食品微生物的檢測技術(shù)進(jìn)展.doc

科目：題目：食品微生物的檢測技術(shù)進(jìn)展 學(xué)院： 班級： 領(lǐng)域：學(xué)號：姓名：任課教師： 食品微生物的檢測技術(shù)進(jìn)展摘要: 在眾多食品安全相關(guān)項目中，微生物污染造成的食源性疾病仍是世界食品安全中最突出的問題。為了更好地開展食品微生物檢驗和調(diào)查研究工作、提高食品的衛(wèi)生質(zhì)量、保證消費者飲食安全，本文從食品微生物的概述出發(fā)，分析當(dāng)下食品微生物的檢驗內(nèi)容及其檢測技術(shù)、檢驗原理及其特點等關(guān)鍵詞：食品微生物；檢驗內(nèi)容；檢測技術(shù)1.前言隨著人們生活水平的不斷提高，食品安全問題逐漸成為各國政府、公眾關(guān)注的焦點問題。在眾多食品安全相關(guān)項目中，微生物及其產(chǎn)生的各類毒素引發(fā)的污染備受重視，微生物污染造成的食源性疾病仍是世界食品安全中最突出的問題。加工食品所含菌的種類、數(shù)量，常隨原料的生產(chǎn)環(huán)境及細(xì)菌學(xué)質(zhì)量、工廠環(huán)境與包裝工程的衛(wèi)生及處理狀況、制品貯運狀況等而異。食品達(dá)到細(xì)菌學(xué)的衛(wèi)生條件是最終制品中不允許存在致病菌，如果存在食物中毒菌，必須達(dá)到不損害人體健康的安全水平。由于食品微生物污染的廣泛發(fā)生，嚴(yán)重影響人民的健康，因此食品微生物檢驗工作對評價食品衛(wèi)生質(zhì)量，保證消費者飲食衛(wèi)生有著極為重要的作用。研究靈敏度更高、特異性更強、簡便快捷的食品安全檢測技術(shù)和方法，建立和完善食品安全微生物檢測技術(shù)和體系迫在眉睫。在各種食品生產(chǎn)加工單位均設(shè)有化驗室，開展食品微生物檢驗工作。在食品質(zhì)量監(jiān)測部門，為了監(jiān)督監(jiān)測食品生產(chǎn)銷售單位的食品衛(wèi)生質(zhì)量，也都設(shè)有專門的微生物檢驗室，開展食品微生物檢驗工作，以及對食品微生物污染的檢測和調(diào)查研究工作。2 食品微生物檢驗的內(nèi)容和特點2.1概述食品微生物檢驗主要是指細(xì)菌學(xué)檢驗，包括細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群和致病菌的檢驗。經(jīng)典的方法有固體培養(yǎng)基法（用于細(xì)菌總數(shù)的檢驗），液體培養(yǎng)基發(fā)酵法（用于大腸菌群的檢驗），由于設(shè)備簡單，適用范圍廣，因此是最為常用的檢驗法。而操作簡便、快捷的膜分離培養(yǎng)技術(shù)在食品微生物檢驗中也有發(fā)展景。經(jīng)典的食品微生物檢測技術(shù)耗時長、效率低、敏感性差，不能及時檢出食品中的病原菌。發(fā)展迅速、準(zhǔn)確、高效的現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)，可以快速檢出食品中的病原微生物，迅速對食品衛(wèi)生質(zhì)量作出評價，防止食物中毒的發(fā)生，有效地控制食源性疾病?，F(xiàn)代食品微生物技術(shù)研究內(nèi)容主要有食源性病原菌免疫學(xué)快速檢測、食源性病原菌分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)、基于培養(yǎng)基生理生化特征的檢測技術(shù)、食源性病菌的自動化檢測技術(shù)、食源性致病菌生物傳感器檢測技術(shù)等。2.2食品微生物檢驗的特點食品微生物檢驗的特點歸結(jié)為以下5點。（1）食品微生物檢驗涉及的微生物范圍廣，種屬多，采集食品微生物檢驗樣品比較復(fù)雜，要求高。（2）食品微生物檢驗需要一定的準(zhǔn)確性與快速性。（3）食品中待分離細(xì)菌數(shù)量少、雜菌量多，對檢驗工作干擾嚴(yán)重。（4）食品中微生物檢驗具有數(shù)量觀念。（5）食品微生物檢驗具有一定法律性質(zhì)。3 食品微生物檢驗的發(fā)展動向食品衛(wèi)生微生物鑒定的傳統(tǒng)方法有：形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞培養(yǎng)、生化試驗、血清學(xué)分型、噬菌體分型、毒性試驗及血清試管凝聚試驗等。