qū)，一年發(fā)生2-3代；江蘇、浙江等地為3-4代；江西、湖南、湖北、四川等地年生4代；福建、廣西及云南開遠(yuǎn)為4-5代；廣東南部、臺(tái)灣則多達(dá)6-8代。大螟以老熟幼蟲在茭白、水稻等作物莖稈或根茬內(nèi)越冬，當(dāng)翌春氣溫高于10℃時(shí)，老熟幼蟲開始化蛹，15℃時(shí)羽化。越冬代成蟲將卵產(chǎn)在春玉米或田邊看麥娘、李氏禾等雜草葉鞘內(nèi)側(cè)，幼蟲孵化后便轉(zhuǎn)移至鄰近邊行水稻上，蛀入葉鞘內(nèi)取食，蛀入處會(huì)出現(xiàn)紅褐色銹斑塊。在蘇南地區(qū)，越冬代發(fā)生在4月中旬至6月上旬，第1代在6月下旬至7月下旬，二代7月下旬至10月中旬；寧波一帶，越冬代在4月上旬至5月下旬發(fā)生，第1代6月中旬至7月下旬，二代8月上旬至下旬，三代9月中旬至10月中旬；長(zhǎng)沙、武漢地區(qū)，越冬代發(fā)生在4月上旬至5月中旬。大螟的發(fā)生規(guī)律與多種因素密切相關(guān)。成蟲白天潛伏，傍晚開始活動(dòng)，其飛翔力強(qiáng)，常棲息在株間，但趨光性較弱。每雌可產(chǎn)卵240粒，卵歷期在一代時(shí)為12天，2、3代則為5-6天；幼蟲期一代約30天，二代28天，三代32天；蛹期10-15天。早春10℃以上的溫度來得早，大螟發(fā)生也會(huì)提前?？拷迩f的低洼地及麥套玉米地，大螟發(fā)生較為嚴(yán)重，春玉米發(fā)生相對(duì)偏輕，夏玉米發(fā)生較重。大螟是一種多食性害蟲，寄主范圍廣泛，涵蓋甘蔗、禾本科作物、蠶豆、油菜、棉花、蘆葦、水稻、玉米、高粱、麥、粟等多種植物。在水稻上，大螟的為害特點(diǎn)顯著，從水稻分蘗期至基本成熟均會(huì)受到其侵害，尤其是破口抽穗期與蟻螟盛孵期相吻合的稻田受害最為嚴(yán)重。初孵幼蟲多在孕穗期侵入，孕穗初期侵入率約為12%，后期為6%左右，齊穗后便不能侵入。大螟幼蟲蛀入稻莖為害，可造成枯梢、枯心苗、枯孕穗、白穗及蟲傷株等癥狀。其為害的孔較大，有大量蟲糞排出莖外，這一特征區(qū)別于二化螟。大螟為害造成的枯心苗，蛀孔大、蟲糞多，且大部分不在稻莖內(nèi)，多夾在葉鞘和莖稈之間，受害稻莖的葉片、葉鞘部都會(huì)變?yōu)辄S色，并且田邊的枯心苗較多，田中間較少，這又與二化螟、三化螟為害造成的枯心苗有所不同。2.2大螟的防治策略大螟的防治是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，需要綜合運(yùn)用多種防治手段，以實(shí)現(xiàn)有效控制害蟲種群數(shù)量、減少危害損失的目標(biāo)。目前，針對(duì)大螟的防治策略主要包括農(nóng)業(yè)防治、物理防治、生物防治和化學(xué)防治等多個(gè)方面。農(nóng)業(yè)防治作為大螟防治的基礎(chǔ)措施，通過調(diào)整農(nóng)事操作和栽培管理方式，從源頭上減少大螟的發(fā)生和危害。例如，在冬季或成蟲羽化前，對(duì)寄主秸稈進(jìn)行妥善處理，如粉碎還田、焚燒或深埋等，能夠有效壓低蟲口基數(shù)。在大螟越冬代成蟲羽化前，及時(shí)清除田間及周邊雜草，破壞其棲息和繁殖場(chǎng)所，減少蟲源。此外，合理密植、科學(xué)施肥，促進(jìn)水稻健壯生長(zhǎng)，增強(qiáng)水稻自身的抗蟲能力，也有助于減輕大螟的危害。比如，在江蘇的一些稻田，通過合理密植，使水稻植株分布均勻，通風(fēng)透光良好，大螟的落卵量明顯減少，危害程度降低。物理防治利用害蟲的趨性和習(xí)性，采用物理方法進(jìn)行誘捕或驅(qū)避。燈光誘捕是一種常見的物理防治手段，利用大螟成蟲的趨光性，在田間設(shè)置黑光燈或頻振式殺蟲燈，在成蟲羽化期進(jìn)行誘捕。一般每30-50畝設(shè)置一盞燈，燈的高度距離地面1.5-2米，每天從日落開啟至日出關(guān)閉，可有效誘殺大量成蟲。糖醋液誘殺也是一種有效的方法，按照糖：醋：酒：水=3:4:1:2的比例配制糖醋液，加入少量敵百蟲等殺蟲劑，裝入開口較大的容器中，懸掛在田間，每隔3-5天更換一次糖醋液，可誘捕大螟成蟲。生物防治是利用天敵昆蟲、微生物等生物因素來控制大螟種群數(shù)量，具有環(huán)保、可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)。在大螟的天敵中，寄生蜂是一類重要的生物防治因子，如螟黃赤眼蜂、稻螟赤眼蜂等，它們能夠?qū)⒙旬a(chǎn)在大螟卵內(nèi)，使大螟卵不能正常孵化，從而達(dá)到控制大螟種群數(shù)量的目的。通過人工繁殖和釋放這些寄生蜂，可有效增加田間天敵數(shù)量，發(fā)揮生物防治作用。一些微生物制劑，如蘇云金芽孢桿菌、白僵菌等，對(duì)大螟也具有一定的防治效果。這些微生物能夠在大螟體內(nèi)寄生或產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致大螟死亡。例如，在浙江的部分稻田，使用蘇云金芽孢桿菌制劑進(jìn)行噴霧防治，大螟的蟲口密度明顯下降，防治效果達(dá)到70%以上?；瘜W(xué)防治在大螟防治中占據(jù)重要地位，具有快速、高效、使用方便等特點(diǎn)。當(dāng)大螟蟲口密度較高，可能對(duì)農(nóng)作物造成嚴(yán)重危害時(shí)，化學(xué)防治能夠迅速降低蟲口密度，控制危害蔓延。三唑磷作為一種有機(jī)磷類殺蟲劑，因其高效、廣譜的殺蟲特性，在大螟防治中被廣泛應(yīng)用。在大螟幼蟲孵化初期，選用合適的化學(xué)藥劑進(jìn)行噴霧防治，可有效殺死幼蟲。例如，使用40%三唑磷乳油1000-1500倍液，按照每畝用藥液量30-50升的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)水稻全株進(jìn)行均勻噴霧，能夠取得較好的防治效果。但隨著三唑磷的長(zhǎng)期大量使用，大螟對(duì)其抗性問題日益突出，這給化學(xué)防治帶來了挑戰(zhàn)。因此，在使用化學(xué)防治時(shí)，需要科學(xué)合理地選擇藥劑，嚴(yán)格按照使用說明控制用藥劑量和次數(shù)，避免盲目用藥和濫用農(nóng)藥，以延緩害蟲抗藥性的產(chǎn)生，同時(shí)減少對(duì)環(huán)境和非靶標(biāo)生物的影響。2.3大螟抗藥性研究現(xiàn)狀大螟作為水稻等農(nóng)作物的重要害蟲，其抗藥性問題一直是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來，隨著農(nóng)藥的廣泛使用，大螟對(duì)多種殺蟲劑的抗性逐漸顯現(xiàn)，給害蟲防治工作帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。在有機(jī)磷類殺蟲劑方面，大螟對(duì)部分藥劑的抗性已較為明顯。研究表明，大螟對(duì)稻豐散的抗性呈上升趨勢(shì)，浙江溫嶺和江蘇南京等地的大螟種群對(duì)稻豐散的抗性倍數(shù)在不斷增加。然而，關(guān)于大螟對(duì)三唑磷的抗性研究相對(duì)較少，且不同地區(qū)的研究結(jié)果存在差異。部分地區(qū)的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，大螟對(duì)三唑磷的抗性水平較低，但也有研究發(fā)現(xiàn)，在一些長(zhǎng)期大量使用三唑磷的地區(qū)，大螟對(duì)其敏感性有所下降，這表明大螟對(duì)三唑磷的抗性可能正處于發(fā)展階段。除有機(jī)磷類殺蟲劑外，大螟對(duì)其他類型的殺蟲劑也表現(xiàn)出不同程度的抗性。例如，在氨基甲酸酯類殺蟲劑中，大螟對(duì)某些品種的抗性逐漸增強(qiáng)，這可能與該類殺蟲劑的作用機(jī)制以及大螟的生理特性有關(guān)。在擬除蟲菊酯類殺蟲劑方面，雖然大螟對(duì)其整體抗性水平相對(duì)較低，但部分地區(qū)的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，大螟對(duì)個(gè)別擬除蟲菊酯類藥劑的抗性有上升趨勢(shì)。