中藥藥理毒理研究技術(shù)規(guī)范若干問題的探討.ppt

中藥藥效毒理研究技術(shù)規(guī)范若干問題的探討 北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥藥理系孫建寧教授 中藥藥效評價的現(xiàn)狀與探索 中藥新藥的基本要求是安全 有效 可控和穩(wěn)定 侯選樣品 藥效學 侯選藥物毒性研究 藥效學研究的基本目的 一 通過藥效學研究確定有效性是否有效 作用的強弱 優(yōu)缺點和特色 確定有無開發(fā)前景 重視前期藥效的篩選 力求得到較準確的藥效評價 設法找出主要藥效學的特點 有效作用劑量范圍 量效關(guān)系 有效作用時間長短 時效關(guān)系 二 提高臨床療效應充分運用現(xiàn)代科學特別是現(xiàn)代醫(yī)學的理論 方法和手段 制定科學 嚴密 具有中醫(yī)藥特點的試驗計劃 建立與臨床相符的 病 癥 或 證 相似的動物模型與指標 對新藥的有效性作出科學的評價 藥效研究參考資料 1 中藥新藥研究指南 藥學藥理學毒理學 中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局 1994 66 672 中藥新藥研制開發(fā)技術(shù)與方法王北嬰 李儀奎主編上?？茖W技術(shù)出版社2001 123 中藥復方研究思路與方法 2004年出版 4 中藥藥理研究方法學陳奇主編人民衛(wèi)生出版社 1993年版 新版待出 5 中藥藥理方法學李儀奎主編上海科學技術(shù)出版社19916 國內(nèi)外研究論文 二 藥效學研究的基本要求 試驗負責人受試藥物研究單位實驗動物試驗記錄統(tǒng)計處理 三 藥效學研究的方法及注意事項 1 實驗設計符合中藥特點 符合國家新藥研究申報的有關(guān)規(guī)定 隨機 對照 重復重視中藥復方配伍規(guī)律性的研究 1 單味研究法 2 藥對研究法 3 藥物組間關(guān)系法 4 撤藥分析法 5 聚類分析法 6 正交設計法 7 正交t值法 8 均勻設計法 9 量效關(guān)系法 撤藥分析法 從復方中撤出一味或一組藥進行實驗黃芩湯 黃芩 芍藥 甘草 大棗結(jié)果 減黃芩顯著影響藥效 分別減芍藥 甘草 大棗變化不大 說明君藥在全方中起主導地位 均勻設計法 按均勻設計表安排 實驗次數(shù)與各因素所取水平數(shù)相等 如治療感染復方 五種中藥X1 X2 X3 X4 X5 根據(jù)因素與水平 選用U11表設計 結(jié)果算得回歸方程 有顯著性意義 從標準相關(guān)系數(shù)可看出藥物 抗炎 作用大小 進行優(yōu)選 量效關(guān)系法 四君子湯 黨參 白術(shù) 茯苓 甘草1 1 1 0 5巨噬細胞吞噬功能增強 調(diào)整甘草到1 3 功能減弱 當歸補血湯 黃芪 當歸5 1免疫增強作用 調(diào)整黃芪劑量 1 2 2 4倍 均作用不明顯 2 動物選擇種類 實驗常用小鼠和大鼠 豚鼠 家兔 狗品系動物等級 二級動物即清潔動物 CL 性別 一般試驗選用雌雄各半動物 數(shù)量 一般小鼠不得少于10只 大鼠為8只 貓 狗為4只以上 3 方法的選擇 一 根據(jù)主治 參考功能 選擇試驗方法針對性強 重點突出 主次分明 如缺血性中風 1 增加缺血區(qū)腦血流量2 神經(jīng)細胞的保護治療 