DB21T 1861.4-2010 水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程 簡(jiǎn)單重復(fù)序列擴(kuò)增法.doc

ICS67.120.30B50DB21遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 21/ T1861.42010水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程 簡(jiǎn)單 重復(fù)序列擴(kuò)增法 Simple sequence repeat procedure to detect germplasm for aquaculture species2010 - 12 - 31發(fā)布2011 - 02 - 01實(shí)施遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB21/ T1861.42010前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院提出。本標(biāo)準(zhǔn)歸口單位：遼寧省海洋與漁業(yè)廳。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：赫崇波、李宏俊、高祥剛、劉衛(wèi)東、李云峰、鮑相渤。附錄A為資料性附錄。11水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程 簡(jiǎn)單重復(fù)序列擴(kuò)增法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)生物簡(jiǎn)單重復(fù)序列擴(kuò)增法的術(shù)語(yǔ)定義、原理、試劑、儀器、取樣、DNA提取、微衛(wèi)星引物篩選、PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)產(chǎn)物、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)分析評(píng)價(jià)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)生物種質(zhì)檢測(cè)與鑒定等方面的種質(zhì)檢驗(yàn)工作。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 18654.15-2008 養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn) 第15部分 RAPD分析3 術(shù)語(yǔ)定義下列術(shù)語(yǔ)定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR) 又稱為微衛(wèi)星，一般指基因組中由短的重復(fù)單元(一般為16個(gè)堿基)組成的DNA串聯(lián)重復(fù)序列。3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)一種分子生物學(xué)技術(shù)，指用一對(duì)寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸為原料，在合適的溫度、離子條件和耐熱 DNA聚合酶催化下，在體外人工合成特異的DNA片段的過(guò)程，用于放大特定的DNA片段。3.3 脫氧核苷酸 (DNA) 脫氧核苷的磷酸酯。如5-脫氧腺苷酸(5-dAMP)、5-脫氧鳥苷酸(5-dGMP)、5-脫氧胞苷酸(5-dCMT)和5-脫氧胸腺苷酸(5-dTMP)，體內(nèi)常為5-磷酸酯。3.4 等位基因（allele）基因的一種變異體，在二倍體細(xì)胞內(nèi)每個(gè)基因有兩個(gè)等位基因，每個(gè)等位基因分別來(lái)自于各自的親本。在一個(gè)群體中一個(gè)基因可能有許多等位基因。3.5 基因型（genotype） 指特定座位的等位基因組成。3.6 座位（locus） 染色體上的位點(diǎn)。3.7 等位基因頻率（allele frequency）給定座位上某等位基因所占的比例。3.8 遺傳雜合度（heterozygosity） 表示群體在某個(gè)座位為雜合子的比例，用于衡量標(biāo)記方式的信息含量程度。3.9 平均遺傳雜合度（average heterozygosity） 表示群體平均在各座位為雜合子的比例，用于衡量標(biāo)記方式的信息含量程度。3.10 多態(tài)信息含量（PIC）在連鎖分析中一個(gè)遺傳標(biāo)記多態(tài)性可提供的信息量的度量。它是一個(gè)親本為雜合子，另一親本為不同基因型的概率?，F(xiàn)常用來(lái)衡量座位多態(tài)性高低的程度。3.11 遺傳距離（genetic distance）用基因頻率的函數(shù)表示的群體間遺傳差異，它的最適宜的測(cè)度是單位長(zhǎng)度DNA的核苷酸數(shù)或密碼子的差數(shù)，是用來(lái)表示群體或個(gè)體之間遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近的一個(gè)量化指標(biāo)，其值可以從0至無(wú)限大。群體或個(gè)體間的遺傳距離越小，它們之間的親緣關(guān)系越近，反之群體或個(gè)體間的遺傳距離越大，那么它們之間的親緣關(guān)系將越遠(yuǎn)。