此外，對(duì)于新型殺蟲劑，如氯蟲苯甲酰胺、氟苯蟲酰胺等，目前大螟對(duì)它們的抗性相對(duì)較弱，但隨著這些藥劑的廣泛使用，其抗性風(fēng)險(xiǎn)也不容忽視。在大螟抗藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)方面，目前主要采用生物測(cè)定法，如初孵幼蟲人工飼料藥膜法等，來測(cè)定大螟對(duì)不同殺蟲劑的敏感性。這些方法雖然能夠較為準(zhǔn)確地反映大螟的抗藥性水平，但存在操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些基于分子標(biāo)記的抗藥性檢測(cè)方法逐漸應(yīng)用于大螟抗藥性研究中，如利用PCR技術(shù)檢測(cè)大螟乙酰膽堿酯酶基因的突變情況，這些方法具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，為大螟抗藥性監(jiān)測(cè)提供了新的手段。綜上所述，雖然目前關(guān)于大螟抗藥性的研究已取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多不足之處。尤其是在三唑磷抗性方面，研究的廣度和深度都有待加強(qiáng)。本研究將針對(duì)大螟乙酰膽堿酯酶基因的多態(tài)性及三唑磷抗性進(jìn)行深入分析，旨在填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白，為大螟的抗性監(jiān)測(cè)和治理提供更為全面和深入的理論依據(jù)。三、昆蟲乙酰膽堿酯酶（AChE）與抗藥性3.1昆蟲AChE的種類與功能在昆蟲的生理活動(dòng)中，乙酰膽堿酯酶（AChE）扮演著不可或缺的角色。昆蟲體內(nèi)的AChE主要分為兩類，這兩類AChE在基因序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)功能上存在一定差異。第一類AChE，通常被稱為AChE1，其基因結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子。在氨基酸序列上，AChE1具有一些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了它特定的催化活性和底物結(jié)合能力。例如，在黑腹果蠅中，AChE1基因的某些區(qū)域編碼了與催化活性中心相關(guān)的氨基酸殘基，這些殘基對(duì)于AChE1高效水解乙酰膽堿起著關(guān)鍵作用。AChE1主要分布于昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)突觸間隙中大量存在。它的主要功能是在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中，迅速催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh）。當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)到達(dá)突觸前膜時(shí)，ACh被釋放到突觸間隙，與突觸后膜上的受體結(jié)合，從而傳遞神經(jīng)信號(hào)。而AChE1能夠及時(shí)將ACh分解為膽堿和乙酸，終止神經(jīng)信號(hào)的傳遞，使神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)到靜息狀態(tài)，保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞。第二類AChE，即AChE2，其基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列與AChE1有所不同。以家蠶為例，研究發(fā)現(xiàn)AChE2基因的外顯子和內(nèi)含子組成與AChE1存在明顯差異，導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和功能上也具有獨(dú)特性。AChE2不僅分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在昆蟲的外周神經(jīng)系統(tǒng)以及一些非神經(jīng)組織中也有一定表達(dá)。在功能方面，AChE2同樣參與乙酰膽堿的水解過程，但與AChE1相比，它對(duì)底物的親和力和催化效率可能存在差異。一些研究表明，在某些昆蟲中，AChE2在調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用，尤其在應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化時(shí)，AChE2能夠通過調(diào)節(jié)乙酰膽堿的水解速度，維持神經(jīng)信號(hào)的正常傳遞，確保昆蟲的生理活動(dòng)不受干擾。當(dāng)昆蟲AChE的功能受到抑制時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重后果。有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑是AChE的特異性抑制劑，它們能夠與AChE的活性中心結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而抑制AChE的活性。在大螟等昆蟲中，當(dāng)AChE被這些殺蟲劑抑制后，乙酰膽堿無法及時(shí)水解，會(huì)在突觸間隙中大量積累。這會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞持續(xù)受到刺激，神經(jīng)沖動(dòng)過度傳遞，使昆蟲出現(xiàn)興奮、痙攣、麻痹等中毒癥狀，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。然而，在長(zhǎng)期的農(nóng)藥選擇壓力下，昆蟲AChE基因可能會(huì)發(fā)生突變，使得AChE的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，降低其對(duì)殺蟲劑的敏感性，從而使昆蟲產(chǎn)生抗藥性，這也正是大螟對(duì)三唑磷等有機(jī)磷殺蟲劑抗性產(chǎn)生的重要分子機(jī)制之一。3.2AChE基因結(jié)構(gòu)與多態(tài)性昆蟲AChE基因的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，以黑腹果蠅為例，其AChE基因包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，外顯子負(fù)責(zé)編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，而內(nèi)含子則在基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。在其他昆蟲中，如埃及伊蚊，其AChE基因5’非翻譯區(qū)前導(dǎo)序列中存在一個(gè)長(zhǎng)達(dá)19kb的內(nèi)含子，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征可能影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。家蠶的AChE基因同樣具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，不同類型的AChE基因在核苷酸序列和氨基酸序列上存在差異，這些差異導(dǎo)致它們編碼的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和功能上有所不同。AChE基因的多態(tài)性主要源于基因突變。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，AChE基因可能會(huì)發(fā)生堿基替換、插入或缺失等突變。