中藥治療缺血性中風主要藥效學研究方案 一 對腦缺血試驗選用大鼠大腦中動脈血栓模型 middlecerebralarterythrombosis MCAT 和雙側(cè)頸總動脈阻斷致不完全性腦缺 觀察連續(xù)給藥2 3天對局部腦缺血和不完全性全腦缺血性損傷的保護作用 1 大鼠神經(jīng)癥狀檢測 根據(jù)改進的Bedorson等人的分級打分法記分 2 對MCAT大鼠腦水腫的影響 分別稱量腦缺血側(cè)和非缺血側(cè)腦組織濕重和干重 以腦水含量百分比為指標 3 藥物對MCAT大鼠腦梗塞范圍的影響 采用TTC染色法 以梗塞組織重量占總腦重量的百分比為指標 4 生化指標 包括能量代謝和毒性產(chǎn)物 如三磷酸腺苷 ATPase 磷酸肌酸 Per 乳酸 LA 乳酸脫氫酶 LDH 自由脂肪酸 FFA 脂質(zhì)過氧化物 LPO 興奮性氨基酸 EAA 及基因表達等 5 藥物對模型大鼠腦組織病理改變的影響 采用HE染色和尼氏體染色法 以病理切片尼氏體數(shù)量和神經(jīng)細胞形態(tài)為指標 二 血流動力學試驗采用麻醉犬進行試驗 用電磁流量計測頸內(nèi)動脈血流量 腦血管阻力 血壓 心電圖和心率 觀察受試藥物對腦血管及腦血流量的影響 三 毛細血管通透性試驗 試驗用大鼠 采用比色法觀察藥物對伊文思藍等染料通透性的影響 四 抗血栓形成試驗和溶栓試驗 1 大鼠動 靜脈旁路血栓形成試驗 以血栓濕重和干重為指標 2 溶栓試驗 體外試驗 血清藥理 新鮮血塊溶解試驗 指標為給藥前 后血塊重量并計算血塊溶解百分率 五 血小板聚集試驗 實驗用大鼠或家兔 觀察受試藥物對ADP 膠原所致血小板聚集的抑制作用 六 藥物對血液凝固性的影響 凝血時間 凝血酶時間 TT 凝血酶原時間 PT 和部分凝血活酶時間 APTT 二 采用能夠反映中藥特點的試驗方法及動物模型 抗病毒感染中藥復方研究實驗設計急性感染期用藥1 對病原體的抑制作用2 對癥治療退熱作用抗?jié)B出抗炎作用抗肺纖維化作用抗多臟衰作用 1 感病毒所致小鼠肺炎的保護作用 選擇流感病毒肺炎模型 以肺指數(shù) 死亡率 血清NO含量為觀察指標 2 抗高熱作用 對毒素所致家兔發(fā)熱模型的退熱作用 酵母所致大鼠發(fā)熱模型的退熱作用 3 抗?jié)B出 抗炎 選擇油酸致呼吸窘迫癥模型油觀察所選藥物對呼吸功能的影響 4 對吸入性肺炎的保護作用 選擇內(nèi)毒素吸入性肺炎損傷模型以BALF中彈性蛋白酶 蛋白含量為觀察指標 5 抗炎作用 急性炎癥 對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 常規(guī)藥理試驗 對角叉菜膠所致大鼠足腫脹的影響 常規(guī)藥理試驗 6 對內(nèi)毒素所致大鼠多臟器衰竭的保護作用 選擇內(nèi)毒素或角叉菜膠多臟器損傷模型觀察所選藥物對重要臟器的保護作用 評價指標 生化指標 ALT AST GREA BUN 臟器指數(shù) 心 肝 脾 肺 腎 血象測定 WBC及分類 RBC PLT 凝血時間 恢復期用藥1 對過量甲狀腺激素所致陰虛模型的改善作用2 對過量皮質(zhì)激素所致陰虛模型的改善作用3 對過量皮質(zhì)激素所致消化道功能障礙的改善作用4 強壯作用 以耐缺氧時間 小鼠游泳時間為觀察指標5 對免疫功能的影響 三 主要藥效為主 配合輔助試驗治療神經(jīng)根型頸椎病主要藥效 