近年來，隨著分子生物學(xué)和微電子技術(shù)的飛速發(fā)展，快速、準(zhǔn)確、特異檢驗微生物的新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn)，微生物檢驗技術(shù)由培養(yǎng)水平向分子水平邁進(jìn)，并向儀器化、自動化、標(biāo)準(zhǔn)化方向發(fā)展，提高了食品微生物檢驗工作的高效性、準(zhǔn)確性和可靠性。食品微生物檢驗新技術(shù)有以下幾種。3.1 代謝學(xué)技術(shù)3.1.1 電阻抗法 電阻抗法是近年發(fā)展起來的一項生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)開始應(yīng)用于食品微生物的檢驗。其原理是細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖的過程中，將會使培養(yǎng)基中的大分子電惰性物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等，代謝為具有電活性的小分子物質(zhì)，如乳酸鹽、醋酸鹽等，這些離子態(tài)物質(zhì)能增加培養(yǎng)基的導(dǎo)電性，使培養(yǎng)基的阻抗發(fā)生變化，通過檢測培養(yǎng)基的電阻抗變化情況，判定細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長繁殖特性，即可檢測出相應(yīng)的細(xì)菌。該法目前已經(jīng)用于細(xì)菌總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等的檢測。3.1.2 快速酶觸反應(yīng)及代謝產(chǎn)物的檢測 快速酶觸反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，根據(jù)酶的特性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，反應(yīng)的測定結(jié)果有助于細(xì)菌快速診斷，如美國3M Petfifilm TM微生物測試片可分別快速測定細(xì)菌總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸菌群等。3.1.3 微量生化法 Bachman和Weaver在20世紀(jì)40年代后期首先開創(chuàng)了微量生化法的紀(jì)元。隨著人們對細(xì)菌進(jìn)行快速生化特性的需求增加，使高精密度（90）和高重現(xiàn)性的商業(yè)試劑盒得以快速發(fā)展。至今，市售的微生物鑒定用試劑盒有多種，常見的有MICRO-ID、API等。API由20個含干燥培養(yǎng)基的微管組成，其中的培養(yǎng)基用于進(jìn)行酶促反應(yīng)或糖發(fā)酵試驗。檢驗時將預(yù)處理的菌懸液加入微管中培養(yǎng)后觀察顏色變化，并紀(jì)錄，輸入APILAB Plus軟件得出結(jié)果。API創(chuàng)建了獨特的數(shù)值鑒定法，可鑒定15個系列、600多個細(xì)菌種，因此具有簡單、可靠等特點。3.2抗體技術(shù)抗體技術(shù)中常見是酶聯(lián)免疫吸附法，是一種測定抗原抗體的有效方法。原理是將抗體包被聚苯乙烯孔，從而獲得抗原，在此過程中需要借助第三種載體，即用事先與酶結(jié)合的抗體去接觸抗原，從而形成抗體抗原的復(fù)合物。再借助生色酶底物，通過判斷復(fù)合物顏色的變化來記錄檢測結(jié)果，在操作中只需要通過肉眼觀察，就可以判斷菌落數(shù)量的多少。抗體方法在食品微生物檢驗中應(yīng)用廣，根據(jù)檢測技術(shù)的不同又可分為兩類。3.2.1乳膠凝集反應(yīng) 這利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，加上人工大分子的乳膠顆粒而發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。Aureus Test用于食品樣品中金黃色葡萄球菌的檢測，該試劑盒中含有對免疫抗蛋白AIg G和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳膠粒子，因細(xì)菌蛋白A和Ig G結(jié)合，凝聚酶和鞭毛抗原結(jié)合，所以當(dāng)含有金黃色葡萄球菌的樣品懸浮液加入含乳膠粒子的試劑盒中時，1min內(nèi)將產(chǎn)生凝集反應(yīng)。該法的靈敏度和特異性均較高。3.2.2酶聯(lián)免疫吸附法 這是用于定性或定量測定特異抗原抗體的一種技術(shù)，它多采用“夾心式”設(shè)計，即用抗體包被的聚苯乙烯孔捕獲抗原，用另一個結(jié)合了酶的抗體與抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，再用一種生色酶底物通過肉眼觀察或比色法記錄結(jié)果。