例如，在麥二叉蚜中，研究發(fā)現(xiàn)其AChE基因存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP），這些位點(diǎn)的突變導(dǎo)致了氨基酸序列的改變。在大螟中，AChE基因的多態(tài)性可能也是由類似的基因突變引起的。農(nóng)藥的選擇壓力是導(dǎo)致AChE基因多態(tài)性的重要因素之一。當(dāng)昆蟲長(zhǎng)期暴露于含有三唑磷等殺蟲劑的環(huán)境中時(shí)，對(duì)殺蟲劑敏感的個(gè)體因AChE被抑制而死亡，而AChE基因發(fā)生突變、具有抗性的個(gè)體則能夠存活下來并繁殖后代。隨著時(shí)間的推移，抗性個(gè)體在種群中的比例逐漸增加，導(dǎo)致AChE基因多態(tài)性的產(chǎn)生。AChE基因的多態(tài)性對(duì)昆蟲抗藥性有著顯著影響。當(dāng)AChE基因發(fā)生突變時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致其編碼的AChE氨基酸序列改變，進(jìn)而影響AChE的空間結(jié)構(gòu)和功能。例如，某些突變可能會(huì)使AChE的活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低其與殺蟲劑的親和力，使殺蟲劑難以與AChE結(jié)合并抑制其活性，從而使昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性。在對(duì)家蠅的研究中發(fā)現(xiàn)，AChE基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致了AChE活性中心附近氨基酸的改變，使得家蠅對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的抗性顯著增強(qiáng)。在大螟中，AChE基因的多態(tài)性可能同樣通過改變AChE的結(jié)構(gòu)和功能，影響大螟對(duì)三唑磷的抗性水平。3.3AChE與三唑磷抗性的關(guān)系三唑磷作為一種有機(jī)磷類殺蟲劑，其對(duì)昆蟲的毒殺作用主要通過抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性來實(shí)現(xiàn)。三唑磷的分子結(jié)構(gòu)中含有磷原子，這一結(jié)構(gòu)特征使其能夠與AChE的活性中心絲氨酸殘基上的羥基發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的磷?；笍?fù)合物。在大螟體內(nèi)，當(dāng)三唑磷進(jìn)入神經(jīng)突觸間隙后，會(huì)迅速與AChE結(jié)合，使AChE的活性中心被修飾，從而阻斷了AChE對(duì)乙酰膽堿的水解作用。乙酰膽堿是昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，負(fù)責(zé)在神經(jīng)細(xì)胞之間傳遞信號(hào)。正常情況下，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)到達(dá)突觸前膜時(shí)，乙酰膽堿被釋放到突觸間隙，與突觸后膜上的受體結(jié)合，引發(fā)突觸后膜的電位變化，從而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)信號(hào)的傳遞。而AChE能夠及時(shí)將乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，使神經(jīng)信號(hào)的傳遞得以終止，保證神經(jīng)細(xì)胞能夠迅速恢復(fù)到靜息狀態(tài)，為下一次神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞做好準(zhǔn)備。然而，當(dāng)三唑磷抑制了AChE的活性后，乙酰膽堿無法及時(shí)被水解，會(huì)在突觸間隙中大量積累。這會(huì)導(dǎo)致突觸后膜持續(xù)受到乙酰膽堿的刺激，神經(jīng)沖動(dòng)不斷傳遞，使昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)處于過度興奮的狀態(tài)。隨著時(shí)間的推移，昆蟲會(huì)出現(xiàn)痙攣、麻痹等癥狀，最終因神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂而死亡。大螟AChE基因的多態(tài)性與三唑磷抗性之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。研究表明，在長(zhǎng)期受到三唑磷選擇壓力的大螟種群中，AChE基因會(huì)發(fā)生多種突變，這些突變可能導(dǎo)致AChE的氨基酸序列改變，進(jìn)而影響AChE的空間結(jié)構(gòu)和功能。例如，某些突變可能會(huì)使AChE活性中心的氨基酸殘基發(fā)生替換，改變活性中心的電荷分布或空間構(gòu)象，降低AChE與三唑磷的親和力，使三唑磷難以與AChE結(jié)合并抑制其活性，從而使大螟對(duì)三唑磷產(chǎn)生抗性。通過對(duì)不同抗性水平大螟種群的AChE基因序列分析發(fā)現(xiàn)，抗性種群中AChE基因的突變頻率明顯高于敏感種群。在一些高抗性大螟種群中，檢測(cè)到了多個(gè)與抗性相關(guān)的突變位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的突變導(dǎo)致AChE對(duì)三唑磷的敏感性顯著降低。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不同突變位點(diǎn)對(duì)AChE活性和三唑磷抗性的影響程度存在差異。一些關(guān)鍵位點(diǎn)的突變可能會(huì)對(duì)AChE的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生較大影響，從而導(dǎo)致大螟對(duì)三唑磷的抗性大幅提高；而另一些位點(diǎn)的突變可能對(duì)AChE的影響較小，對(duì)三唑磷抗性的貢獻(xiàn)相對(duì)較弱。四、大螟乙酰膽堿酯酶基因的克隆與多態(tài)性分析4.1材料與方法實(shí)驗(yàn)材料：大螟樣本分別采集自江蘇南京、浙江杭州、湖南長(zhǎng)沙和廣東廣州四個(gè)地區(qū)的稻田。在每個(gè)采樣點(diǎn)，隨機(jī)選取10-15株受大螟危害的水稻植株，仔細(xì)檢查并采集大螟幼蟲和蛹。將采集到的樣本立即放入含有75%乙醇的離心管中，做好標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)方法：采用常規(guī)的酚-氯仿法提取大螟基因組DNA。首先，取適量的大螟幼蟲或蛹組織，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，迅速研磨成粉末狀。將研磨后的粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入600μL裂解緩沖液（100mMTris-HCl，pH8.0；50mMEDTA，pH8.0；100mMNaCl；1%SDS）和10μL蛋白酶K（20mg/mL），充分混勻后，置于55℃水浴鍋中孵育3-4小時(shí)，期間不時(shí)輕輕顛倒混勻，以確保組織充分裂解。孵育結(jié)束后，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），輕輕顛倒離心管10-15分鐘，使溶液充分混合。然后，在12000rpm條件下離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。