DNA序列測定.doc

第四節(jié) DNA序列測定目前應(yīng)用的兩種快速序列測定技術(shù)是Sanger等（1977）提出的酶法（雙脫氧鏈終止法）和Maxam（1977）提出的化學(xué)降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都同樣生成相互獨立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機(jī)終止于一種（或多種）特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸為末端的長度各不相同的寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由這個特定堿基在待測DNA片段上的位置所決定。然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)放射自顯影后，從放射自顯影膠片上直接讀出待測DNA上的核苷酸順序。高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳亦是DNA序列測定技術(shù)的重要基礎(chǔ)，可分離僅差一個核苷酸、長度達(dá)300500個核苷酸的單鏈DNA分子。DNA序列測定的簡便方法為詳細(xì)分析大量基因組的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，時至今日，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)氨基酸序列都是根據(jù)基因或cDNA的核苷酸序列推導(dǎo)出來的。除傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法和化學(xué)降解法外，自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。此外，新的測序方法亦在不斷出現(xiàn)，如上世紀(jì)90年代提出的雜交測序法（sequencing by hybridization，SBH）等。一、雙脫氧末端終止法測序 原理 雙脫氧末端終止法是Sanger等在加減法測序的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。1980年他又因設(shè)計出一種測定DNA(脫氧核糖核酸)內(nèi)核苷酸排列順序的方法而與W吉爾伯特、P伯格共獲1980年諾貝爾化學(xué)獎。桑格是第四位兩次獲此殊榮的科學(xué)家。其原理是：利用大腸桿菌DNA聚合酶，以單鏈DNA為模板，并以與模板事先結(jié)合的寡聚核苷酸為引物，根據(jù)堿基配對原則將脫氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5-磷酸基團(tuán)與引物的3-OH末端生成3,5-磷酸二酯鍵。通過這種磷酸二酯鍵的不斷形成，新的互補(bǔ)DNA得以從53延伸。Sanger引入了雙脫氧核苷三磷酸（ddTNP）作為鏈終止劑。ddTNP比普通的dNTP在3位置缺少一個羥基（2,3-ddNTP）（圖7-4-1），可以通過其5三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于缺少3-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成3,5-磷酸二酯鍵。因此，正在增長的DNA鏈不再延伸，使這條鏈的延伸終止于這個異常的核苷酸處。這樣，在4組獨立的酶反應(yīng)體系中，在4種dNTP混合底物中分別加入4種ddNTP中的一種后，鏈的持續(xù)延伸將與隨機(jī)發(fā)生卻十分特異的鏈終止展開競爭，在摻入ddTNP的位置鏈延伸終止。結(jié)果產(chǎn)生4組分別終止于模板鏈的每一個A、每一個C、每個G和每一個T位置上的一系列長度的核苷酸鏈。通過高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從放射自顯影膠片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。