遺傳距離的計(jì)算方法有多種。3.12 Nei氏遺傳距離（Neis genetic distance）Nei 提出的從大量基因頻率數(shù)據(jù)估計(jì)每個(gè)座位的平均密碼子差數(shù)的統(tǒng)計(jì)方法。3.13鄰近結(jié)合法聚類分析（Neighbor joining method，NJ）鄰近結(jié)合法聚類分析（neighbor joining，簡(jiǎn)稱NJ）是在系統(tǒng)進(jìn)化分析時(shí)基于某個(gè)基因的序列進(jìn)行分析，通過(guò)堿基的變化和差異計(jì)算相互之間的進(jìn)化關(guān)系的一種計(jì)算方法。4 原理微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)目存在高度差異，但是微衛(wèi)星的側(cè)翼通常都是保守的單一序列，因而可以將微衛(wèi)星側(cè)翼的DNA片段克隆、測(cè)序，然后根據(jù)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物將微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出來(lái)。由于微衛(wèi)星位點(diǎn)重復(fù)單元數(shù)量的變異，不同個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物在長(zhǎng)度上的變化就產(chǎn)生長(zhǎng)度的多態(tài)性，這就是微衛(wèi)星標(biāo)記的原理。5 試劑5.1 裂解液 按附錄A配制5.2 三羥甲基氨基甲烷飽和酚(Tris飽和酚)5.3 三氯甲烷5.4 異戊醇5.5 無(wú)水乙醇5.6 溴化乙錠5.7 10Tris硼酸(10TBE)電泳緩沖液 按附錄A配制5.8 6上樣緩沖液5.9 100 bp DNA 分子量標(biāo)記5.10 冰乙酸5.11 瓊脂糖5.12 核苷酸(RNA)酶5.13 蛋白酶K5.14 丙烯酰胺5.15 甲叉雙丙烯酰胺5.16 過(guò)硫酸銨5.17 硝酸銀（AgNO3）5.18 N, N, N, N四甲基乙二胺（TEMED）5.19 無(wú)水碳酸鈉5.20 Taq DNA聚合酶5.21 分子量標(biāo)準(zhǔn)(markers)5.22 超純水5.23 硝酸5.24 甲醛5.25 乙二胺四乙酸(EDTA)5.26 鹽酸(HCl)儀器6.1 凝膠成像分析系統(tǒng)6.2 PCR儀6.3 低溫高速離心機(jī)6.5 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀6.7 單道可調(diào)移液器6.8 電子天平6.9 水浴恒溫震蕩器6.10 電泳槽6.11 普通離心機(jī)6.12 紫外分光光度計(jì)6.13 超聲波清洗器6.14 超純水器6 取樣7.1 樣品固定7.1.1 型樣品將樣品先用70%乙醇洗1次，再用超純水沖洗2次，-20保存?zhèn)溆谩?.1.2 型樣品從活體中直接采集肌肉或臟器組織， -20冰箱直接凍存。7.1.3 型樣品選取幼嫩藻尖，用毛筆在無(wú)菌海水中充分刷洗，解剖鏡下觀察，確定沒有附生雜藻后，在無(wú)菌蒸餾水中清洗，晾干備用。8 DNA提取8.1 型樣品在200L 離心管中放入14根毛發(fā)，毛囊置于離心管底部，剪去高于離心管部分的毛發(fā)，設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照管；在每個(gè)離心管中加入15L配制好的毛囊裂解液。毛囊裂解液用1PCR緩沖液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，0.01%明膠)，加MgCl2至2mmol/L，蛋白酶K 20mg/L；在PCR儀上設(shè)置一個(gè)單循環(huán)程序：65 30min，95 15min，4 10min；將上一步驟中的離心管放入預(yù)熱好的PCR儀中，運(yùn)行該程序。程序結(jié)束后，將離心管進(jìn)行瞬時(shí)離心，-20保存?zhèn)溆谩?.2 型樣品取-20下凍存的臟器0.2g，置于液氮中研成粉末；加DNA提取液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，75mmol/L NaCl，0.5%SDS，5mmol/L EDTA)。振蕩均勻后，65水浴1h；按GB/T 18654.15-2008的規(guī)定，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；用適當(dāng)50 L TE緩沖液（10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，lmmol/L EDTA）溶解DNA，-20保存。8.3 型樣品取鮮樣品50150mg，剪成小塊放入研缽中，加入液氮，待樣品完全冷凍后，快速、用力研磨至粉末狀；將研缽放入65水浴至樣品粉末剛開始融化，向研缽中加入DNA提取液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，75mmol/L NaCl，0.5SDS，5mmol/L EDTA)及RNA酶、蛋白酶K共400L，用力碾磨30s。