1 對神經(jīng)根無菌性炎癥模型的影響 1 一般行為學 步態(tài) 患肢運動等 肌張力 感覺 觸覺 痛覺 2 神經(jīng)電生理檢測 測定神經(jīng)纖維的傳導速度 觀察藥物的改善作用 3 神經(jīng)纖維軸索計數(shù)和再生率 觀察藥物對損傷神經(jīng)的再生作用 4 對致炎物重量的影響 觀察藥物對模型動物致炎物重量的抑制作用 2 對模型鼠腦組織內(nèi)cAMP與cGMP的影響 3 病理組織學檢查 異物巨細胞反應 肉芽組織 炎性細胞等 2 抗炎作用3 鎮(zhèn)痛作用 對血液流變學的影響采用血瘀大鼠模型 測定全血粘度 血漿粘度 紅細胞壓積 紅細胞聚集性 紅細胞變形性 觀察藥物對血液流變學的作用 初步分析該方治療神經(jīng)根性頸椎病的作用環(huán)節(jié) 四 整體和離體方法選擇中藥由于成分復雜 特別是復方粗制劑 為多種化學成分 或有效部位 的混合體 除有效成分外 尚有一些無關(guān)成分及干擾成分 因此 藥效學試驗應以體內(nèi)試驗為主 體外試驗為輔 以消化道給藥為主 其他給藥途徑為輔 若為中藥有效成分 或部位 制劑較純者 或臨床為注射給藥者 可用體外試驗或注射給藥進行主要藥效學試驗 4 指標的選擇 一 特異性強 二 敏感性高 三 重現(xiàn)性好 四 客觀性 五 定量指標 六 多指標綜合運用 生理 生化 形態(tài)等各類指標合理搭配 綜合運用 5 試驗組給藥劑量 一 根據(jù)半數(shù)致死量 LD50 計算凡是能夠測出LD50者 可用其1 10 1 20 1 30 1 40等相近劑量 作為藥效學試驗的高中低劑量組 二 根據(jù)臨床用量計算其粗略的等效倍數(shù)為1 人 3 狗 猴 5 貓 兔 7 大鼠 豚鼠 10 11 小鼠 三 根據(jù)文獻估計劑量 四 根據(jù)體表面積估計劑量根據(jù)體表面積折算法換算的同等體表面積 m2 cm2 單位時的劑量 6 給藥方式7 對照藥的選擇 一 陽性對照藥1 可比性 其功用 主治 劑型 給藥途徑應與新藥相似2 合法性 陽性藥應是國家 中國藥典 或部頒標準 或新批準生產(chǎn)的合法藥物3 擇優(yōu)選用 學術(shù)界或社會公認有效的 有代表性的 好 藥 二 原劑型對照改劑型新藥的陽性對照藥 三 空白對照品 四 隨著科學技術(shù)發(fā)展涌現(xiàn)出中藥復方藥效研究的創(chuàng)新思路和方法 一 建立中醫(yī)藥信息系統(tǒng) 將大大提高中藥復方藥效的研究效率中醫(yī)藥信息系統(tǒng) 方劑庫 藥用植物庫 中藥有效成分三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫及靶酶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 二 引入基因組學與蛋白質(zhì)組學及基因芯片技術(shù)中藥復方突出的特點是活性多組分 作用多靶點 多途徑 突出多層次 多臟器 多水平調(diào)理過程 復制證的動物模型 基因芯片對中藥復方研究和中藥藥物篩選 指通過用藥前后表達譜的變化 找出靶基因及受靶基因調(diào)控的基因 培養(yǎng)的人細胞 細胞水平 和動物模型 整體水平 兩種方法相互參照和比較 中藥的毒性及安全性研究 一 藥物毒理學的研究目的1 量化人體安全用藥的劑量和時程 