雙脫氧鏈終止法測序原理如圖7-4-2所示。圖7-4-1 脫氧核苷三磷酸和雙脫氧核苷三磷酸分子結(jié)構(gòu)5GAGTCACACTTGAC 3待測單鏈DNA 3CTG 5引物、Klenow酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和少量-32P-dATP 加ddGTP反應(yīng)3GAACTG 53GTGAACTG 53GTGTGAACTG 5加ddCTP反應(yīng)3CAGTGTGAACTG 53CTCAGTGTGAACTG 5加ddTTP反應(yīng)3TGAACTG 53TGTGAACTG 53TCAGTGTGAACTG 5加ddATP反應(yīng)3ACTG 53AACTG 53AGTGTGAACTG 5變性凝膠電泳、放射自顯影5 ACTGGAGTCACACTT測序圖譜識讀3 圖7-4-2 雙脫氧鏈終止法測序原理 模板 有兩種類型的DNA模板可以作為Sanger法測序的模板，即純化的單鏈DNA和經(jīng)熱變性或堿變性的雙鏈DNA。1單鏈DNA模板 在一般情況下，可將靶DNA片段克隆于M13mp載體，從重組克隆M13mp系列噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA模板。這種單鏈模板效果最佳，只要細(xì)心掌握模板與引物的最佳比例，有經(jīng)驗的測序人員通過一次末端終止反應(yīng)，能讀取500個以上的核苷酸序列。2經(jīng)熱變性或堿變性的雙鏈DNA模板 盡管采用變性雙鏈DNA作測序模板顯然簡單且方便，但實際上很難獲得單鏈模板那樣的滿意結(jié)果。利用雙鏈質(zhì)粒模板測序，其中有兩個至關(guān)重要的因素，即模板的質(zhì)量和聚合酶的種類。用小量制備的質(zhì)粒DNA來測定未知序列的DNA克隆往往因為有污染而并不可取，高純度的質(zhì)粒最好采用氯化銫-溴乙錠梯度平衡超速離心法制備。其次是應(yīng)采用高質(zhì)量的聚合酶。一次末端終止反應(yīng)亦可能讀出300核苷酸序列。應(yīng)該注意的是，適合做雙鏈模板的質(zhì)粒，最好具有較高的拷貝數(shù)并有插入失活的選擇標(biāo)志，有配套的通用引物結(jié)合區(qū)。最常用的載體系統(tǒng)是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。雙鏈模板測序最大的優(yōu)勢是對已知序列DNA的亞克隆進(jìn)行鑒定，可省略再經(jīng)M13載體亞克隆獲取單鏈模板過程。 引物 酶法測序反應(yīng)中都有一個與模板鏈特定序列互補(bǔ)的合成的寡核苷酸作為DNA合成的引物。不管是將靶DNA片段克隆于M13mp載體獲取的單鏈DNA作模板，還是采用變性雙鏈DNA（如變性質(zhì)粒DNA）模板，都有可以與位于靶DNA側(cè)翼的載體序列相退火的通用引物（universal primer）可用，而不必另行設(shè)計與未知DNA序列互補(bǔ)的引物。適合于M13mp系列載體的通用引物一般長1529個核苷酸，當(dāng)然這些引物也同樣適用于那些克隆于pUC系列質(zhì)粒的DNA進(jìn)行雙鏈測序。這些測序用的通用質(zhì)粒及其通用引物可直接從許多廠商購買到。4 DNA聚合酶 如前所述，選用合適的DNA聚合酶進(jìn)行測序反應(yīng)也是保證測序質(zhì)量的重要因素之一。常用于雙脫氧末端終止法測序的有幾種不同的酶：1大腸桿菌DNA聚合酶大片段（Klenow片段） 此酶是最早用于建立Sanger測序的酶。但通常會有兩個問題：Klenow片段的持續(xù)合成能力較低，通常只能得到約250350個核苷酸的序列，而且由于聚合酶隨機(jī)從模板上解離而終止鏈延伸，通常會產(chǎn)生較高的本底和假帶；對同聚核苷酸段或其他含牢固二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域復(fù)制效能低下。但此酶價格便宜，對已知序列的亞克隆進(jìn)行鑒定仍有應(yīng)用價值。