隨著單克隆抗體酶聯(lián)免疫技術(shù)的出現(xiàn)，免疫檢測法的特異性明顯的提高。3.3分子生物學(xué)技術(shù)核酸探針技術(shù)在分子生物學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用十分廣泛，需要借助一系列的生物知識，原理是用核苷酸形成雜交雙鏈，進(jìn)而判定雜交鏈中的DNA。在檢測過程中，其中一條鏈子的核苷酸序列號是已知的，即工作人員事先已經(jīng)知道一條鏈子的 DNA，實驗中需要用到基因探針。在檢測中，由于核苷酸中的成分含量有著很大的差異，可以分為兩種探針。一種探針能夠分辨出一部分的 DNA 反應(yīng)，即對某些菌落敏感，對另外的菌落不敏感；另一種探針能夠分別出全部的 DNA 反應(yīng)。該種檢測技術(shù)的優(yōu)勢在于菌落微生物對于外界條件比較敏感，所以很容易區(qū)分。但是，其不足在于要求探針對檢測時間的精準(zhǔn)度把握十分準(zhǔn)確，否則容易錯過最佳檢測時間，影響試驗的準(zhǔn)確性。3.3.1核酸探針技術(shù)將已知核苷酸序列D N A片段用同位素或其他方法標(biāo)記，加入已變性的被檢D N A樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的D N A區(qū)段形成雜交雙鏈，從而達(dá)到鑒定樣品中D N A的目的，這種能認(rèn)識到特異性核苷酸序列有標(biāo)記的單鏈D N A分子核酸探針或基因探針。根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分成D N A探針或R N A探針；根據(jù)選用基因的不同分成兩種，一種探針能同微生物中全部D N A分子中的一部分發(fā)生反應(yīng)，它對某些菌屬、菌種、菌株有特異性；另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組D N A發(fā)生雜交反應(yīng)，它對某種微生物中的一種菌株或僅對微生物中某一菌屬有特異性。核酸探針檢測技術(shù)的最大優(yōu)點是：特異性；敏感性。但探針檢測技術(shù)中也存在一定的問題，如檢測一種菌就需要制備一種探針；要達(dá)到檢測量還要對樣品進(jìn)行一定時間的培養(yǎng)；探針檢測是分析基因序列，對毒素污染的食品有時因樣品中不含產(chǎn)毒菌而無法檢測。3.3.2 PCR技術(shù)PCR（Po1ymerase Chanin Reaction ）是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡稱，PCR 技術(shù)是由Kleppe 等人在1971年首先提出的。該方法通過對人工難以培養(yǎng)的微生物相應(yīng)DNA片段的擴(kuò)增,檢測擴(kuò)增產(chǎn)物含量, 從而快速地對食品中致病菌含量進(jìn)行檢測。檢測時,首先在高溫下(95)使得蛋白質(zhì)變性,DNA雙鏈變成單鏈；再迅速降溫( 55),每條DNA單鏈退火, 這就是所謂的熱循環(huán)。之后溫度重新上升到 95, 開始新的循環(huán)。經(jīng)一套擴(kuò)增循環(huán)(21到31次)將1個單分子DNA擴(kuò)增到107分子。整個過程可以在1h內(nèi)通過自動熱量循環(huán)器完成。理論上, 只要樣中含有一分子沙門氏菌的DNA, 通過PCR技術(shù)完全可以在短時間內(nèi)檢測到。這種測定方法的優(yōu)點是測定結(jié)果迅速、靈敏度和特異性高、檢測成本低；但其存在的最大問題在于PCR 產(chǎn)品的污染。PCR技術(shù)采用DNA 擴(kuò)增和自動化程序?qū)μ囟ǖ闹虏【M(jìn)行檢測，已經(jīng)成功地對沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌等致病菌進(jìn)行了有效測定。實時定量技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，這種方法既保持了PCR 技術(shù)靈敏、快速的特點，又克服了以往PCR技術(shù)中存在的假陽性污染和不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點。另外，還有重復(fù)性好、省力、低費用等優(yōu)點。