亞硝化菌的種類,生長特,亞硝化過程與機理.doc

亞硝化菌的種類，生長特性，亞硝化過程與機理摘要：從亞硝化細菌的生長特性出發(fā)，主要介紹了亞硝化細菌的種類，包括亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化螺菌屬、亞硝化葉菌屬、亞硝化弧菌屬，并探討了亞硝化過程中的氧化和生化機理。關鍵詞：亞硝化菌，亞硝化作用，機理1 亞硝化細菌生長特性亞硝化細菌又叫氨氧化細菌，有自養(yǎng)型與異氧型之分，一般認為自養(yǎng)型氨氧化細菌是硝化作用的主要菌群。所有自養(yǎng)型氨氧化細菌，都是革蘭氏陰性細菌，自養(yǎng)生長時，以氨為唯一能源，以CO2為唯一碳源；混合營養(yǎng)生長時，可同化有機物質。亞硝酸細菌的生長極為緩慢。在適宜的條件下需 24h 才能完成一次分裂周期。在進行固體培養(yǎng)的過程中一般需數(shù)月才能見到菌落生長1。亞硝酸細菌喜歡微偏堿性的環(huán)境，適合大多數(shù)氨氧化細菌生長的條件為：溫度25-30，pH 7.5-8.0，氨濃度2-10mmol/L。倍增時間8小時至數(shù)天。在純培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中若加入有機物質如酵母提取物等將會抑制亞硝酸細菌的生長，因此在進行亞硝酸細菌的分離培養(yǎng)時所培養(yǎng)分離的細菌的純度可利用在培養(yǎng)基中加入(酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等)有機物的方法進行檢測2。但是自然環(huán)境中有機物質對亞硝酸細菌的影響不如在純培養(yǎng)中的大大亞硝酸細菌對污水組成、pH和溫度等的改變都敏感3。2亞硝酸細菌的分類亞硝酸細菌的分類主要根據(jù)細菌形態(tài)的表型特征、細胞內細胞質膜的分布及它們16SRNA 序列的同源性。1984-1989 年的伯杰氏細菌系統(tǒng)分類學把硝化細菌分為九個屬：硝化桿菌屬、硝化刺菌屬、硝化球菌屬、硝化螺菌屬、亞硝化單胞菌屬、亞硝化螺菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化葉菌屬和亞硝化弧菌屬等。而目前則傾向于把亞硝酸細菌分為兩個單一細胞起源的群體，它們分別屬于變形菌綱的亞綱和亞綱。在對這兩個亞綱的亞硝酸細菌作進一步的分類時，不同的學者還有些細微的差別。Votek 等認為除了海洋亞硝酸球菌屬于變形菌亞綱外，其它的亞硝酸細菌即亞硝酸單孢菌和亞硝酸螺旋菌兩個種群屬于變形菌亞綱。其中亞硝酸單孢菌包括歐洲亞硝酸單孢菌和亞硝酸運動球菌，亞硝酸螺旋菌包括亞硝酸螺旋菌屬、亞硝酸顫菌屬和亞硝酸葉菌屬2。這種分類方法可用圖1表示。圖1 Votek 亞硝酸細菌分類法Philips等認為海洋亞硝化球菌和 N. halophilus屬于變形菌亞綱，其它的亞硝酸細菌屬于變形菌亞綱，包括亞硝化單孢菌屬和亞硝化螺旋菌屬4。Juretschko 同樣認為海洋亞硝化球菌和 N.halophilus 屬于變形菌亞綱，但是他認為于變形菌亞綱亞硝酸細菌應包括四個屬，即亞硝化單胞菌屬、亞硝化螺菌屬、亞硝化葉菌屬和亞硝化弧菌屬，而且后三個屬彼此關系密切5。除了亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)外，其它能把氨氧化成亞硝酸的細菌屬包括亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝化球菌屬 （Nitrosococcus）、亞硝化 弧 菌 屬 （Nitrosovibrio）、亞硝化葉菌屬（Nitrosolobus）、亞硝化膠團菌屬（Nitrosogloea）、亞硝化囊菌屬（Nitrosocystis）。土壤生境中常見的是亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化葉菌屬、亞硝化螺菌屬。海洋生境中常見的是亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化螺菌屬。鹽湖生境中則有亞硝化單胞菌屬6。2.1亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas) 7在亞硝化單胞菌屬中，N.europaea是最早被分離并描述的種。