2測序酶（sequenase） 該酶是一種經(jīng)過化學(xué)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，其原來很強(qiáng)的35外切酶活性，經(jīng)化學(xué)修飾后大部分被消除。目前常用的測序酶大都是基因工程產(chǎn)品，完全缺失35外切酶活性，具有活性非常穩(wěn)定可靠、持續(xù)合成能力強(qiáng)和聚合速度高等優(yōu)點，是測定較長DNA的首選酶。市售的各種以該酶為基礎(chǔ)的測序試劑盒，效果甚佳。3耐熱DNA聚合酶 PCR技術(shù)的應(yīng)用正在不斷擴(kuò)大，耐熱DNA聚合酶應(yīng)用于以Sanger雙脫氧鏈終止法為基礎(chǔ)的DNA測序方案，已發(fā)展成為被稱為“循環(huán)測序”或“線性擴(kuò)增測序”方法。在該類測序方法中，由于使用了耐熱DNA聚合酶，與其他DNA聚合酶相比較具有二大優(yōu)點。其一，由于采用熱循環(huán)方法線性擴(kuò)增模板DNA，獲得清晰可辨的序列梯帶所需要的模板DNA量少；其二，由于，耐熱DNA聚合酶可在95高溫下保持穩(wěn)定，測序反應(yīng)可以在高溫（7080）下進(jìn)行。因而能克服富含GC序列的模板形成自身二級結(jié)構(gòu)對測序的影響。因此，循環(huán)法可以方便地對PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒DNA、DNA和粘粒DNA等雙鏈模板進(jìn)行序列測定，特別有利于對高GC堿基含量的模板測序。循環(huán)測序法利用了熱循環(huán)儀的自動循環(huán)的高效能力。循環(huán)測序反應(yīng)與普通PCR反應(yīng)有所不同。只需一條引物，通過單引物進(jìn)行熱循環(huán)，模板DNA以線性方式被擴(kuò)增，而不是標(biāo)準(zhǔn)PCR的指數(shù)方式擴(kuò)增；反應(yīng)底物除四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，還加入了雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），進(jìn)行擴(kuò)增時，鏈的延伸終止于摻入ddNTP的位置，產(chǎn)生分別終止于不同核苷酸的一系列不同長度的擴(kuò)增片段。 放射性標(biāo)記傳統(tǒng)的DNA測序方法都采用-32P-dNTP作為放射性標(biāo)記物，但由于32P發(fā)射的高能射線，常會引起二個問題。首先是導(dǎo)致放射自顯影圖譜條帶擴(kuò)散、分辨率低，限制了識讀序列的數(shù)量和準(zhǔn)確性。其次是32P衰變會導(dǎo)致DNA樣品分解，通常都應(yīng)在測序反應(yīng)后24h內(nèi)進(jìn)行電泳，否則無法獲得好的結(jié)果。近年來-35S-dNTP被廣泛采用，是由于35S產(chǎn)生較弱的射線，克服了32P的二大缺點。放射自顯影圖譜具有較高的分辨率和較低的本底，測序反應(yīng)產(chǎn)物可在-20保存一周，而分辨率并不下降。 關(guān)于DNA序列的識讀DNA序列的識讀是一個熟能生巧的過程。注意幾點技巧：在顯影前后一定要注意標(biāo)明模板名稱、日期和測序人等，并標(biāo)明各套反應(yīng)位置；識讀時從顯而易見的特征序列開始，如連續(xù)的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替出現(xiàn)的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到這種序列，便可較快地確定目的序列的位置。二、Maxam-Gilbert化學(xué)降解法測序 幾乎在雙脫氧法發(fā)展的同時，1977年Maxam-Gilbert等提出了化學(xué)降解法。自Maxam-Gilbert初次提出以來，其實驗方案基本上沒有變化。 原理 化學(xué)降解法與包括合成反應(yīng)的鏈終止法不同，需要對原DNA進(jìn)行化學(xué)降解。