結核病實驗室生物安全與菌株運輸

結核病實驗室生物安全及菌株運輸,內 容,一、結核病實驗室生物安全 二、結核菌株或樣本運輸 三、風險評估,一、結核病實驗室生物安全,結核桿菌的生物學性狀,1、結核桿菌為細長略帶彎曲的桿菌，約1-40.3-0.6m， 常聚集成團，牛型比人型略粗短； 2、分枝桿菌屬的細菌細胞壁脂質含量較高，約占干重的 60%，特別是其中的大量分枝菌酸可影響染料的穿入； 3、一般用萋-尼（Ziehl Neelsen）抗酸性染色法，以5%石炭酸復紅加溫染色后可以染上，但著色后不易被鹽酸酒精脫色；,結核桿菌的生物學性狀,4、若再加用美藍復染，則分枝桿菌呈紅色，而其它細菌及 背景中的物質為藍色； 5、專性需氧，最適溫度為37，低于30或高于42均不 生長；營養(yǎng)要求較高，生長緩慢，初次分離需要營養(yǎng)豐 富的培養(yǎng)基。常用的有Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基，內 含蛋黃、甘油、無機鹽和孔雀綠等。 6、細胞壁的脂質含量較高，影響營養(yǎng)物質吸收，故生長緩 慢，在一般培養(yǎng)基中每分裂一代需要10多個小時，在人 體內需24-36小時；,結核桿菌的生物學性狀,7、一般10-30天可見菌落生長，菌落呈顆粒、結節(jié)或花菜 狀，乳白色或米黃色，不透明； 8、結核桿菌細胞壁中含有大量脂質，可防止菌體水分的丟 失，故對干燥的抵抗力特別強，沾附在塵埃上保持傳染 性8-10天，在干燥痰內可存活6-8個月； 9、結核桿菌對濕熱敏感，在液體中加熱62-63后15分鐘 或煮沸即被殺死；,結核桿菌的生物學性狀,10、結核桿菌對紫外線敏感，直接日光照射數(shù)小時可被殺 死，可用于結核患者衣服、書籍等的消毒； 11、結核桿菌的抵抗力與環(huán)境中有機物的存在有密切關系，如痰液可增強結核桿菌的抵抗力，因大多數(shù)消毒劑可使痰中的蛋白質凝固，包在細菌周圍，使細菌不易被殺死； 12、5%的石炭酸在無痰時30分鐘可殺死結核桿菌，有痰時需要24小時；5%的來蘇兒無痰時5分鐘殺死結核桿菌，有痰時需要1-2小時；,結核桿菌的生物學性狀,13、結核桿菌對酸（3%HCL）或堿（4%NaOH）有抵抗力，15分鐘不受影響，可在分離培養(yǎng)時用于處理有雜菌污染的標本和消化標本中的粘稠物質； 14、結核桿菌對1：75000結晶紫或1：13000孔雀綠有抵抗力，加在培養(yǎng)基中可抑制雜菌生長； 15、結核桿菌對鏈霉素、異煙肼、利福平、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、卡拉霉素、對氨水楊酸等敏感，但長期用藥容易出現(xiàn)耐藥性，而吡嗪酰胺的耐藥性5%。,實驗室安全操作原則,1、實驗室應按等級要求完善實驗設施，如生物安全柜的抽 風排風功能、紫外燈消毒、生物安全柜內的除菌濾膜定 期更換等； 2、普通實驗室應注意氣流方向，實驗過程中盡量避免強氣 流變化而產生氣溶膠（如：人員走動等 ）； 3、易產生氣溶膠或出現(xiàn)濺出的操作,如涂片、離心或其它操 作，應在BSL-2實驗室的級生物安全柜中進行，并使用個體防護設備；,4、盡可能減少使用注射器針頭，實驗中使用注射器時，用過 的針頭切勿再重新入套或拔開注射器與針頭，應直接放入 銳氣收集器，以免劃破皮膚造成接種感染； 5、試驗結束后，操作過程中所有可能與生物危險物接觸或被 污染的實驗器械或物品，能夠高壓的必須進行高壓消毒； 6、實驗中發(fā)生意外污染情況，應立即報告。,實驗室安全操作原則,實驗室安全操作-意外事故處理,1、實驗過程中，如標本或含標本的前消化處理液被打翻， 污染操作臺或地面，應以吸滿75乙醇溶液的衛(wèi)生紙覆 蓋污染區(qū)，15分鐘后衛(wèi)生紙方可移去； 2、實驗過程中，如污染物濺落到身體表面，或有割傷、刺 傷、燒傷、燙傷等情況發(fā)生，應立即停止實驗并進行緊 急處理；更換被污染的工作服，皮膚表面用消毒液清 洗，傷口以碘酒及酒精消毒，眼睛用無菌生理鹽水沖洗； 3、被污染的器械等立即浸泡于含氯消毒劑或75乙醇等溶 液中，實驗完成后再進行高壓消毒處理； 4、如果發(fā)生氣溶膠污染或大面積污染，應立即停止實驗并 關閉實驗室，對實驗區(qū)域和實驗室進行紫外燈照射消毒2 小時以上；對污染區(qū)域進行空氣熏蒸消毒。