包括中毒劑量及其與有效劑量的比值 安全劑量范圍 服藥周期2 毒性反應的表現(xiàn)和特點 急性毒性反應 慢性毒性反應 或蓄積性 毒性反應可逆與否等 毒性的靶器官及作用機理 3 毒性成分的體內(nèi)過程或毒代動力學研究4 毒理學方法學的研究5 毒性反應的預防 治療 6 如何將動物毒理學數(shù)據(jù)外延或推論到人體 嚙齒和非嚙齒兩種動物進行毒理學試驗 它們所表現(xiàn)出來的毒性反應和人體的毒性反應之間的一致性有約70 的概率 而單用嚙齒動物所作的毒性試 其和人的一致性概率僅為43 單用非嚙齒動物的一致性概率為63 1 一致性 94 的人體毒性反應可在給藥和觀察周期為一個月的動物試驗中發(fā)現(xiàn) 多數(shù)人體毒性反應可在單次給藥的毒性試驗中發(fā)現(xiàn) 25 的人體毒性反應可在安全性藥理學 一般藥理學 實驗中發(fā)現(xiàn) 2 不一致性 貫葉連翹對不同動物生殖系統(tǒng)的影響不一致 二 中藥毒理學研究內(nèi)容 1 急性 單次給藥 毒性試驗2 長期 慢性或重復給藥 毒性試驗3 一般藥理學 安全性藥理學 試驗4 三致 試驗 遺傳毒性 生殖毒性 致癌性 5 免疫學毒性試驗6 藥物依賴性試驗7 局部 皮膚 黏膜 給藥的毒性試驗8 注射劑的制劑安全性試驗 局部刺激 過敏試驗 溶血試驗 9 毒代動力學研究10 其它 光敏試驗等 三 毒性安全性評價中的注意事項 一般藥理學試驗研究 安全性藥理 Safetypharmacology 研究目的 通過一般藥理學研究 可以確定受試物非期望出現(xiàn)藥物效應的情況 它可能關(guān)系到人的安全性 評價受試物在毒理學和 或臨床研究中觀察到的藥物不良反應和 或病理生理作用 研究所觀察到的和 或推測的藥物不良反應機制 通過一般藥理學研究 它可為長期毒性試驗設計提供參考 為臨床研究和安全用藥提供信息 為開發(fā)新的適應癥提供信息 一 受試物 建議受試物采用制備工藝穩(wěn)定 符合臨床試用質(zhì)量標準規(guī)定的中試樣品 并注明受試物的名稱 來源 批號 含量 或規(guī)格 保存條件及配制方法等 如不采用中試樣品 應有充分的理由 如果由于給藥容積或給藥方法限制 可采用原料藥 提取物 進行試驗 二 劑量設置中 高劑量應高于藥效學的有效劑量 并與低劑量呈倍數(shù)關(guān)系 應設至少4個劑量組三 試驗指標的選擇 一 心血管系統(tǒng)測定并記錄給藥前后血壓 包括收縮壓 舒張壓和平均壓 心電圖 包括QT間期 PR間期 QRS波 ST段和QRS波等 和心率等的變化 治療劑量出現(xiàn)明顯血壓或心電圖改變時 應進行相應整體或離體的進一步研究 二 呼吸系統(tǒng)測定并記錄給藥前后的呼吸頻率 節(jié)律和呼吸深度 治療劑量出現(xiàn)明顯的呼吸興奮或抑制時 應進行相應整體或離體進一步研究 三 精神神經(jīng)系統(tǒng)動物自主活動 平衡能力 與戊巴比妥鈉的協(xié)同 四 結(jié)果及分析應根據(jù)詳細的試驗記錄 對結(jié)果進行定量和定性統(tǒng)計分析 說明具體的統(tǒng)計方法和選擇理由 同時應注意對個體試驗結(jié)果的評價 根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果 分析受試物的一般藥理作用 結(jié)合非臨床藥效學 