其基本原理是，首先對待測DNA末端進(jìn)行放射性標(biāo)記，再通過5組（也可以是4組）相互獨立的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解產(chǎn)物，其中每一組反應(yīng)特異性地針對某一種或某一類堿基進(jìn)行切割。因此，產(chǎn)生5 組（或4組）不同長度的放射性標(biāo)記的DNA片段，每組中的每個片段都有放射性標(biāo)記的共同起點，但長度取決于該組反應(yīng)針對的堿基在原樣品DNA分子上的位置。此后各組反應(yīng)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，通過放射自顯影檢測末端標(biāo)記的分子，并直接讀取待測DNA片段的核苷酸序列。測序原理如圖7-4-3所示。5 *P-GATCGGACCT 3G反應(yīng) G+A反應(yīng) T+C反應(yīng) C反應(yīng)G G+A T+C C*GATCGGACCT*GATCGGACC*GATCGGAC*GATCGGA*GATCGG*GATCG*GATC*GAT*GA*G圖7-4-3 化學(xué)裂解法測序原理 待測DNA的末端標(biāo)記化學(xué)降解法測序首先要制備單側(cè)末端標(biāo)記的待測DNA片段。DNA片段的核素標(biāo)記有三種方法：1利用T4噬菌體多核苷酸激酶和-32P-ATP標(biāo)記DNA的5-末端 對于去5-磷酸化的DNA片段，T4噬菌體多核苷酸激酶可以通過正向反應(yīng)將-32P-ATP的-磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA的5-末端；對于5-磷酸化的DNA片段，在過量ATP條件下，該酶可以通過交換反應(yīng)將-32P-ATP的-磷酸基與DNA的5-末端磷酸基發(fā)生交換反應(yīng)而標(biāo)記。但對于雙鏈DNA片段，由于DNA的兩側(cè)均被標(biāo)記，不能直接用于測序反應(yīng)。需要經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割，電泳分離二種不同大小的標(biāo)記片段，或者直接用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離二條單鏈，但這種分離方法比較困難，較少使用。2利用末端轉(zhuǎn)移酶和-32P-ddNTP標(biāo)記DNA的3-末端 在二價陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加入DNA分子的3-羥基末端，如果作為底物的核苷酸經(jīng)過修飾（如ddNTP），則可以在DNA的3-OH上僅加入一個核苷酸。對于雙鏈DNA片段，亦存在DNA的兩側(cè)均被標(biāo)記問題，可通過上述同樣的方法分離。5 33 5-32P-dNTPDNA聚合酶Klenow片段方法A：用兩種不同的限制性內(nèi)切酶切割DNA片段，且其中只有一種酶可產(chǎn)生3凹末端。5 32pN 33 5方法B：用兩種可產(chǎn)生不同3凹末端的限制性內(nèi)切酶切割DNA。5GATC 33 TTAA5-32P-dGTPDNA聚合酶Klenow片段-32P-dATPGATC 32pA TTAAGATC G32p TTAA圖7-4-4 對雙鏈DNA進(jìn)行不對稱標(biāo)記的常用方法3利用Klenow片段和-32P-dNTP對限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的3-凹進(jìn)末端進(jìn)行標(biāo)記 這種方法能直接制備單側(cè)末端標(biāo)記的DNA，但要求待測DNA能滿足下列條件之一：DNA兩端的一側(cè)為3-凹進(jìn)末端，而另一側(cè)為平端或3-凸出末端；兩端雖均為3-凹進(jìn)末端但末端單鏈結(jié)構(gòu)不同，這時可選擇不同的-32P-NTP來實現(xiàn)末端標(biāo)記。這是對雙鏈DNA進(jìn)行不對稱標(biāo)記的常用方法，如圖7-4-4所示。CS載體系列（CS是chemical sequecing的縮寫）是專門為化學(xué)降解法測序進(jìn)行末端標(biāo)記而構(gòu)建的一類克隆載體，如pSP64CS和pSP65CS。