,實驗室安全操作-絕對禁止的處理方法,1、有可能造成污染面積擴大，如使用75乙醇或甲酚皂液 擦洗被污染的區(qū)域； 2、直接用火焰對未經(jīng)任何處理的污染地面、操作臺、器械 進行燒灼處理； 3、使用消毒效果未經(jīng)證實的消毒劑進行消毒； 4、使用低濃度的消毒劑和紫外燈進行短時間、長距離照射 消毒。,實驗室消毒與滅菌,1、物理消毒：紫外線、高壓滅菌 2、化學消毒：乙醇、過氧乙酸、苯酚、含氯消毒劑 3、注意事項,物理消毒紫外線,1、紫外線對結核桿菌有一定的殺滅作用，用輻射 強度在 100w/cm2以上的30W紫外線燈、相對濕度50%70%的 條件下，照射40min以上，對空氣中結核桿菌的殺滅效 果可達99.9%以上； 2、在液層厚度3mm含菌107108cfu/ml的結核桿菌的菌懸 液，用10W紫外線燈在距離0.5m處持續(xù)照射3分鐘，在 距離1m處持續(xù)照射10分鐘后，菌懸液經(jīng)培養(yǎng)無活菌生 長； 3、紫外線穿透力弱，通常用于空氣和物體表面消毒，對空 氣中細菌的殺滅更具優(yōu)勢，適合隨時性空氣消毒。,物理消毒高壓滅菌,1、高壓滅菌是對實驗材料滅菌的最有效和最可靠 的方法； 2、通常下列組合可以確保正確裝載的高壓滅菌器 的滅菌效果： 121、15min/ 115、25min 推薦121、30min。,化學消毒乙醇,1、結核桿菌（純培養(yǎng)物）直接接觸70%-75%乙醇5-30 分鐘可被殺死，可用于皮膚消毒； 2、但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一層把菌 體包裹起來的膜，短時間內不能殺死細菌，通常 乙醇不用于痰標本的消毒。,化學消毒過氧乙酸,1、過氧乙酸氣溶膠滲透性強、易蒸發(fā)，作用快 速，分解后不留有毒物質，適合于空氣消毒； 2、用5g/L過氧乙酸水溶液經(jīng)氣溶膠噴霧器噴霧消 毒，噴霧量為2010ml/m3，密閉60min以上。,化學消毒苯酚,1、主要通過破壞菌細胞膜而致細胞質內容物漏 出，使菌體蛋白質變性、凝固，抑制菌體脫氫 酶和氧化酶等酶系統(tǒng)殺死結核桿菌； 2、2%苯酚5分鐘、5%苯酚1分鐘能殺死結核桿菌培 養(yǎng)物； 3、5%苯酚與痰液等量混合，24小時才能殺死結核 桿菌。,化學消毒含氯消毒劑,含氯消毒劑能使菌體的酶失活，還能與蛋白質 的氨基結合，使菌體蛋白氯化，代謝功能障礙，細 菌死亡。但對在蛋白質混合液中的結核桿菌幾乎無 消毒效果。,化學消毒其它,1、結核桿菌較一般細菌對酸、堿抵抗力更強，可 在臨床或動物標本中加入4%NaOH，3%HCL和6%H2SO4，消化蛋白質及殺滅雜菌，以分離出結核桿菌； 2、結核桿菌對染料，如113000孔雀綠和175000結晶紫有抵抗力，通常在培養(yǎng)基內 加入一定量的孔雀綠或結晶紫抑制其他雜菌 生長。,注意事項,1、實驗室含有生物危險物的臨床標本及被污染的一次性用 品，實驗完成后，應經(jīng)高壓消毒后方可丟棄或焚燒； 2、可重復使用的試驗用品及器械，高壓滅菌后再清洗使用； 3、試驗用的試管、吸管、注射器，須裝在加蓋的容器內，經(jīng) 高壓消毒后拿出實驗室； 4、培養(yǎng)物或實驗室垃圾，在丟棄前必須經(jīng)過高壓滅菌處理； 5、實驗室內未經(jīng)消毒的污水，禁止直接排入公共排水系統(tǒng)， 更不允許混入居民生活垃圾。