收集研磨好的組織勻漿移至1.5mL離心管中，65保溫1560min，按GBT 18654.15-2008的方法，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；水相加入0.1倍體積醋酸鈉 (3mol/L，pH5.2) 和兩倍體積無(wú)水乙醇沉淀；溶于50L TE緩沖液 (10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，lmmol/L EDTA)，置-20保存?zhèn)溆谩?.4 DNA產(chǎn)物測(cè)定8.4.1 DNA純度檢測(cè)吸取13 L提取的DNA，用濃度12瓊脂糖凝膠100V電泳 30 min，檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量。以DNA條帶的分子量及有無(wú)拖尾為標(biāo)準(zhǔn)判斷DNA的質(zhì)量。8.4.2 DNA濃度檢測(cè)（1）紫外吸收定性測(cè)試分別于260 nm波長(zhǎng)和280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值。確定A260A280比值在1.82.0范圍內(nèi)，方可正常進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）紫外吸收定量測(cè)試260nm波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值，根據(jù)公式(1)計(jì)算DNA濃度。DNA濃度(g/mL)=A260(0.020L)稀釋倍數(shù)(1)式中：A260被測(cè)樣品在260nm下的吸光度值 L比色池厚度，單位cm。（3）基因組DNA完成定量測(cè)試后，稀釋到50 ng/L備用。9 微衛(wèi)星引物篩選9.1 微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)9.1.1 根據(jù)已有序列設(shè)計(jì)引物利用GenBank上的已注冊(cè)的物種的微衛(wèi)星序列，參照引物設(shè)計(jì)的原則，用Primer premier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。9.1.2 利用文獻(xiàn)中已公開的引物10 PCR擴(kuò)增10.1 PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體積均為25 mL，按表1配制PCR反應(yīng)體系。表1 微衛(wèi)星標(biāo)記PCR反應(yīng)體系試劑反應(yīng)體系PCR Buffer (10)2.5 mLMgCl2 (25mmol/L)2 mL正向引物 (2pmol/L)0.5 mL反向引物 (2pmol/L)0.5 mLdNTPs (25mmol/L)0.5 mLrTaq (5U/mL)0.2 mLDNA (50ng-100ng)3 mL超純水16.8 mL10.2 PCR反應(yīng)程序按表2設(shè)置程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。表2 微衛(wèi)星標(biāo)記PCR反應(yīng)程序階 段溫 度時(shí) 間194 oC5 min294 oC3060 s5062 oC3060 s72 oC3060 s35個(gè)循環(huán)372 oC10 min44 oC保存11 聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物11.1 聚丙烯酰胺凝膠凝膠的制備11.1.1 制膠裝置的準(zhǔn)備彈簧夾、干膠架、膠板和隔板、手套、鯊魚齒梳子、隔板、燒杯和攪棒。11.1.2 膠板的按置（1）用KOH或乙醇清洗玻板上的污漬（2）用溫的去污劑溶液洗滌玻璃板和間隔片，用自來(lái)水徹底沖洗，再用去離子水洗凈。用乙醇沖洗玻璃板去掉水印，并放于一旁晾干（必須洗凈玻璃板，以確保灌膠時(shí)不會(huì)產(chǎn)生氣泡）。（3）把大塊玻璃板放在空的試管架上，把隔片放在玻璃板的兩邊。（4）再將較小（或帶凹口）的玻璃板在間隔片上放置妥當(dāng)，對(duì)齊隔片。（5）用彈簧夾將三邊夾住，用瓊脂糖膠液封好邊。（6）將梳子放在膠模的敞開端并檢查是否貼切適合，取出梳子將空膠模放在實(shí)驗(yàn)桌上。11.1.3 制膠（1）在桌上放好空膠模。（2）將按附錄A配制的30ml8%凝膠儲(chǔ)存液中加入80 L過(guò)硫酸銨，20 L TEMED，用攪棒混勻溶液（不得有氣泡），將膠模放在架片成45度角，然后用玻棒引流緩緩灌入溶液。緩緩灌入膠模中。（3）立即將鯊魚梳子的平整側(cè)插入凝膠溶液中，梳子兩端插入面應(yīng)等同。（4）平放在實(shí)驗(yàn)桌上，等其聚合完畢后，可立即使用或保存于室溫達(dá)24 h。11.1.4 裝備裝膠（1）慢慢地從凝膠上移走梳子和彈簧夾以及底部的隔片，將膠板裝到電泳槽上，用彈簧夾夾緊膠模。（2）用合適緩沖液把電泳槽的上下槽加滿，用注射器沖洗膠的頂部。（3）將電極與電泳裝置相連，在150170V的恒定電壓下預(yù)電泳20min。11.2 點(diǎn)樣11.2.1 吸取5L擴(kuò)增產(chǎn)物與5L變性緩沖液混合；11.2.2 放入PCR儀變性：98 oC，8 min，拿出后冰??；11.2.3 切斷電泳槽電源，將已變性的樣品擴(kuò)增產(chǎn)樣和變性緩沖液按1:2混合，用專門的點(diǎn)樣移液器點(diǎn)入凝膠樣品槽中。