這類載體最重要的特點是，在待測DNA克隆片段的附近有兩個可被限制性酶Tth111識別的典型位點（GACNNNGTC，不對稱），能在克隆DNA片段兩側(cè)不同的3-凹進(jìn)末端，從而方便地實現(xiàn)對待測DNA的單側(cè)標(biāo)記。值得特別注意的是，化學(xué)降解法對標(biāo)記的待測DNA純度有較高的要求，因為鹽濃度會干擾肼對胸腺嘧啶的修飾，也會抑制A+G反應(yīng)中的去嘌呤過程。因此，標(biāo)記的DNA一般要經(jīng)酚/氯仿抽提、70%乙醇洗滌除鹽，并用去離子水溶解而不用TE緩沖液。 堿基特異的化學(xué)切割反應(yīng) 在化學(xué)降解法中，專門用來對核苷酸作化學(xué)修飾并打開堿基環(huán)的化學(xué)試劑主要有肼（hydrazine）和二硫酸甲酯（dimethylsulphate）。肼又叫聯(lián)氨（NH2-NH2），在堿性條件下，能作用于T/C的C4和/或C6原子位置，并同C4-C5-C6環(huán)化形成一種新的五元環(huán)。肼進(jìn)一步作用釋放出吡唑啉酮環(huán)。在六氫吡啶的作用下，通過消除反應(yīng)，該堿基兩端的磷酸基團(tuán)便會以磷酸分子形式從糖環(huán)上釋放出來，從而導(dǎo)致在這個核苷酸位置上發(fā)生DNA斷裂如果在此反應(yīng)體系中加入1mol/L濃度的鹽，則肼同T的反應(yīng)速率會下降，便可發(fā)生C特異的化學(xué)切割反應(yīng)。因此，可以根據(jù)這一特點來區(qū)別C和C+T這2種化學(xué)切割反應(yīng)?；瘜W(xué)反應(yīng)過程如圖7-4-5所示。二硫酸甲酯(CH3O)2SO2，能使DNA堿基環(huán)中的氮原子發(fā)生甲基化反應(yīng)。在DNA測序分析中所涉及的甲基化位點是G的N7原子和A的N3原子。在中性pH環(huán)境中，這2種堿基的甲基化作用，都足以導(dǎo)致其糖苷鍵發(fā)生水解作用，而留下失去堿基的糖-磷酸骨架。再通過堿催化的-消除反應(yīng)水解無堿基糖環(huán)兩端的磷酸二酯鍵，造成DNA在此位點發(fā)生斷裂。同時，已知DNA中G的N7原子甲基化速率比A的N3原子快410倍，故在中性條件下水解速率G位置也比A位置要快得多（差46倍），這是早期Maxam-Gilbert化學(xué)降解法測序辨別DNA中G和A的基本依據(jù)。現(xiàn)行的化學(xué)裂解反應(yīng)，都采用六氫吡啶與DNA中的甲基化堿基反應(yīng)，且這種反應(yīng)對甲基化的G是特異的，因此這種DNA鏈的斷裂也僅發(fā)生在G殘基位點。化學(xué)反應(yīng)過程如圖7-4-6所示。化學(xué)反應(yīng)設(shè)有5組獨立的反應(yīng)：G反應(yīng)（在G 殘基上的裂解）、A+G反應(yīng)（在嘌呤殘基上的裂解）、C+T反應(yīng)（在嘧啶殘基上的裂解）、C反應(yīng)（在C殘基上的裂解）和AC反應(yīng)（在A和C 殘基上的裂解），AC反應(yīng)也可以不做。圖7-4-5 聯(lián)氨和六氫吡啶在胸腺嘧啶殘基位點切割DNA的化學(xué)過程圖7-4-6 硫酸二甲酯和六氫吡啶在鳥嘌呤殘基位點切割DNA的化學(xué)過程 測序圖譜的識讀 對于測序電泳圖譜的識讀，化學(xué)降解法測序要比末端終止法較為復(fù)雜，因為化學(xué)裂解反應(yīng)并非是完全絕對堿基特異的。每組測序圖譜為5條或4條（AC反應(yīng)可以不做）泳道。需要通過從C+T泳道出現(xiàn)的條帶中扣除C泳道的條帶而推斷T殘基的存在。類似地，A殘基的位置也要通過從A+G泳道中扣除G泳道的條帶推斷出來。同時，如果AC泳道中出現(xiàn)較強(qiáng)的條帶，則可確證A殘基的存在。實際讀片時從膠片底部一個個地向頂部讀取。從下至上，一個一個地從G+A泳道和C+T泳道二個列中確定只相差一個堿基的條帶。如果在G+A泳道中出現(xiàn)一條帶，就看G泳道中是否有相同大小的帶，如果有即為G堿基，如果沒有則為A堿基；同樣，在C+T泳道中出現(xiàn)的條帶，就檢查C泳道中有無同樣大小的條帶，如果有即為C，無則為T。