毒理學及臨床試驗結(jié)果 綜合分析這些藥理作用所提示的臨床意義 追加的安全藥理學研究內(nèi)容 中樞神經(jīng)系統(tǒng) 觀察藥物對行為藥理 學習記憶 神經(jīng)生化 視覺 聽覺和 或電生理等的影響心血管系統(tǒng) 觀察藥物對心輸出量 心肌收縮作用 血管阻力等心血管功能的影響 并探討其作用機制 呼吸系統(tǒng) 觀察藥物對氣道阻力 肺動脈壓力 血氣分析 血液pH值等的影響 補充的安全藥理學研究 泌尿系統(tǒng) 觀察藥物對腎功能的影響 如對尿量 比重 滲透壓 pH 電解質(zhì)平衡 蛋白質(zhì) 細胞和血生化 如尿素氮 肌酐 蛋白質(zhì) 等指標的檢測 自主神經(jīng)系統(tǒng) 觀察藥物對自主神經(jīng)系統(tǒng)的影響 如與自主神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)受體的結(jié)合 體內(nèi)或體外對激動劑或拮抗劑的功能反應 對自主神經(jīng)的直接刺激作用和對心血管反應 壓力反射和心率的影響 胃腸系統(tǒng) 觀察藥物對胃腸系統(tǒng)的影響 如胃液分泌量和pH 胃腸損傷 膽汁分泌 體內(nèi)轉(zhuǎn)運時間 體外回腸收縮的測定 其它器官系統(tǒng) 當出于對安全性的關(guān)注時 在其它有關(guān)研究中尚未研究藥物對下列器官系統(tǒng)的影響 如潛在的依賴性 骨骼肌 免疫和內(nèi)分泌功能等的影響 則應考慮藥物對這方面的影響 三 其它相關(guān)問題 1 給藥途徑原則上應與臨床擬用途徑一致 2 監(jiān)測的儀器設備 3 麻醉狀態(tài) 4 監(jiān)測的時間 5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 急性毒性試驗 Acutetoxicitytesting 是指在一日內(nèi)一次或多次應用受試藥物給予動物后 短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性反應及死亡情況 一 受試物 建議受試物采用制備工藝穩(wěn)定 符合臨床試用質(zhì)量標準規(guī)定的中試樣品 并注明受試物的名稱 來源 批號 含量 或規(guī)格 保存條件及配制方法等 如不采用中試樣品 應有充分的理由 一 動物一般應選擇與受試藥物的藥效學 藥代動力學 長期毒性試驗相關(guān)的動物 小鼠 大鼠 要求雌雄各半 二 給藥途徑 溶媒 體積 三 劑量和試驗周期 四 觀察指標及記錄 五 試驗方法半數(shù)致死量 LD50 最大耐受量 maximumtolerateddose MTD 試驗 長期毒性試驗研究 Chronictoxicitytesting 試驗設計至關(guān)重要 試驗設計應作到科學 周到 合理 一 試驗動物選用動物的生長敏感期階段進行試驗 即大鼠5 8周齡 體重80 100g左右 Beagle犬4 12月齡二 劑量設置高劑量應使動物出現(xiàn)明顯毒性或嚴重的毒性反應 或個別動物出現(xiàn)死亡 中劑量應使動物出現(xiàn)輕微的或中等程度的毒性反應 應注意的問題 一 劑量設置較低 與藥效學劑量間無安全范圍 二 與藥效學劑量的表示方法不一致 1 參考急性毒性試驗的LD50值 大鼠大 中 小三劑量一般為LD50值的1 