當(dāng)所有的樣品加完后，在預(yù)留的樣品槽加點(diǎn)入100 bp markers，將電源連接，300V恒壓電泳。11.3 凝膠的分離、標(biāo)識(shí)與固定標(biāo)識(shí)操作規(guī)程11.3.1 關(guān)閉電源開關(guān)當(dāng)指示劑跑到膠板2/3位置時(shí)，結(jié)束電泳。將電源電壓調(diào)至為“O”，接著再關(guān)閉電源開關(guān)，切忌直接關(guān)閉電源開關(guān)，燒壞電泳儀。然后收集電泳緩沖液以備下次重用。11.3.2 凝膠的標(biāo)記將粘著聚丙烯酰胺凝膠的玻璃板小心用邊條沿著玻璃板的耳朵將玻璃板與聚丙烯酰胺凝膠分開，根據(jù)點(diǎn)樣人員記錄的先后順序，將分離的聚丙烯酰胺凝膠先從左上角切除一小塊，接著從左下角切除一小塊。將切除位置的差異作為聚丙烯酰胺凝膠的標(biāo)識(shí)。同時(shí)，將準(zhǔn)備好的托盤編號(hào)分別與電泳槽對(duì)應(yīng)。11.3.3 凝膠的固定當(dāng)聚丙烯酰胺凝膠被標(biāo)識(shí)好后，立即放入存有固定液（10%酒精，體積比）的塑料托盤中，將膠放在搖床上搖動(dòng)20 min或至電泳示蹤染料消失。11.4 硝酸銀染色11.4.1 洗膠 待固定結(jié)束后，用雙蒸水漂洗凝膠23次，目的是洗去凝膠中的尿素分鐘，每次12分鐘，漂洗時(shí)輕輕搖動(dòng)。11.4.2 氧化 向漂洗過(guò)的凝膠中加入2%的硝酸，氧化5 min。11.4.3 漂洗 氧化結(jié)束后，同樣用雙蒸水漂洗一次，時(shí)間2 min。11.4.4 染色 加入染色液緩緩搖動(dòng)30 min。11.4.5 漂洗顯影。用雙蒸水漂洗510 s后，迅速放入準(zhǔn)備好的顯影液中，緩緩搖動(dòng)，直到凝膠上出現(xiàn)條帶。11.4.6 終止顯影。待目的片段出現(xiàn)的時(shí)候，立即從染色液中取出并用雙蒸水沖洗，然后把凝膠放入10%的酒精中，緩緩搖動(dòng)，終止反應(yīng)。再以雙蒸水漂洗2次，每次2 min。11.5 拍照顯影結(jié)束后，利用凝膠成像系統(tǒng)將聚丙烯酰胺凝膠拍照保存。12 數(shù)據(jù)分析12.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 選擇電泳后清晰的擴(kuò)增位點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。根據(jù)片段遷移位置的不同，分別統(tǒng)計(jì)出每個(gè)樣品的基因型（如AA，AB，AC或BB等 ），建立各個(gè)群體的等位基因型數(shù)據(jù)陣列。12.1 結(jié)果分析 利用群體遺傳學(xué)分析軟件專業(yè)（PopGene 1.32版本），按照共顯性二倍體數(shù)據(jù)模型，進(jìn)行等位基因頻率、哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)、遺傳雜合度、遺傳距離、香農(nóng)指數(shù)等遺傳參數(shù)的分析和計(jì)算，并用 UPGMA做基于Neis遺傳距離的樹形圖，以及用鄰近法（Neighbor joining method，NJ）構(gòu)建聚類分析圖（系統(tǒng)樹檢驗(yàn)置信度值為1000次）。附錄A （資料性附錄）試劑配制1 裂解液0.25 mg/mL蛋白酶K為0.02 g，10%的SDS為5 mL，0.5 mol/L DETA(pH=8.0)為20 mL，用超純水定容至100 mL。2 蛋白酶K貯存液（20 mg/mL） 200 mg蛋白酶K溶于10mL滅菌超純水中，分裝，每管1 mL，-20 oC保存。3 TE緩沖液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。4 電泳緩沖液 1Tris-乙酸（TAE）：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.01 mol/L EDTA5 溴化乙錠（EB，10 mg/mL） 用少量超純水融解1 g溴化乙錠，磁力攪拌器攪拌數(shù)小時(shí)確保其完全溶解，定容至100mL，然后轉(zhuǎn)移到棕色瓶或鋁箔包裹容器中，室溫保存。 小心：溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)務(wù)必帶上手套，稱量染料時(shí)要帶口罩。6 6上樣緩沖液 0.12溴酚藍(lán)，0.12二甲苯青FF，40(W/V)蔗糖水溶液 或0.12溴酚藍(lán)，0.12二甲苯青FF，30(W/V)甘油水溶液7 1mol/L Tris（pH8.0）：將121.1 g Tris溶于800mL水中，加濃HCl調(diào)pH值至8.0，定容至1000 mL后高壓滅菌。8 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)：將186.1 g Na2EDTA2H2O加入800mL水中，再加入NaOH(約20 g)調(diào)pH值到8.0，定容至1000 mL，高壓滅菌。9 10SDS(500 mL)：將50 g SDS加入400 mL水中，60 oC加熱融解，定容至500 mL后過(guò)濾滅菌。10 30丙烯酰胺(丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺29：1)：200 mL水