如果做了AC反應(yīng)，在該列中出現(xiàn)較強(qiáng)的條帶時，可幫助A的確定。 化學(xué)降解法測序的優(yōu)點 在化學(xué)降解法與鏈終止法問世之初，利用化學(xué)降解法進(jìn)行測序不僅重復(fù)性更高，而且由于只需要簡單的化學(xué)試劑和一般的實驗條件，易為普通實驗室和研究人員所掌握。而鏈終止法需要單鏈模板、特異的寡核苷酸引物和高質(zhì)量的大腸桿菌DNA聚合酶大片段（Klenow片段），這在二十世紀(jì)八十年代一般的實驗室很難做到。但隨著M13mp載體的發(fā)展、DNA合成技術(shù)的進(jìn)步及Sanger法測序反應(yīng)的不斷完善，至今DNA測序已大都采用Sanger法進(jìn)行。然而，Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進(jìn)行測序，可以分析DNA甲基化修飾情況，還可以通過化學(xué)保護(hù)及修飾等干擾實驗來研究DNA的二級結(jié)構(gòu)和DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，這些仍然是Maxam-Gilbert法所獨具的鮮明特點。當(dāng)然，如同雙脫氧終止法一樣，化學(xué)降解法測序的主要限制因素也是測序凝膠的分辨能力?；瘜W(xué)測序法一般都用32P標(biāo)記，所以與用32S標(biāo)記作標(biāo)記的末端終止法相比，它顯示的條帶較寬且有擴(kuò)散現(xiàn)象，這限制了化學(xué)降解法在對較大DNA片段測序時的分辨能力。一般一塊電泳膠上最多能讀出200250核苷酸序列。然而，如果按2個相反的取向分別從DNA片段的兩端進(jìn)行測序，則可克服這一不足。三、DNA序列分析的自動化雙脫氧終止法和化學(xué)降解法自1997年提出并的逐漸完善，無疑是目前公認(rèn)的二種最通用、最有效的DNA序列分析方法，Sanger、Maxam和Gilbert等人也因此分享了1979年度諾貝爾化學(xué)獎。但實際操作中都存在一些共同的問題，如放射性核素的污染，操作步驟繁瑣、效率低和速度慢等缺點，特別是結(jié)果判斷的讀片過程實在是費(fèi)時又乏味的工作。隨著計算機(jī)軟件技術(shù)、儀器制造和分子生物學(xué)研究的迅速發(fā)展，DNA自動化測序技術(shù)取得了突破性進(jìn)展，以其簡單（自動化）、安全（非同位素）、精確（計算機(jī)控制）和快速等優(yōu)點，已成為今天DNA序列分析的主流。DNA序列分析的自動化包括兩個方面的內(nèi)容，一是指“分析反應(yīng)”的自動化，更重要的一方面則是指反應(yīng)產(chǎn)物（標(biāo)記DNA片段）分析的自動化。雖然各種DNA自動測序系統(tǒng)差別很大，但Sanger法所采用的DNA聚合酶和雙脫氧核苷酸鏈終止的原理，亦是現(xiàn)今自動化測序的最佳選擇方案。即大都沿用Sanger的雙脫氧核苷酸鏈終止法原理進(jìn)行測序反應(yīng)，主要的差別在于非放射性標(biāo)記物和反應(yīng)產(chǎn)物（標(biāo)記DNA片段）分析系統(tǒng)。僅舉例簡介其基本原理： ALF全自動激光熒光DNA測序系統(tǒng)ALF自動DNA測序系統(tǒng)，是由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實驗室（EMBL）等提出和設(shè)計的。該系統(tǒng)采用非放射性的單一Cy5熒光素標(biāo)記測序引物。沿用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行反應(yīng)，分別生成4組終止于不同種類堿基、帶有Cy5熒光素標(biāo)記的DNA片段。A、G、C和T四組反應(yīng)物在變性凝膠上電泳，每個泳道都有一個由激光槍和探測器組成的檢測裝置，當(dāng)Cy5熒光素標(biāo)記的DNA條帶遷移至探測區(qū)并遇上激光時，熒光標(biāo)記被激活并釋放出光信號，光信號由光探測器接收；最后電腦將收集到的信號（原始數(shù)據(jù)）進(jìn)行處理，獲得樣品DNA的最終序列。