10 1 50 1 100 2 參考最大給藥量 3 參考擬用臨床劑量 4 參考藥動學試驗結(jié)果 5 據(jù)等效劑量推算 6 據(jù)體表面積折算 三 樣品提供和給藥途徑一次性提供中試樣品 要求與臨床擬用途徑一致 三 預試驗易被忽略 實驗全程耗時耗力 一般重復不起 用少量動物進行預實驗很有必要 其中重點解決最大給藥量的問題 四 給藥周期長期毒性試驗的給藥周期 長期毒性試驗的給藥周期臨床療程長期毒性給藥周期嚙齒類動物非嚙齒類動物 1周2周2周 2周1個月1個月 1個月3個月3個月 3個月6個月6個月 3個月6個月9個月 對于一些慢性病需長期反復應用的藥物 長期毒性試驗則要求根據(jù)臨床實際用藥的療程 按照最長試驗周期進行試驗 即觀察大鼠給藥6個月 犬給藥9個月的長期毒性試驗五 指標選擇一般狀態(tài) 血液學 血液生化學 尿常規(guī) 主要臟器的病理組織檢查 1 血液學指標紅細胞計數(shù)血紅蛋白紅細胞容積平均紅細胞容積平均紅細胞血紅蛋白平均紅細胞血紅蛋白濃度網(wǎng)織紅細胞計數(shù)白細胞計數(shù)及其分類血小板計數(shù)凝血時間骨髓涂片 2 血液生化學指標天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶堿性磷酸酶 谷氨酰轉(zhuǎn)移酶尿素氮 肌酐 總蛋白 白蛋白 血糖總膽紅素 總膽固醇 甘油三酯 鈉離子濃度 鉀離子濃度 氯離子濃度 肌酐磷酸激酶 3 非嚙齒類動物尿液分析指標 尿液外觀 比重 pH值 尿糖 尿蛋白 尿膽紅素 尿膽原 酮體 尿液沉渣的顯觀察 4 長期毒性研究中需稱重并計算臟器系數(shù)的器官 腦 心臟 肝臟 腎臟 腎上腺 胸腺 脾臟 雄性動物睪丸 雄性動物附睪 雌性動物卵巢 雌性動物子宮 5 嚙齒類動物需進行病理組織學檢查的組織 腦 大腦 小腦 腦干 脊髓 頸 胸 腰段 垂體 胸腺 甲狀腺 甲狀旁腺 食管 唾液腺 胃 小腸和大腸 肝臟 胰腺 腎臟 腎上腺 脾臟 心臟 氣管 肺 主動脈 雄性動物睪丸 雄性動物附睪 雌性動物子宮 雌性動物卵巢 雌性動物乳腺 雄性動物前列腺 膀胱 坐骨神經(jīng) 骨髓 給藥局部 淋巴結(jié) 包括給藥局部淋巴結(jié) 腸系膜淋巴結(jié) 6 非嚙齒類動物需進行病理組織學檢查的組織 腦 大腦 小腦 腦干 脊髓 頸 胸 腰段 垂體 胸腺 甲狀腺 甲狀旁腺 食管 唾液腺 胃 小腸和大腸 肝臟 膽囊 腎臟 腎上腺 脾臟 胰腺 氣管 肺 主動脈 心臟 雄性動物附睪 雄性動物睪丸 雌性動物卵巢 雌性動物子宮 雄性動物前列腺 雌性動物乳腺 坐骨神經(jīng) 膀胱 視神經(jīng) 給藥局部 骨髓 淋巴結(jié) 包括給藥局部淋巴結(jié) 腸系膜淋巴結(jié) 六 恢復期了解毒性反應的可逆程度和可能出現(xiàn)的遲發(fā)性反應停藥后2 6周 某些檢查指標出現(xiàn)異常 可將恢復期相應延長七 結(jié)果的判斷應事實求是地科學地分析結(jié)果 報告毒性反應出現(xiàn)和恢復的時間 分析有無蓄積的情況沒有統(tǒng)計學意義 不等于沒有生理學意義 有統(tǒng)計學意義也不等于有生物學意義要有本實驗室的背景資料 中藥的特殊毒理學研究包括致突變性 致癌性 生殖毒性 致敏性 依賴性 其他毒性研究 一 皮膚刺激試驗分別進行完整皮膚 破損皮膚 多次給藥的刺激試驗 芎龍止痛滴鼻液對完整