基因工程重點(diǎn).docx

名詞解釋：1 基因工程：狹義的基因工程：是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳，表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀。廣義的基因工程：是指DNA重組技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)：基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即DNA重組技術(shù)）；下游技術(shù)：基因工程菌（細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化過程。2DNA重組技術(shù)：除少數(shù)RNA病毒外，幾乎所有的基因都存在于DNA結(jié)構(gòu)中，而用于外源基因重組拼接的載體也都是DNA分子，因此基因工程也稱為DNA重組技術(shù)。3基因組文庫：將某種生物基因組DNA經(jīng)超聲波或限制酶部分酶切處理后，與載體連接，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因的克隆群體。4cDNA文庫：將某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，與載體連接，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的克隆群體。5PCR(polymerase chain reaction)：利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-退火-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍的操作技術(shù)。6Southern印跡雜交：是將DNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。7基因診斷：通過檢測致病基因（包括內(nèi)源基因與外源基因）的存在、量的多少，結(jié)構(gòu)變化與否、表達(dá)水平是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診的依據(jù)。8基因治療(gene therapy)：指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕?，通過一定方式導(dǎo)入人體細(xì)胞，以糾正基因的缺陷或發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物高技術(shù)。9轉(zhuǎn)基因動物：是人類按自己的意愿，借助基因工程技術(shù)，將外源基因?qū)雱游锸芫?，有目的、有?jì)劃、有根據(jù)、有預(yù)見地改變動物的遺傳組成，使外源基因與動物基因組整合、在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)并能穩(wěn)定遺傳給后代的動物。10轉(zhuǎn)基因技術(shù)：將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體性狀的可遺傳修飾，這一技術(shù)稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。簡答題：一基因工程的基本原理：基因工程的主體戰(zhàn)略思想是外源基因的穩(wěn)定高效表達(dá)。分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)工程學(xué)是基因工程原理的三大基石。1、提高外源基因的劑量DNA復(fù)制及穩(wěn)定遺傳的分子遺傳學(xué)原理。2、篩選、修飾、重組基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件基因表達(dá)調(diào)控的分子生物學(xué)原理。3、篩選、修飾、重組mRNA翻譯調(diào)控元件基因表達(dá)調(diào)控的分子生物學(xué)原理。4、基因工程菌(細(xì)胞)的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn) 生物化學(xué)工程學(xué)的基本原理。二、基因工程的理論依據(jù)1、不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)2、基因是可切割的3、基因是可以轉(zhuǎn)移的4、多肽和基因之間存在對應(yīng)關(guān)系5、遺傳密碼是通用的6、基因可通過復(fù)制把遺傳信息傳給下一代三雙脫氧鏈末端終止法的原理1）在單鏈模板、引物、4種dNTPs存在時(shí)，Klenow酶能不斷地將dNTP加到引物3-OH末端，合成出與單鏈模板互補(bǔ)的新鏈。2）Klenow酶還能以ddNTP作為底物，使之摻入正在延伸的DNA鏈中，但因ddNTP缺少3-OH，無法和下一個(gè)核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，故在ddNTP摻入位置，鏈延長終止。四基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：除盡可能高的完備性外，理想的基因文庫還應(yīng)具備：1克隆總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；2載體的裝載量必須大于基因的長度；3含有相鄰DNA片段的重組克隆之間，需存在足夠長度的重疊區(qū)，以利于克隆排序；4克隆片段易于從載體分子上完整卸下；5重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選。五PCR引物設(shè)計(jì)原則：1長度適宜，一般15-30bp；2G+C含量40-60；34種堿基應(yīng)隨機(jī)分布；4內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；5兩條引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)堿基的互補(bǔ)；63端不應(yīng)有任何修飾；75端可修飾，如32P、生物素、熒光素。六寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則：1長度18-50bp；2G+C含量40-60%；3分子內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū)；4避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè)） ；5與非靶序列70%以上同源性、或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。七基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)主要為重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，包括結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性和分配不穩(wěn)定性。工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制：1受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源DNA的降解。2外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝。3受體細(xì)胞的內(nèi)源性轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組DNA的缺失、重排。4重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配。八選擇分離純化方法時(shí)，應(yīng)遵循下列原則：1選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)合使用；2盡量選擇高效的分離方法；3首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法；4將最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離純化方法排在最后。九酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢：1全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理清楚，遺傳操作簡便。