ALF系統(tǒng)包括電源、電泳系統(tǒng)、探測系統(tǒng)、驅(qū)控系統(tǒng)（計算機(jī)）和輸出設(shè)備（繪圖儀）等。與傳統(tǒng)的手工操作測序相比，ALF系統(tǒng)能直接獲取原始數(shù)據(jù)并及時加以處理。該系統(tǒng)在儀器硬件和驅(qū)動軟件的設(shè)計上都進(jìn)行了不斷的改進(jìn)，近年推出了ALF expressTM全自動激光熒光DNA測序儀。該儀器設(shè)計獨特，可提供快速可靠的核酸測序、片段分析和突變檢測。目前廣泛應(yīng)用于人類基因組計劃，在此種大規(guī)模序列測定中，該儀器起到了重要的初篩作用。 ABI型全自動DNA測序儀ABI測序儀是由Perkin Elmer（PE公司）推出的DNA自動化測序儀。其特點是采用專利的4種熒光染料分別標(biāo)記終止物ddNTP或引物，經(jīng)Sanger測序反應(yīng)后，反應(yīng)產(chǎn)物3端（標(biāo)記終止物法）或5端（標(biāo)記引物法）帶有不同的熒光標(biāo)記。一個樣品的4個測序反應(yīng)產(chǎn)物可在同一泳道內(nèi)電泳，從而降低測序泳道間遷移率差異對精確性的影響。通過電泳將各個熒光標(biāo)記片段分開，同時激光檢測器同步掃描，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD（charge-coupled device）攝影機(jī)上同步成像。電腦可在電泳過程中對儀器運(yùn)行情況進(jìn)行同步檢測，結(jié)果能以電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種方式輸出。ABI測序儀包括電泳系統(tǒng)、激光檢測裝置、power Macintosh型蘋果電腦、HP1600CM型彩色打印機(jī)、DNA序列分析軟件以及DNA片段大小和定量分析軟件（Gene ScanTM）。該系統(tǒng)采用電腦單點控制整個DNA測序儀，包括電泳參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)分析及結(jié)果輸出等。目前PE公司已生產(chǎn)出377,373,310和3700型DNA測序儀。377型全自動DNA測序儀為最新產(chǎn)品，具有可一次測定多個樣品（64個以上）、測序精確度高和每個樣品判讀序列長（約700bp）等優(yōu)點。測序速度高達(dá)200bp/h，比373型效率提高了許多。ABI測序儀在人類基因組測序和cDNA測序研究中應(yīng)用最為廣泛。此外，亦可以使用各種輔助軟件進(jìn)行DNA定量分析和大小分析，故可廣泛應(yīng)用于基因突變分析（SSCP）、DNA指紋圖譜分析、基因連鎖圖譜分析及基因表達(dá)水平分析等。四、測序策略盡管核酸序列測定方法越來越成熟、簡便并且可以自動化，但事實上，對于一個片段較長、序列未知的待測核酸而言，仍然是一件耗時且繁瑣的工作。對于一個待測DNA分子，要制定一個能夠簡捷準(zhǔn)確的測定方案，一般可以從以下幾個方面考慮： DNA片段大小。 背景資料：是否清楚DNA限制性酶切圖譜，是否有一段已知序列，是否具有重復(fù)序列等。 測序目的：測定未知序列；確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu)；對突變（如點突變）進(jìn)行定位和鑒定；比較性研究，如比較同種病毒不同株系之間的基因差異。后3種測序目的稱為確證性測序。 實驗條件：如手工測序還是自動化測序，合成引物費(fèi)用等。由于單套測序反應(yīng)所能準(zhǔn)確測定的DNA序列最長一般僅400500bp。因此，在進(jìn)行序列測定之前，必須首先考慮待測DNA分子的大小，其次是所要測定的序列范圍以及要求的序列精確程度等，再結(jié)合實驗室的條件選擇切實可行的克隆及測序方案。 確證性測序策略多數(shù)情況下，測序是對已知序列的次級克隆進(jìn)行鑒定和證實（即確證性測序），如次級克隆DNA的插入方向、定點突變的檢測、刪切產(chǎn)物的鑒定和待表達(dá)基因閱讀框架的調(diào)整等。這類