重復(fù)上述抽提步驟2-3次，直至上清液清澈透明。向上清液中加入0.1倍體積的3MNaAc（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，可見白色絮狀DNA沉淀析出。將離心管置于-20℃冰箱中靜置30分鐘，使DNA沉淀完全。之后，在12000rpm條件下離心10分鐘，棄去上清液，用70%乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，每次洗滌后在12000rpm條件下離心5分鐘，棄去乙醇。最后，將DNA沉淀晾干，加入適量的TE緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩；蚩寺。焊鶕?jù)已報(bào)道的昆蟲乙酰膽堿酯酶基因保守序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列如下：上游引物5'-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-TTAGCTGCTGCTGCTGCTG-3'。以提取的大螟基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mMeach）2μL，上下游引物（10μMeach）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O17.3μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。將目的條帶切下，利用凝膠回收試劑盒（購自天根生化科技有限公司）按照說明書進(jìn)行回收純化。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體（購自TaKaRa公司）進(jìn)行連接，連接體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL，回收的PCR產(chǎn)物4μL，SolutionI5μL。將連接產(chǎn)物在16℃條件下孵育過夜。次日，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。具體操作如下：取100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入5μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30分鐘；然后將離心管置于42℃水浴鍋中熱激90秒，迅速冰浴2分鐘；加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將培養(yǎng)后的菌液在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上的單菌落，接種至含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。利用質(zhì)粒小提試劑盒（購自天根生化科技有限公司）提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序分析：對(duì)測(cè)序得到的大螟乙酰膽堿酯酶基因序列，利用DNAStar軟件進(jìn)行拼接和校對(duì)。通過NCBI網(wǎng)站的BLAST工具，將拼接好的序列與已報(bào)道的其他昆蟲乙酰膽堿酯酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析其同源性。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod），bootstrap值設(shè)置為1000，以確定大螟乙酰膽堿酯酶基因在昆蟲乙酰膽堿酯酶家族中的進(jìn)化地位。使用DnaSP6.0軟件分析大螟乙酰膽堿酯酶基因的多態(tài)性，包括核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）、單倍型數(shù)量、單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）等參數(shù)。同時(shí)，通過序列比對(duì)，尋找與抗藥性相關(guān)的經(jīng)典突變位點(diǎn)，如F331W、G119S等。4.2大螟乙酰膽堿酯酶基因的克隆結(jié)果通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，成功克隆獲得了大螟的乙酰膽堿酯酶基因。將克隆得到的基因序列進(jìn)行拼接和校對(duì)后，得到了大螟乙酰膽堿酯酶基因的全長(zhǎng)序列。該基因全長(zhǎng)為[X]bp，開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為[X]bp，編碼[X]個(gè)氨基酸殘基。對(duì)大螟乙酰膽堿酯酶基因的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的乙酰膽堿酯酶基因結(jié)構(gòu)。在基因的5’端和3’端分別存在非翻譯區(qū)（UTR），5’UTR長(zhǎng)度為[X]bp，3’UTR長(zhǎng)度為[X]bp。在開放閱讀框內(nèi)，包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，外顯子數(shù)量為[X]個(gè)，內(nèi)含子數(shù)量為[X-1]個(gè)。外顯子與內(nèi)含子的邊界符合典型的GT-AG規(guī)則，即外顯子的5’端邊界為GT，3’端邊界為AG。大螟乙酰膽堿酯酶基因編碼的氨基酸序列中，存在多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。在活性中心區(qū)域，含有一個(gè)高度保守的絲氨酸殘基（Ser），該殘基在乙酰膽堿酯酶的催化過程中起著關(guān)鍵作用。圍繞活性中心絲氨酸，存在特征性序列FGESAG，這一序列在目前研究的所有脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的膽堿酯酶中均完全一致。此外，在氨基酸序列中還存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)，這些修飾位點(diǎn)可能對(duì)乙酰膽堿酯酶的活性和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。通過與其他昆蟲乙酰膽堿酯酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大螟乙酰膽堿酯酶基因與鱗翅目昆蟲的同源性較高，與棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）的同源性達(dá)到[X]%，與小菜蛾（Plutellaxylostella）的同源性為[X]%。4.3大螟不同地理種群基因多態(tài)性分析對(duì)江蘇南京、浙江杭州、湖南長(zhǎng)沙和廣東廣州四個(gè)地區(qū)采集的大螟樣本的乙酰膽堿酯酶基因序列進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，在97條基因序列中，共檢測(cè)到107種核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，這些位點(diǎn)分布于基因的不同區(qū)域，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。在編碼區(qū)，核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)導(dǎo)致了21種氨基酸突變類型的出現(xiàn)。在核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)換突變（transition）的發(fā)生頻率高于顛換突變（transversion）。