除此以外，已確定的種還有8個，隨著研究的深入，新種還會繼續(xù)增加。亞硝化單胞菌屬菌株呈桿狀或橢球狀。菌體單生，很少成鏈。菌體游離或包埋在黏液內。細胞有內膜，呈扁平泡囊，分布于四周。革蘭氏染色陰性，好氧生長。生長溫度范圍5-30 ，最適生長溫度30左右。生長pH值范圍5.8-8.5,最適生長Ph值范圍7.5-8.0。能量(主要指ATP)和還原力主要指NAD(P)H2來源于氨的氧化。許多菌株產生脲酶，能夠利用尿素。以CO2為碳源，進行自養(yǎng)生長；細胞擁有羧酶體(carboxysome)，內含Calvin循環(huán)中固定CO2的關鍵酶二磷酸核酮糖羧化酶。也能以CO2或有機物作為碳源，進行混養(yǎng)（混合營養(yǎng)）生長，但不能以有機物作為碳源，進行異氧生長。細胞產生豐富的細胞色素，使細胞懸液呈黃色或紅色。強光照和高氧分壓可抑制生長。2.2亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)Nitrosococcus包含N.oceanus、N.mobilis和N.halophilus三個種。菌體呈球狀至橢球狀，可以是單球菌、雙球菌和四聯(lián)球菌，常包埋于黏液內而形成菌膠團。細胞有內膜，呈扁平泡囊，分布于四周或堆積于中央。革蘭氏染色陰性。依靠叢生鞭毛或單生鞭毛運動。好氧生長。生長溫度范圍5-30，最適生長溫度30左右。生長pH 范圍6.0-8.0，最適生長Ph 范圍7.5-8.0。能量和還原力來源于氨的氧化。一些菌株產生脲酶，能夠利用尿素，能自養(yǎng)生長，也能混養(yǎng)生長，但不能異樣生長。細胞內含有豐富的細胞色素，使細胞懸液呈黃色或紅色。2.3亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)Nitrosospira只有N.briensis一個種。菌體呈螺旋狀，有3-20圈。細胞沒有內膜，也沒有羧酶體。革蘭氏染色陰性。好氧生長。生長溫度范圍20-35。生長pH范圍7.0-8.0。能量和還原力來源于氨的氧化。嚴格自養(yǎng)生長。細胞內含細胞色素，但不含其他色素。2.4亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)Nitrosolobus只有N.multiformis一個種。菌體形態(tài)多樣，裂片形細胞被內陷的細胞膜分隔，每個細胞有1-4個中心小室，其外面有5-20個膜結合的小室環(huán)繞。以縊縮的方式分裂。革蘭氏染色陰性。好氧生長。能量和還原力來源于氨的氧化。主要自養(yǎng)生長，也能混養(yǎng)生長，但不能異樣生長。最適生長溫度25-30。最適生長pH 7.5。2.5亞硝化弧菌屬(Nitrosmdbrio)Nitrosmdbrio只有N.tenuis一個種。菌體細長弧狀，細胞沒有內膜，羧酶體不明顯。革蘭氏染色陰性。嚴格好氧生長。最適生長Ph 范圍7.5-7.8。能量和還原力來源于氨的氧化。主要自養(yǎng)生長，也能混養(yǎng)生長，但不能異樣生長。表1 各種氨氧化細菌的特征特 征亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)亞硝化弧菌屬(Nitrosmdbrio)形 態(tài)桿狀至橢球狀球狀至橢球狀緊密螺旋狀多形狀細長弧狀鞭 毛極生至偏極生叢生或單生周生周生極生至偏極生細胞內膜排列方式呈扁平泡囊，分布于四周呈泡囊分布于四周或堆積于中央無內膜使細胞分隔無內膜菌體大小(0.7-1.5)*(1.0-2.4)(1.5-1.8)*(1.7-2.5)(0.3-0.8)*(1.0-8.0)(1.0-1.5)*(1.0-2.5)(0.3-0.4)*(1.1-3.0)G+C/%47.4-51.050.5-5154.153.9-59.154時代時間/h8-1224Ch.A化能無機營養(yǎng)化能無機營養(yǎng)化能無機營養(yǎng)化能無機營養(yǎng)化能無機營養(yǎng)儲存物多聚磷酸肝糖，多聚磷酸肝糖，多聚磷酸細胞色素,色素淡黃至淡紅淡黃至淡紅淡黃至淡紅淡黃至淡紅pH值范圍5.8-8.58.0-9.08.5-9.58.2-9.07.5-7.8溫度范圍/5-30(25-30)12-3015-30(20-35)115-3025-30 -521:為最適溫度范圍；2:為最低溫度范圍。