,生物安全柜的使用,1、正確安裝，確保安全柜與外部排風系統(tǒng)壓力平衡，保證安全柜處于正常工作狀態(tài)，定期維護和檢測，確保安全性； 2、在開始工作前應考慮實驗中的操作步驟和所需設備，充分做好準備工作； 3、盡量減少房間內人員走動，保證正常氣流； 4、準備好消毒劑和處理遺灑事件的物品； 5、前窗開至適當高度，打開安全柜的燈和風機；,生物安全柜的使用,6、將本次實驗所需物品放入生物安全柜內，并按照清潔物和污染物分別排列； 7、避免物品擋住隔柵； 8、將手緩慢放入生物安全柜，并等待2-3min，操作 時應在隔柵內側靠近隔柵處操作； 9、避免使用干擾安全柜內層流的實驗手段（如離心 和使用明火等）；,生物安全柜的使用,10、與污染物接觸過的物品從生物安全柜中取出之前 必須經(jīng)表面去污處理； 11、所有的托盤或容器從安全柜中取出前必須蓋上； 12、用75%酒精清潔安全柜所有內壁，清潔時安全柜 風機必須處于風機工作狀態(tài)； 13、工作結束后，安全柜繼續(xù)開機3-5min； 14、關閉前窗、燈、風機，打開紫外燈。,干凈的物品,理想的工作臺擺放原則（清潔-污染區(qū)） 在工作臺面上的實驗操作應該按照從清潔區(qū)到污染區(qū)的方向進行,被污染的區(qū)域,垃圾袋,廢棄物托盤,生物安全柜的使用,二、菌株運輸,法律依據(jù),1、病原微生物實驗室生物安全管理條例（國務院令第424號 2004.11.12） 2、可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸 管理規(guī)定（衛(wèi)生部令第45 號 2005.12.28） 3、人間傳染的病原微生物名錄（衛(wèi)生部 2006.1.11） 4、中國民用航空危險品運輸管理規(guī)定（CCAR276） 5、危險物品航空安全運輸技術細則（國際民航組織）,相關定義,1、病原微生物:是指能夠使人或者動物致病的微生物。 2、實驗活動:是指實驗室從事與病原微生物菌（毒） 種、樣本有關的研究、教學、檢測、診斷等活動。 3、可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或 樣本：是指在人間傳染的病原微生物名錄中 規(guī)定的第一類、第二類病原微生物菌（毒）種或 樣本。,結核桿菌分類人間傳染的病原微生物名錄 ,第二類：是指能夠引起人類或者動物嚴重疾病，比較容易直接或者間接在 人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。 樣本檢測：包括樣本的病原菌分離純化、涂片、顯微觀察、培養(yǎng)、藥物敏 感性實驗、生化鑒定、免疫學實驗、PCR 核酸提取、等初步檢 測活動。,縣級將菌株或樣本運輸至州級,一、申請材料（原件一份，復印件三份）： 1、可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運 輸申請表.doc；（縣級） 2、容器或包裝材料的批準文號、合格證書（復印件）或者 高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸容器或包裝 材料承諾書;（縣級） 3、申請方（縣級）、接收方（州級）雙方法人資格證明材 料（復印件）； 4、接收菌株或樣本的單位(州級)同意接收的證明文件（州 級自己擬定文件并加蓋單位公章）； 備注：接收單位（州級）具備從事高致病性病原微生物實 驗活動資格的證明即要求接收單位（州級） 在當?shù)匦l(wèi)生局進行病原微生物實驗活動備案。,縣級將菌株或樣本運輸至州級,二、運輸有關規(guī)定： 1、在固定的申請單位（縣級）和接收單位（州級）之間多次 運輸相同品種菌株種或樣本的，可以申請多次運輸。多次 運輸?shù)挠行跒?個月；期滿后需要繼續(xù)運輸?shù)?，應當重?提出申請； 2、應當通過陸路運輸；沒有陸路通道，必須經(jīng)水路運輸?shù)模?可以通過水路運輸；緊急情況下或者需要將菌株或者樣本 運往國外的，可以通過民用航空運輸； 3、有關單位或者個人不得通過公共電（汽）車和城市鐵路運 輸菌株或樣本。