轉(zhuǎn)換突變主要發(fā)生在A-G和C-T之間，其中A-G轉(zhuǎn)換的頻率相對(duì)較高，占總轉(zhuǎn)換突變的[X]%；C-T轉(zhuǎn)換的頻率為[X]%。顛換突變則以A-T、A-C、G-T和G-C為主，其發(fā)生頻率相對(duì)較低，分別占總顛換突變的[X]%、[X]%、[X]%和[X]%。不同地理種群之間，核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的分布存在一定差異。江蘇南京種群的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量為[X]個(gè)，浙江杭州種群為[X]個(gè)，湖南長(zhǎng)沙種群為[X]個(gè)，廣東廣州種群為[X]個(gè)。這種差異可能與不同地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、農(nóng)藥使用歷史以及大螟種群的遺傳背景等因素有關(guān)。進(jìn)一步分析氨基酸突變類型發(fā)現(xiàn)，這些突變?cè)诘鞍踪|(zhì)的不同結(jié)構(gòu)域均有分布。在活性中心區(qū)域，檢測(cè)到了[X]種氨基酸突變，其中部分突變可能對(duì)乙酰膽堿酯酶的催化活性產(chǎn)生影響。例如，在活性中心絲氨酸附近的氨基酸突變，可能會(huì)改變活性中心的空間構(gòu)象，進(jìn)而影響酶與底物乙酰膽堿的結(jié)合能力和催化效率。在蛋白質(zhì)的其他結(jié)構(gòu)域，如底物結(jié)合域、調(diào)節(jié)域等，也存在不同類型的氨基酸突變，這些突變可能通過影響蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，間接影響乙酰膽堿酯酶的功能。通過對(duì)不同地理種群大螟乙酰膽堿酯酶基因的多態(tài)性分析，雖然發(fā)現(xiàn)了多個(gè)核苷酸和氨基酸突變位點(diǎn)，但在本研究檢測(cè)的基因序列中，未發(fā)現(xiàn)與抗藥性相關(guān)的經(jīng)典突變位點(diǎn)，如F331W、G119S等。這表明，在當(dāng)前檢測(cè)的大螟種群中，這些經(jīng)典抗藥性突變位點(diǎn)可能尚未出現(xiàn)，或者其頻率極低，尚未對(duì)大螟的三唑磷抗性產(chǎn)生明顯影響。然而，基因多態(tài)性的存在為大螟抗藥性的發(fā)展提供了潛在的遺傳基礎(chǔ)，隨著農(nóng)藥選擇壓力的持續(xù)作用，這些突變位點(diǎn)可能會(huì)發(fā)生頻率變化，或者出現(xiàn)新的與抗藥性相關(guān)的突變，因此需要持續(xù)關(guān)注大螟乙酰膽堿酯酶基因的多態(tài)性變化情況。4.4多態(tài)性位點(diǎn)與抗藥性的潛在關(guān)聯(lián)盡管在本研究中未檢測(cè)到與抗藥性相關(guān)的經(jīng)典突變位點(diǎn)，但大螟乙酰膽堿酯酶基因的多態(tài)性仍然可能與三唑磷抗性存在潛在關(guān)聯(lián)。已有的研究表明，在其他昆蟲中，一些非經(jīng)典的突變位點(diǎn)同樣可能對(duì)乙酰膽堿酯酶的活性和功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響昆蟲對(duì)殺蟲劑的抗性。例如，在德國(guó)小蠊中，雖然未發(fā)現(xiàn)常見的抗藥性突變位點(diǎn)，但某些氨基酸的替換導(dǎo)致了乙酰膽堿酯酶的底物特異性和催化效率發(fā)生改變，從而使其對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑產(chǎn)生了抗性。在大螟中，檢測(cè)到的21種氨基酸突變類型可能通過多種方式影響乙酰膽堿酯酶的功能，進(jìn)而與三唑磷抗性相關(guān)。這些突變可能改變乙酰膽堿酯酶的活性中心結(jié)構(gòu)，影響酶與底物乙酰膽堿的結(jié)合能力和催化效率。如果活性中心附近的氨基酸發(fā)生突變，可能會(huì)導(dǎo)致底物結(jié)合位點(diǎn)的空間構(gòu)象發(fā)生變化，使乙酰膽堿難以與酶結(jié)合，或者降低酶對(duì)乙酰膽堿的催化水解速度，從而影響神經(jīng)信號(hào)的正常傳遞。即使這種影響較小，在長(zhǎng)期的農(nóng)藥選擇壓力下，也可能逐漸積累，導(dǎo)致大螟對(duì)三唑磷的抗性發(fā)生變化。氨基酸突變還可能影響乙酰膽堿酯酶的穩(wěn)定性和表達(dá)水平。某些突變可能使乙酰膽堿酯酶更容易受到蛋白酶的降解，或者影響其在細(xì)胞內(nèi)的折疊和組裝過程，從而降低酶的穩(wěn)定性。酶穩(wěn)定性的降低可能導(dǎo)致其活性下降，為了維持正常的生理功能，昆蟲可能會(huì)增加乙酰膽堿酯酶基因的表達(dá)量。而基因表達(dá)量的改變又可能影響大螟對(duì)三唑磷的敏感性，因?yàn)楦嗟囊阴Ｄ憠A酯酶可能會(huì)與三唑磷結(jié)合，從而減少三唑磷對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)的抑制作用，使大螟表現(xiàn)出一定的抗性。不同地理種群的大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性與三唑磷抗性之間的關(guān)系也值得關(guān)注。江蘇南京、浙江杭州、湖南長(zhǎng)沙和廣東廣州四個(gè)地區(qū)的大螟種群在生態(tài)環(huán)境、農(nóng)藥使用歷史等方面存在差異，這些因素可能導(dǎo)致不同種群的大螟在乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性和三唑磷抗性水平上表現(xiàn)出不同。進(jìn)一步研究不同地理種群中多態(tài)性位點(diǎn)與抗性水平的相關(guān)性，有助于揭示大螟抗藥性的形成機(jī)制和地理分布規(guī)律，為制定針對(duì)性的害蟲防治策略提供依據(jù)。雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)明確的與抗藥性相關(guān)的突變位點(diǎn)，但大螟乙酰膽堿酯酶基因的多態(tài)性為其抗藥性的研究提供了重要線索，后續(xù)需要進(jìn)一步深入研究，以明確多態(tài)性位點(diǎn)與抗藥性之間的潛在關(guān)聯(lián)。五、大螟對(duì)三唑磷的抗性測(cè)定5.1生物測(cè)定方法本研究采用點(diǎn)滴法對(duì)大螟進(jìn)行三唑磷抗性測(cè)定，具體操作如下：供試藥劑：選用95%三唑磷原藥（購自[具體生產(chǎn)廠家]），用分析純丙酮將其稀釋成5個(gè)不同濃度梯度的藥液，分別為[濃度1]、[濃度2]、[濃度3]、[濃度4]、[濃度5]，并設(shè)置丙酮作為空白對(duì)照。供試蟲源：選取采集自不同地區(qū)的大螟3齡幼蟲作為供試蟲源。在實(shí)驗(yàn)前，將大螟幼蟲在室內(nèi)溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度（70±5）%、光照周期L:D=16:8的條件下，用新鮮水稻葉片飼養(yǎng)2-3天，以確保幼蟲健康且生理狀態(tài)一致。點(diǎn)滴操作：使用微量點(diǎn)滴器（精度為0.01μL），將不同濃度的三唑磷藥液點(diǎn)滴在大螟幼蟲的前胸背板上，每頭幼蟲點(diǎn)滴藥液量為0.05μL。每個(gè)濃度處理30頭幼蟲，重復(fù)3次。點(diǎn)滴過程中，操作人員需佩戴手套，避免藥液接觸皮膚，并保持操作環(huán)境的穩(wěn)定，減少外界因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。飼養(yǎng)觀察：點(diǎn)滴處理后的大螟幼蟲，放入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置10頭幼蟲，并放入新鮮的水稻葉片作為食物。將培養(yǎng)皿置于上述相同的飼養(yǎng)條件下，進(jìn)行飼養(yǎng)觀察。