實時定量PCR 技術(shù)是從傳統(tǒng) PCR技術(shù)發(fā)展而來，其基本原理相同，但定量技術(shù)原理不同。實時定量技術(shù)應(yīng)用了熒光染料和探針來保證擴(kuò)增的特異性，并且熒光信號的強弱同擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比，從而準(zhǔn)確定量。該技術(shù)在基因突變的檢測、基因表達(dá)的研究、微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品的檢測等領(lǐng)域均有重要的應(yīng)用價值。3.4儀器法隨著微生物快速檢測法的不斷發(fā)展,很多檢驗技術(shù)日趨成熟和完善,并被人們進(jìn)一步開發(fā)、研制成自動或半自動微生物檢測儀3.4.1旋轉(zhuǎn)平板技術(shù)和激光菌落掃描儀自動旋轉(zhuǎn)平板技術(shù)是在瓊脂培養(yǎng)基表面倒一薄層樣品,該儀器可使液體樣品以螺旋轉(zhuǎn)動方式分布,液體慢速流出后,隨著平板的旋轉(zhuǎn)從中心向邊緣分布,樣品分布非常均勻。這種方法可廣泛用于細(xì)菌、酵母、霉菌及乳類樣品中。樣品倒入平板后,菌落數(shù)可以用激光菌落計數(shù)器來計數(shù),即將光檢測儀放置在儀器的底部,激光儀從上面自動掃描平板,當(dāng)激光束通過菌落時,可以降低光的強度,從而檢測出菌落的存在。這樣菌落數(shù)可以通過電子計數(shù),從而不是傳統(tǒng)的視覺計數(shù)。電子計數(shù)快而準(zhǔn)確,與傳統(tǒng)計數(shù)法得到的結(jié)果相近。3.4.2流式細(xì)胞術(shù)(FCM)該技術(shù)是用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞懸液進(jìn)行自動快速定量分析和分選的新技術(shù),具有速快、精確度高、記數(shù)細(xì)胞量大以及參數(shù)分析等全面測量細(xì)胞和分選細(xì)胞等優(yōu)點。由于FCM檢測到的熒光強度的強弱與DNA片段的大小成比例,根據(jù)熒光濃度的直方圖就可知道細(xì)菌的DNA指紋圖譜,從而確定細(xì)菌的種類?，F(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)能夠檢測純化的DNA可達(dá)pg級水平,在10min內(nèi)可以完成數(shù)據(jù)的收集和分析。近年來在臨床實驗室已經(jīng)逐步用于病毒、細(xì)菌的檢測、計數(shù)、鑒定等。3.4.3電阻電導(dǎo)檢測器原理是當(dāng)細(xì)菌生產(chǎn)繁殖時,將蛋白質(zhì)、糖類等大分子物質(zhì)分解成氨基酸、有機(jī)酸等帶電荷的小分子物質(zhì),改變培養(yǎng)液的導(dǎo)電度,這樣,測量電阻和導(dǎo)電度的變化,就可推算出樣品原來的含菌數(shù)。Bactometer是利用電阻抗,電容抗或總阻抗等三種參數(shù)的自動微生物監(jiān)測系統(tǒng),它能快速測定樣品中細(xì)菌的污染程度,從而快速提供品質(zhì)控制的信息。另外,該儀器能通過測定代謝物產(chǎn)生的速度將菌體的數(shù)量與其活動相結(jié)合,使檢驗結(jié)果達(dá)到預(yù)測保藏質(zhì)量和衛(wèi)生安全的作用。4食品微生物檢測過程中的注意事項在食品微生物的檢測過程中，對于檢驗的試驗性要求很高，主要包括下列內(nèi)容：工作人員在操作過程中必須是在無菌的環(huán)境中規(guī)范操作，檢測設(shè)備必須達(dá)到相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)，器械的反映靈敏程度高；各個器皿的溫度必須保持一致性；試驗藥品在使用之前需要經(jīng)過高溫消毒。只有這樣，才能夠確保檢驗過程的準(zhǔn)確性，才能夠真正為人們提供正確的數(shù)據(jù)，為人們的安全保駕護(hù)航5小結(jié)隨著食品安全受到的關(guān)注越來越多，食品微生物的檢測環(huán)節(jié)得到越多人的重視。其數(shù)據(jù)不僅能夠為食品安全部門提供相關(guān)依據(jù)，同時也有利于人們選擇更加安全的日常生活必需品，增加人們的放心度。在科技的發(fā)展下，相信食品微生物終將對人們的生活產(chǎn)生更加深遠(yuǎn)的影響。參考文獻(xiàn)1.王云國，李懷燕. 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