2具有真核生物蛋白翻譯后加工修飾系統(tǒng)。3能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中。4大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單、成本低廉。5不含特異性病毒、不產(chǎn)毒素，被美國FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)。酵母菌表達(dá)外源基因的缺點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物的糖基化位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與高等真核生物有差距。十乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)1）產(chǎn)量高：2）活性高：表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過充分的翻譯后修飾加工，如糖基化、磷酸化和羧基化等，具有穩(wěn)定的生物活性。3）成本低：不需昂貴的生產(chǎn)設(shè)備（如發(fā)酵罐），動物飼養(yǎng)、繁殖成本比較低。4）周期短：5）效益高：論述題一什么是密碼子的偏愛性，生物體對密碼子偏愛性的決定因素是什么？怎樣進(jìn)行糾正？（1）生物體對密碼子的偏愛性：不同生物、甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子的使用頻率不同，具有一定的偏愛性。（2）生物體對密碼子偏愛性的決定因素： 生物基因組中的堿基含量：在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體fX174）基因組中，密碼子第3位上U和A出現(xiàn)頻率較高。在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第3位上含G或C的簡并密碼子占90%以上。 密碼子與反密碼子相互作用的自由能：適中的作用強(qiáng)度有利于蛋白質(zhì)生物合成的迅速進(jìn)行。弱配對作用可能使氨?；鵷RNA進(jìn)入核糖體A位需要花費(fèi)更多的時(shí)間。強(qiáng)配對作用則可能使轉(zhuǎn)肽后核糖體在P位逐出空載tRNA分子耗費(fèi)更多的時(shí)間。 細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量：簡并密碼子使用頻率與相應(yīng)tRNA的豐度呈正相關(guān)。表達(dá)量高的基因含有較少種類的密碼子，這些密碼子又對應(yīng)于高豐度的tRNA分子，以便細(xì)胞能以更快的速度合成需求量大的蛋白質(zhì)。對于需求量少的蛋白質(zhì)，其基因含有較多與低豐度tRNA相對應(yīng)的密碼子，用于控制該蛋白質(zhì)的合成速度。密碼子偏愛性對外源基因表達(dá)的影響：原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率有較大差異，因此哺乳動物基因在E.coli中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。 （3）使外源基因上的密碼子在E.coli中獲得最佳表達(dá)的策略： 外源基因全合成：按E.coli密碼子的偏愛性規(guī)律，更換外源基因中不適宜的簡并密碼子。 同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因：對于那些含有密碼子種類單一，出現(xiàn)頻率較高，而本身分子量又較大的外源基因，則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略。二鼠源單抗的缺點(diǎn)及其改進(jìn)措施鼠源單克隆抗體的缺點(diǎn)：1重復(fù)用藥會產(chǎn)生抗鼠抗體，降低療效；2分子量大，在體內(nèi)穿透血管的能力差；3生產(chǎn)成本高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。解決措施：通過基因工程，將鼠源單克隆抗體進(jìn)行改造?；蚬こ炭贵w：采用基因工程方法，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后，導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體?；蚬こ炭贵w分類：人源化抗體（嵌合抗體，改型抗體，完全人源化抗體）小分子抗體（Fab抗體，單鏈抗體，單域抗體，超變區(qū)多肽抗體）1人源化抗體：1）嵌合抗體(chimeric antibody)：從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體。特點(diǎn)：降低了鼠源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。2）改型抗體(reshaped antibody,Rab)：為降低來自鼠可變區(qū)中骨架區(qū)的免疫原性，Winter克隆出鼠源抗體中與抗原結(jié)合的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)基因，以置換人抗體中的相應(yīng)序列。特點(diǎn)：絕大部分為人源性，只有CDR區(qū)來自小鼠，又稱CDR移植抗體，對人體幾乎無免疫原性。3）完全人源化抗體：以人的抗體基因置換小鼠的全套抗體基因，通過抗原物質(zhì)刺激小鼠，表達(dá)出人源特異性抗體。2小分子抗體：是具有抗原結(jié)合功能的小分子片段，是針對完整抗體的分子量大、不易透過血管壁等不足而進(jìn)行改進(jìn)的。1）Fab抗體：由重鏈VH區(qū)及CH1區(qū)與輕鏈以二硫鍵形式連接而成，大小只有完整抗體的1/3，具有完整抗體完全相同的抗原結(jié)合能力。2）單鏈抗體(single chain of Fv, ScFv)：由抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)(VH和VL)通過連接肽重組并表達(dá)的一種抗體，大小只有完整抗體的1/6。特點(diǎn)：抗原結(jié)合能力好、分子量小、穿透性強(qiáng)，體內(nèi)循環(huán)半衰期短，免疫原性低。3）單域抗體：只有V區(qū)基因小片段，分子量僅為完整抗體的1/12。4）超變區(qū)多肽抗體：根據(jù)抗體分子中與抗原特異性結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列，設(shè)計(jì)具有對特異性抗原識別與結(jié)合的多肽分子，一般只有幾十個(gè)氨基酸。三基因工程的應(yīng)用A. 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用：（一）基因工程藥物：基因工程被用于大量生產(chǎn)過去難以得到或幾乎不可能得到的蛋白質(zhì)-肽類藥物。基因工程疫苗將幫助人類徹底戰(zhàn)勝疫?。ǘ┗蛟\斷（三）基因治療B、在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用 （一）轉(zhuǎn)基因植物：抗病蟲害，抗逆，提高產(chǎn)量，改良品質(zhì)，提高固氮效率，藥物和疫苗的新載體，提高花卉的觀賞價(jià)值（二）轉(zhuǎn)基因動物：生產(chǎn)藥物，人工改良牛奶，培育動物優(yōu)良品系，器官移植，觀賞動物C、在工業(yè)上的應(yīng)用： 制藥工業(yè)，食品工業(yè)，酶制劑工業(yè)，釀酒工業(yè)，冶金工業(yè)D、在能源和環(huán)保上的應(yīng)用（一）解決能源危機(jī)（乙醇-最有希望的替代能源；氫氣或沼氣-白色能源；石油-黑色能源）（二）環(huán)境保護(hù)：環(huán)境監(jiān)測，環(huán)境污染治理（構(gòu)建能降解有機(jī)污染物的工程菌，分解石油、吞噬汞、降解土壤中的DDT。）E基因工程對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響（提高生命質(zhì)量，延長人類壽命、改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，解決食品短缺、制造工業(yè)原料，生產(chǎn)貴重金屬、解決能源危機(jī)，治理環(huán)境污染）四談?wù)劵蚬こ淌且话央p刃劍（一）基因工程的應(yīng)用（同上）（二）基因工程的安全性問題1、將外源基因引入人體，可能會破壞細(xì)胞生長的重要基因，也可能會激活原癌基因。2、基因工程改造微生物，可能會導(dǎo)致一些致病性極強(qiáng)、難以控制新型病原