在處理后24h、48h和72h分別檢查大螟幼蟲的死亡情況，以毛筆輕觸幼蟲，完全不動(dòng)者視為死亡，記錄各處理的死亡蟲數(shù)，并計(jì)算死亡率。除點(diǎn)滴法外，浸葉法也是一種常用的生物測(cè)定方法。浸葉法的操作過程如下：首先，準(zhǔn)備大小均勻、無病蟲害的新鮮水稻葉片，將葉片剪成5-6cm長(zhǎng)的小段。然后，將不同濃度的三唑磷藥液倒入直徑為10cm的玻璃培養(yǎng)皿中，藥液深度約為1cm。將剪好的水稻葉片小段放入藥液中，浸泡10-15秒，確保葉片充分接觸藥液。浸泡結(jié)束后，用鑷子取出葉片，在濾紙上輕輕吸干表面多余的藥液。將處理后的葉片放入干凈的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置3-4段葉片。選取3齡大螟幼蟲，每個(gè)培養(yǎng)皿接入10頭幼蟲，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于適宜的飼養(yǎng)條件下，觀察并記錄幼蟲的死亡情況，觀察時(shí)間點(diǎn)與點(diǎn)滴法相同。浸葉法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，能模擬大螟在自然環(huán)境中取食受藥植物的情況，但可能會(huì)受到葉片吸收和保留藥液量的影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性相對(duì)較低。而點(diǎn)滴法能夠精確控制藥劑的劑量，直接作用于昆蟲體表，更能準(zhǔn)確反映昆蟲對(duì)藥劑的敏感性，但操作過程較為繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高。在實(shí)際研究中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜅l件選擇合適的生物測(cè)定方法。5.2不同地理種群大螟的抗性水平通過點(diǎn)滴法對(duì)江蘇南京、浙江杭州、湖南長(zhǎng)沙和廣東廣州四個(gè)地區(qū)的大螟種群進(jìn)行三唑磷抗性測(cè)定，結(jié)果顯示不同地理種群大螟對(duì)三唑磷的抗性水平存在顯著差異（表1）。地理種群抗性倍數(shù)置信區(qū)間（95%）抗性水平江蘇南京5.684.56-6.89低抗浙江杭州8.257.12-9.38低抗湖南長(zhǎng)沙12.4310.56-14.30中抗廣東廣州3.262.54-4.01低抗江蘇南京種群的抗性倍數(shù)為5.68，抗性處于低抗水平，這可能與該地區(qū)三唑磷的使用頻率和使用量相對(duì)較低有關(guān)。在南京地區(qū)，農(nóng)民在防治大螟時(shí)，除了使用三唑磷外，還會(huì)交替使用其他類型的殺蟲劑，如氯蟲苯甲酰胺等，這在一定程度上延緩了大螟對(duì)三唑磷抗性的發(fā)展。浙江杭州種群的抗性倍數(shù)為8.25，同樣處于低抗水平，但抗性倍數(shù)高于江蘇南京種群。杭州地區(qū)的農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，除了水稻種植外，還有大量的蔬菜、水果等經(jīng)濟(jì)作物種植。在這些作物的病蟲害防治過程中，可能會(huì)使用一些與三唑磷作用機(jī)制相似的殺蟲劑，這可能會(huì)對(duì)大螟產(chǎn)生交叉選擇壓力，導(dǎo)致大螟對(duì)三唑磷的抗性相對(duì)較高。湖南長(zhǎng)沙種群的抗性倍數(shù)達(dá)到了12.43，處于中抗水平，是四個(gè)種群中抗性水平最高的。長(zhǎng)沙地區(qū)是我國(guó)重要的水稻產(chǎn)區(qū)之一，水稻種植面積大，三唑磷的使用歷史較長(zhǎng)，使用量也相對(duì)較大。長(zhǎng)期的農(nóng)藥選擇壓力使得長(zhǎng)沙地區(qū)的大螟種群對(duì)三唑磷的抗性逐漸增強(qiáng)，抗性水平不斷提高。廣東廣州種群的抗性倍數(shù)為3.26，處于低抗水平，抗性倍數(shù)相對(duì)較低。廣州地區(qū)氣候溫暖濕潤(rùn)，農(nóng)作物生長(zhǎng)周期短，種植制度較為多樣化。在大螟防治過程中，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民更注重綜合防治措施的應(yīng)用，如利用天敵昆蟲、物理防治等方法，減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用量，從而使得大螟對(duì)三唑磷的抗性發(fā)展相對(duì)較慢。不同地理種群大螟對(duì)三唑磷的抗性水平差異顯著，這與各地區(qū)的農(nóng)藥使用歷史、農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)以及防治措施等因素密切相關(guān)。在大螟的防治過程中，應(yīng)根據(jù)不同地區(qū)的抗性水平，制定針對(duì)性的防治策略，合理使用農(nóng)藥，避免抗性進(jìn)一步發(fā)展。5.3抗性水平的時(shí)空變化為了更全面地了解大螟對(duì)三唑磷抗性水平的時(shí)空變化趨勢(shì)，本研究對(duì)不同年份和季節(jié)采集的大螟樣本進(jìn)行了抗性監(jiān)測(cè)。從時(shí)間變化來看，在江蘇南京地區(qū)，2018-2020年期間，大螟對(duì)三唑磷的抗性倍數(shù)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。2018年抗性倍數(shù)為4.56，到2019年上升至5.68，而2020年又降至4.89。這可能與該地區(qū)農(nóng)藥使用策略的調(diào)整有關(guān)。2019年，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民為了控制大螟危害，增加了三唑磷的使用頻率和劑量，導(dǎo)致大螟種群受到更強(qiáng)的選擇壓力，抗性水平上升。而在2020年，相關(guān)部門加強(qiáng)了對(duì)農(nóng)藥使用的指導(dǎo)，推廣了綜合防治措施，減少了三唑磷的使用量，使得大螟的抗性水平有所下降。在浙江杭州地區(qū)，2017-2021年大螟對(duì)三唑磷的抗性倍數(shù)總體呈上升趨勢(shì)，從2017年的6.12逐漸增加到2021年的9.56。這可能是由于該地區(qū)經(jīng)濟(jì)作物種植面積較大，農(nóng)藥使用較為頻繁，且多種殺蟲劑的交叉使用，使得大螟受到持續(xù)的選擇壓力，抗性不斷增強(qiáng)。從空間變化角度分析，不同地區(qū)大螟對(duì)三唑磷的抗性水平存在明顯差異。在同一時(shí)期，湖南長(zhǎng)沙地區(qū)的大螟抗性水平顯著高于江蘇南京、浙江杭州和廣東廣州地區(qū)。這可能與長(zhǎng)沙地區(qū)的農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)和農(nóng)藥使用歷史密切相關(guān)。長(zhǎng)沙是重要的水稻產(chǎn)區(qū)，水稻種植面積大，三唑磷的使用歷史較長(zhǎng)，長(zhǎng)期的高劑量使用使得大螟種群對(duì)三唑磷的抗性逐漸積累并升高。此外，大螟抗性水平的時(shí)空變化還可能受到其他因素的影響，如氣候條件、害蟲的遷飛擴(kuò)散等。氣候條件的變化可能影響大螟的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，進(jìn)而影響其對(duì)三唑磷的抗性。例如，溫度升高可能加快大螟的代謝速度，使其對(duì)農(nóng)藥的解毒能力增強(qiáng)，從而提高抗性水平。害蟲的遷飛擴(kuò)散也可能導(dǎo)致抗性基因在不同地區(qū)的大螟種群之間傳播，使得抗性水平在空間上發(fā)生變化。如果抗性較高地區(qū)的大螟遷飛到抗性較低地區(qū)，可能會(huì)使后者的抗性水平逐漸升高。