,縣級將菌株或樣本運輸至州級,二、運輸有關規(guī)定： 4、運輸菌株或者樣本，應當由不少于人的專人護 送，并采取相應的防護措施； 5、承運單位應當與護送人共同采取措施，確保所運 輸?shù)木昊驑颖镜陌踩?，嚴防發(fā)生被盜、被搶、 丟失、泄漏事件。,縣級將菌株或樣本運輸至州級,三、被盜、被搶、丟失、泄漏事的處理：,承運單位護送人 保藏機構,承運單位的主管部門護送人所在單位 保藏機構的主管部門,縣級衛(wèi)生主管部門或者獸醫(yī)主管部門,公安機關,縣人民政府,市級衛(wèi)生主管部門或者獸醫(yī)主管部門,省級衛(wèi)生主管部門或者獸醫(yī)主管部門,國務院衛(wèi)生主管部門或者獸醫(yī)主管部門,市人民政府,省、市、自治區(qū)人民政府,任何單位和個人,小時,小時,小時,小時,小時,小時,1小時,菌株或樣本運輸包裝要求,菌株或樣本運輸包裝要求,菌株或樣本運輸包裝主容器,菌株或樣本運輸包裝次級容器,菌株或樣本運輸包裝外包裝,菌株或樣本運輸流程,三、風險評估,結核桿菌實驗室實驗活動,不同實驗操作的實驗室生物安全級別要求： 1、BSL-3實驗室：根據(jù)名錄的規(guī)定，在實驗操 作涉及結核桿菌的大量培養(yǎng)（制備）、結核桿菌離心、凍干等易產生氣溶膠的實驗操作。 2、BSL-2實驗室：臨床樣本的結核桿菌分離培養(yǎng)、 藥物敏感性實驗、生化鑒定、免疫學實驗、PCR核酸提取、涂片、顯微觀察等初步檢測活動。 3、BSL-1實驗室:對經(jīng)有效方法滅活后不含結核桿菌 活菌材料的分子生物學、免疫學等實驗。,實驗活動中可能造成不良后果的 因素與預防措施,1、實驗樣本的接收與開啟 臨床含結核菌樣本在運輸過程中可能會因容器蓋子脫落或破碎使一些菌體產生氣溶膠，擴散進入空氣而造成污染。 預防措施 應采取防護措施，要求接收和打開樣品要在級生物安全柜內打開，小心操作，避免產生氣溶膠，操作人員要佩戴N95口罩，并準備好消毒劑。,實驗活動中可能造成不良后果的 因素與預防措施,2、結核桿菌培養(yǎng)（固體、液體培養(yǎng)） 在進行結核桿菌接種培養(yǎng)過程中，樣本開封、轉移、吸管吹吸、漩渦振蕩混勻、離心等步驟均可產生氣溶膠，在樣本轉移過程中培養(yǎng)物混合液的濺出、潑灑和容器的破碎等也可造成嚴重污染。 預防措施 （1）在級生物安全柜工作臺面應當放置一塊墊布，避免 感染性物質的滴濺，使用后將其高壓滅菌，操作過程 中最好使用無菌的一次性吸管； （2）渦旋振蕩、離心過程中應擰緊樣本容器蓋子，待氣溶 膠沉淀后在級生物安全柜打開蓋子； （3）樣本容器盡可能使用塑料制品，足夠堅固，蓋好蓋子 后應無泄漏； （4）樣本接種后將其固定在架子上，盡可能保持直立。,實驗活動中可能造成不良后果的 因素與預防措施,3、結核桿菌藥敏試驗 在藥敏試驗中菌懸液制備時，需對培養(yǎng)物進行研磨，在使用玻璃研磨器時容器內會產生壓力，含有感染性物質的氣溶膠就可能逸出，玻璃容器可能破碎而釋放感染性物質并傷害操作者。 預防措施 應采取防護措施，使用玻璃研磨器時應戴手套、N95口罩，操作和打開研磨器時應當在級生物安全柜內進行。,實驗活動中可能造成不良后果的 因素與預防措施,4、培養(yǎng)物與實驗廢棄物銷毀 在待銷毀培養(yǎng)物轉移過程中培養(yǎng)物混合液濺出、潑灑和容器的破碎等可造成嚴重污染；實驗室內實驗廢棄物容器外表可能污染病原微生物，未經(jīng)消毒轉移造成污染；用于銷毀的培養(yǎng)物與實驗廢棄物，置入高壓滅菌器，如裝得過滿或過于密閉，可能造成滅菌不徹底，將未滅活的培養(yǎng)物與實驗廢棄物送出室外，對人與環(huán)境造成極大威脅。 預防措施 （1）傳代菌種或培養(yǎng)物銷毀應有銷毀程序及相應原始記錄，所有 菌種或培養(yǎng)物滅活或銷毀時應均有2人以上共同執(zhí)行，銷毀記 錄應包括銷毀方式、銷毀物品明細、滅菌溫度與