3亞硝化反應過程與機理亞硝化作用則是硝化作用從 NH4+ 或NH3到 NO2- 的反應過程，是氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，由氨氧化細菌（NH3-oxidizers，又被稱為初級硝化細菌primary nitrifiers）、亞硝化細菌 （ammonia-oxidizingbacteria）來完成。生化氧化8： NH4+ + 1.5O2 + 2HCO3- 亞硝酸菌 NO2- + 2H2CO3 + （240-350kJ/mol） （1）生化合成： 13NH4+ + 23HCO3- 亞硝酸菌 10NO2- + 8H2CO3 + 3C5H7NO2 + 19H20 （2）則第一階段的總反應式（包括氧化和合成）為：55NH4+ + 76O2 +109HCO3- 亞硝酸菌 C5H7NO2 + 54NO2- +104H2CO3 + +57H20 （3）氨氧化細菌是一類化能自養(yǎng)型細菌，氨是其進行自養(yǎng)生長的唯一能源。從熱力學觀點來看，亞硝化細菌利用的基質為低級能源。相對于呼吸鏈上的電子載體而言，氨氧化的氧化還原電位值E0(NO2- / NH4+)= 340 mV，氧化磷酸化效率很低，所能產生的ATP非常有限。亞硝化細菌中不存在基質水平磷酸化，它們依靠氧化磷酸化來貯存能量。在 25 ，pH 7 的條件下，NH3 氧化為NO2- 的吉布斯自由能為 -274.7 kJ(mol N)-1，即使全部轉化為 ATP，最多僅產生8.4 mol ATP(mol NH4+)-1。NH3氧化所釋放的電子只能傳遞給呼吸鏈上較低端的物質，因此NH3的氧化反應不可能直接耦聯(lián)到呼吸鏈上第一個成分煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( nicotine amide dinucleotide,NAD )的還原反應，能量不得不用于使電子躍遷到這一較高能級，即用于所謂的逆電子流過程中。這些因素使得亞硝化細菌生長很緩慢，世代期為836 h，經過710 d的培養(yǎng)菌落很微小，大多直徑在100m 左右。利用相同數(shù)量的能量，亞硝化單胞菌所產生的細胞物質僅為異養(yǎng)菌的 1 %4 %，這是因為需要消耗ATP和還原力來還原CO26。但從生化水平上看，硝化作用遠非如此簡單，它涉及多種酶催化的代謝途徑，并伴隨著復雜的物質和能量轉化。在亞硝化細菌的作用下, 氨轉變?yōu)閬喯跛岬难趸^程中, 氮原子價從-3變至+3, 電子的移動達6個, 故必然會有中間產物, 但中間產物究竟有幾個, 現(xiàn)仍不大清楚現(xiàn)已證明, 其中一種中間體是羥胺（NH2OH），認為由羥胺進一步氧化成亞硝酸必需經過兩個階段, 即羥胺脫氫形成像硝酰(NOH)那樣的氧化態(tài)中間體, 然后在酶的作用下由硝酰轉變成亞硝酸。而亞硝酸在硝化細菌的作用下可直接氧化成NO3-9。亞硝化作用涉及多種酶催化的代謝途徑，即為：NH3 氨單加氧酶 NH2OH 羥胺氧還酶 NO 羥胺氧還酶 NO2- 。氨氧化為羥胺的生化反應可表示為7 ：NH3 + 0.5O2 NH2OH G = +17 kJ/ mol （4）0.5O2 +2H+ +2e- H2O G = -137 kJ/ mol （5）NH3 + O2 + 2H 氨單加氧酶 NH2OH + H2O G = -120kJ/ mol （6）根據(jù)化學反應的自由能變化判斷，在標準狀態(tài)下，氨的羥化反應不易進行（4）式；需要氧的還原反應（5）式來拉動。只有當兩個反應耦合時（6）式氨的氧化才能順利進行。羥胺氧化成亞硝酸鹽被認為是一個分兩步進行的反應，中間產物可能是與酶結合的HNO，也可能是NO。羥胺氧化為亞硝酸鹽的生化反應可表示為7 ：NH2OH + 5H2O HNO2 + 4H+ +4e- G =+23 kJ/ mol0.5O2 + 2H+ + 2e- H2O G =-137 kJ/ molNH2OH +0.5O2 羥胺氧還酶 HNO2 + 2H+ + 2e- G =-114 kJ/ mol首先在氨單加氧酶( AMO)的催化下將氨氧化成羥氨，再經羥氨氧化還原酶（HAO）的催化下將羥氨氧化成亞硝酸，進而由硝化細菌的亞硝酸鹽氧化還原酶催化形成硝酸10。圖2 亞硝化菌的氨氧化機制參考文獻1 Nejidat A ,et al. 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