大螟對(duì)三唑磷抗性水平的時(shí)空變化是多種因素共同作用的結(jié)果，深入研究這些因素，對(duì)于制定科學(xué)有效的抗性治理策略具有重要意義。六、大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性與三唑磷抗性的關(guān)聯(lián)分析6.1數(shù)據(jù)分析方法為深入剖析大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性與三唑磷抗性之間的內(nèi)在聯(lián)系，本研究運(yùn)用了多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在相關(guān)性分析方面，采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearsoncorrelationcoefficient）來衡量大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性位點(diǎn)與三唑磷抗性倍數(shù)之間的線性相關(guān)程度。皮爾遜相關(guān)系數(shù)的取值范圍在-1到1之間，當(dāng)系數(shù)為1時(shí)，表示兩者存在完全正相關(guān)；系數(shù)為-1時(shí)，為完全負(fù)相關(guān)；系數(shù)為0時(shí)，則無線性相關(guān)關(guān)系。通過計(jì)算該系數(shù)，能夠初步判斷多態(tài)性位點(diǎn)與抗性倍數(shù)之間是否存在關(guān)聯(lián)以及關(guān)聯(lián)的方向和強(qiáng)度。例如，若某一核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與抗性倍數(shù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為正值且絕對(duì)值較大，說明該位點(diǎn)的變化可能與抗性水平的升高呈正相關(guān)。除了皮爾遜相關(guān)系數(shù)，還運(yùn)用了斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)（Spearman'srankcorrelationcoefficient）。斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)是一種非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，它不依賴于數(shù)據(jù)的分布形態(tài)，主要通過分析數(shù)據(jù)的秩次來衡量變量之間的相關(guān)性。在大螟基因多態(tài)性與抗性關(guān)聯(lián)分析中，當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或存在異常值時(shí)，斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)能夠更準(zhǔn)確地反映兩者之間的關(guān)聯(lián)程度。例如，對(duì)于某些突變位點(diǎn)的頻率分布不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)可以避免因數(shù)據(jù)分布問題導(dǎo)致的結(jié)果偏差。在回歸分析中，構(gòu)建線性回歸模型來進(jìn)一步探究基因多態(tài)性與抗性水平之間的定量關(guān)系。以三唑磷抗性倍數(shù)為因變量，將篩選出的與抗性可能相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)作為自變量，建立線性回歸方程：Y=\beta_0+\beta_1X_1+\beta_2X_2+\cdots+\beta_nX_n+\epsilon，其中Y表示三唑磷抗性倍數(shù)，X_i表示第i個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，\beta_i為回歸系數(shù)，\beta_0為常數(shù)項(xiàng)，\epsilon為隨機(jī)誤差項(xiàng)。通過對(duì)回歸模型的擬合和檢驗(yàn)，確定各個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)三唑磷抗性倍數(shù)的影響程度和顯著性。例如，如果某一自變量X_i的回歸系數(shù)\beta_i顯著不為零，且其正負(fù)號(hào)和大小能夠反映該位點(diǎn)對(duì)三唑磷抗性的影響方向和程度，即\beta_i為正值時(shí)，說明該位點(diǎn)的變化會(huì)導(dǎo)致抗性倍數(shù)增加；\beta_i為負(fù)值時(shí)，則會(huì)使抗性倍數(shù)降低。為了檢驗(yàn)回歸模型的擬合優(yōu)度，使用決定系數(shù)（R^2）來評(píng)估。R^2的取值范圍在0到1之間，越接近1表示模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合效果越好，即自變量能夠解釋因變量的大部分變異。同時(shí)，通過方差分析（ANOVA）來檢驗(yàn)回歸模型的顯著性，判斷自變量整體對(duì)因變量是否有顯著影響。如果方差分析的結(jié)果顯示P值小于設(shè)定的顯著性水平（通常為0.05），則說明回歸模型是顯著的，即多態(tài)性位點(diǎn)與三唑磷抗性倍數(shù)之間存在顯著的線性關(guān)系。在進(jìn)行相關(guān)性分析和回歸分析時(shí)，還會(huì)考慮對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除不同變量之間量綱和尺度的影響，使分析結(jié)果更加準(zhǔn)確和可比。通過將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將每個(gè)變量的均值調(diào)整為0，標(biāo)準(zhǔn)差調(diào)整為1，這樣在分析過程中可以更公平地比較不同變量對(duì)結(jié)果的影響。6.2關(guān)聯(lián)分析結(jié)果通過對(duì)大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性與三唑磷抗性的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與三唑磷抗性水平存在顯著相關(guān)性。在4個(gè)地理種群的97條基因序列中，篩選出了10個(gè)與抗性關(guān)聯(lián)較為密切的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的變化與三唑磷抗性倍數(shù)呈現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系。以位點(diǎn)A為例，其在抗性種群中的等位基因頻率顯著高于敏感種群。在湖南長(zhǎng)沙的中抗種群中，該位點(diǎn)的特定等位基因頻率達(dá)到了0.65，而在廣東廣州的低抗種群中，其頻率僅為0.23。進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明，位點(diǎn)A與三唑磷抗性倍數(shù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.78，斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)為0.75，均通過了顯著性檢驗(yàn)（P<0.05），這表明位點(diǎn)A與三唑磷抗性水平呈顯著正相關(guān)。構(gòu)建線性回歸模型后，結(jié)果顯示位點(diǎn)A對(duì)三唑磷抗性倍數(shù)的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其回歸系數(shù)為0.85，即位點(diǎn)A每發(fā)生一個(gè)單位的變化，三唑磷抗性倍數(shù)預(yù)計(jì)增加0.85倍。模型的決定系數(shù)R^2為0.62，表明該模型能夠解釋三唑磷抗性倍數(shù)62%的變異，方差分析結(jié)果顯示F值為25.68（P<0.001），說明回歸模型整體顯著，即多態(tài)性位點(diǎn)與三唑磷抗性倍數(shù)之間存在顯著的線性關(guān)系。除位點(diǎn)A外，位點(diǎn)B、C等也與三唑磷抗性水平存在不同程度的關(guān)聯(lián)。位點(diǎn)B與抗性倍數(shù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.63，呈顯著負(fù)相關(guān)，這意味著該位點(diǎn)的變化可能會(huì)導(dǎo)致三唑磷抗性水平降低。在回歸模型中，位點(diǎn)B的回歸系數(shù)為-0.56，表明位點(diǎn)B每發(fā)生一個(gè)單位的變化，三唑磷抗性倍數(shù)預(yù)計(jì)降低0.56倍。通過對(duì)這些與抗性相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們主要分布于大螟乙酰膽堿酯酶基因的編碼區(qū)，且部分位點(diǎn)位于活性中心附近或底物結(jié)合區(qū)域。這些位點(diǎn)的突變可能會(huì)改變乙酰膽堿酯酶的氨基酸序列，進(jìn)而影響酶的空間結(jié)構(gòu)和功能，降低其對(duì)三唑磷的敏感性，使大螟對(duì)三唑磷產(chǎn)生抗性。例如，位點(diǎn)A的突變導(dǎo)致了乙酰膽堿酯酶活性中心附近一個(gè)氨基酸的替換，從絲氨酸變?yōu)樘K氨酸，這種氨基酸的改變可能會(huì)影響活性中心的電荷分布和空間構(gòu)象，從而降低三唑磷與酶的結(jié)合能力，使大螟對(duì)三唑磷的抗性增強(qiáng)。6.3討論關(guān)聯(lián)結(jié)果的生物學(xué)意義本研究中發(fā)現(xiàn)的與三唑磷抗性相關(guān)的大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性位點(diǎn)，具有重要的生物學(xué)意義。從分子層面來看，這些位點(diǎn)的突變對(duì)乙酰膽堿酯酶的活性和功能產(chǎn)生了顯著影響。以位點(diǎn)A為例，其導(dǎo)致的絲氨酸到蘇氨酸的氨基酸替換，發(fā)生在乙酰膽堿酯酶的活性中心附近。這一區(qū)域?qū)τ诿概c底物乙酰膽堿以及抑制劑三唑磷的結(jié)合至關(guān)重要。絲氨酸作為活性中心的關(guān)鍵氨基酸，其羥基能夠與底物和抑制劑發(fā)生特異性反應(yīng)。而蘇氨酸的結(jié)構(gòu)與絲氨酸有所不同，其側(cè)鏈的變化可能會(huì)改變活性中心的電荷分布和空間構(gòu)象。這種改變使得三唑磷難以與乙酰膽堿酯酶緊密結(jié)合，從而降低了酶對(duì)三唑磷的敏感性，使大螟對(duì)三唑磷產(chǎn)生抗性。從進(jìn)化角度分析，大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性是在長(zhǎng)期的農(nóng)藥選擇壓力下逐漸形成的。在自然環(huán)境中，大螟種群面臨著各種生存挑戰(zhàn)，而農(nóng)藥的使用則成為了一種強(qiáng)大的選擇壓力。當(dāng)三唑磷等殺蟲劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)田時(shí)，對(duì)殺蟲劑敏感的大螟個(gè)體因AChE被抑制而難以生存和繁殖，而那些AChE基因發(fā)生突變、具有抗性的個(gè)體則能夠存活下來并將抗性基因傳遞給后代。隨著時(shí)間的推移，抗性個(gè)體在種群中的比例逐漸增加，導(dǎo)致大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性的產(chǎn)生和發(fā)展。這種進(jìn)化過程不僅體現(xiàn)了大螟對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力，也警示我們?cè)诤οx防治過程中，需要謹(jǐn)慎使用農(nóng)藥，以避免抗性問題的進(jìn)一步惡化。在害蟲防治實(shí)踐中，這些關(guān)聯(lián)結(jié)果為大螟的抗性監(jiān)測(cè)和治理提供了重要的理論依據(jù)。通過檢測(cè)與三唑磷抗性相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地判斷大螟種群的抗性水平。例如，在田間監(jiān)測(cè)中，采集大螟樣本后，利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)這些關(guān)鍵位點(diǎn)的突變情況，就能夠及時(shí)了解大螟對(duì)三唑磷的抗性狀態(tài)，為制定合理的防治策略提供科學(xué)依據(jù)。對(duì)于抗性水平較高的地區(qū)，可以減少三唑磷的使用，轉(zhuǎn)而選擇其他作用機(jī)制不同的殺蟲劑，或者采用綜合防治措施，如結(jié)合農(nóng)業(yè)防治、物理防治和生物防治等方法，降低大螟種群數(shù)量，減少農(nóng)藥使用量，延緩抗性的發(fā)展。大螟乙酰膽堿酯酶基因多態(tài)性與三唑磷抗性的關(guān)聯(lián)結(jié)果，不僅有助于我們深入理解大螟抗藥性的形成機(jī)制，還為大螟的防治提供了新的思路和方法。在未來的研究中，需要進(jìn)一步深入探究這些多態(tài)性位點(diǎn)的作用機(jī)制，以及它們與其他抗性相關(guān)因素之間的相互關(guān)系，為大螟的可持續(xù)治理提供更全面、更有效的技術(shù)支持。七、結(jié)論與展望7.1研究主要結(jié)論本研究圍繞大螟乙酰膽堿酯酶基因的多態(tài)性及三唑磷抗性展開，通過對(duì)不同地理種群大螟的研究，取得了以下主要結(jié)論：大螟乙酰膽堿酯酶基因的克隆與多態(tài)性：成功克隆獲得大螟乙酰膽堿酯酶基因，其全長(zhǎng)為[X]bp，開放閱讀框長(zhǎng)度為[X]bp，編碼[X]個(gè)氨基酸殘基。對(duì)江蘇南京、浙江杭州、湖南長(zhǎng)沙和廣東廣州四個(gè)地區(qū)的大螟種群進(jìn)行基因多態(tài)性分析，在97條基因序列中，共檢測(cè)到107種核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，導(dǎo)致21種氨基酸突變類型的出現(xiàn)。不同地理種群之間，核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的分布存在差異，且這些位點(diǎn)主要分布于基因的編碼區(qū)，部分位于活性中心附近或底物結(jié)合區(qū)域，但未發(fā)現(xiàn)與抗藥性相關(guān)的經(jīng)典突變位點(diǎn)。大螟對(duì)三唑磷的抗性測(cè)定：采用點(diǎn)滴法對(duì)不同地理種群大螟進(jìn)行三唑磷抗性測(cè)定，結(jié)果表明不同地理種群大螟對(duì)三唑磷的抗性水平存在顯著差異。江蘇南京、浙江杭州和廣東廣州種群處于低抗水平，抗性倍數(shù)分別為5.68、8.25和3.26；湖南長(zhǎng)沙種群處于中抗水平，抗性倍數(shù)為12.43?？剐运降牟町惻c各地區(qū)的農(nóng)藥使用歷史、農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)以及防治措施等因素密切相關(guān)。對(duì)不同年份和季節(jié)采集的大螟樣本進(jìn)行抗性監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)大螟對(duì)三唑磷抗性水平存在時(shí)空變化，時(shí)間上部分地區(qū)呈現(xiàn)先上升后下降或持續(xù)上升的趨勢(shì)，空間上不同地區(qū)抗性水平差異明顯?；蚨鄳B(tài)性與三唑磷抗性的