本科學生綜合實驗報告2.doc

本科學生綜合性實驗報告姓名 陳春梅 學號 134120072 學院 生命科學學院 專業(yè)、班級 生物科學13級B班 實驗課程名稱 植物生理學 教師及職稱 李忠光 開課學期 2015 至 2015 學年 第二 學期云南師范大學教務處編印實 驗 室睿智三棟實 驗 時 間周三下午7-8節(jié)實 驗 名 稱1、 光合色素的提取、理化性質2、 分離、吸收光譜及含量的測定3、 光合色素含量的測定1、實驗目的1、掌握光合色素的提取方法以及了解有關的理化性質。2、掌握光合色素的分離方法以及了解有關的吸收光譜。3、掌握用分光光度計測定葉綠素含量的方法。2、實驗儀器及試劑材料：小桐子葉片、植物葉片3、實驗原理（1）、光合色素能溶于具有一定極性的有機溶劑，如丙酮、乙醇等。提取液中無任何電子受體，因此可以觀察熒光現象。離體葉綠素在有氧氣和光照條件下，發(fā)生光氧化作用，結構遭到破壞，形成加氧葉綠素等產物。葉綠素是一種雙羧酸酯，可以發(fā)生皂化反應。葉綠素分子中Mg2+與仆啉環(huán)結合不穩(wěn)定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等離子所取代。（2）、光合色素能溶于具有一定極性的有機溶劑，如丙酮、乙醇等。 不同光合色素的分子量、分子結構、極性、溶解度、支持物對它們的吸附力等不同，因而分配系數不同，故彼此可以分開。 葉綠素的卟啉環(huán)結構對光有很強的吸收，主要是紅光和藍紫光。 （3）、混合液中的兩個或多各組分，只要它們的光譜吸收峰不互相重疊，仍然可以根據Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各組分含量。Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。葉綠素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分別為663nm、645nm，由此得出：見推導過程 Ca = 12.7 A663 2.69 A645；Cb = 22.9 A645 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645由于k是一個常數，而A可以通過 A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1 A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2 分光光度計測出，故求二元一次方程組可得到此公式。k比吸收系數。即溶劑和波長不變的情況下，當物質的濃度(C)為1g/L(0.1%)，比色皿的直徑(光徑，L)為1cm時所測出的吸光度即為比吸收系數。故其單位為：摩爾吸收系數。即溶劑和波長不變的情況下，當物質的濃度(C)為1mol/L，比色皿的直徑(光徑，L)為1cm時所測出的吸光度即為摩爾吸收系數。故其單位為：4、實驗方法、步驟及現象 （1）、光合色素的提?。簩⒅参锶~片洗凈并用濾紙洗干，取1/2片葉片，放入研缽中并加入少許CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。方法及步驟 光合色素的提?。簩⒅参锶~片洗凈并用濾紙洗干，取1/2片葉片，放入研缽中并加入少許CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。 觀察熒光現象：與光線垂直的方向觀察色素顏色。 光破壞作用：1ml色素提取液于室內，1ml于太陽光下，30min后觀察顏色變化。 皂化反應：取一支試管，加入色素提取液2.5ml，再加入20%KOH甲醇溶液1ml，搖勻，再加入苯2.5ml，輕輕搖動，沿試管壁慢慢加入自來水1ml，輕輕搖動后觀察，注意觀察整個過程顏色的變化。 取代反應：取一支試管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液變?yōu)辄S褐色。倒出一半，加入少許醋酸銅粉末，酒精燈上加熱，與另一半比較顏色的差異。 （2）、光合色素的提?。簩⒅参锶~片洗凈并用濾紙洗干，取1/3片葉片，放入研缽中并加入少許CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。 光合色素分離： 剪取適當長度和寬度的濾紙條 用上行紙層析法分離色素 啟動劑：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。吸收光譜的測定： 光合色素的吸收光譜：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，搖勻后在分光光度計上400到700 nm處每隔10 nm進行掃描。 各色素的吸收光譜：上述層析出的34種色素，分別剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法掃描。 （3）、方法一：快速測定法 由于葉綠素a、b在652nm處有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1?？芍苯佑帽銛y式葉綠素測定儀測定植物葉片的葉綠素含量，最后濃度單位為mg/dm2 方法二: 分光光度計法色素提?。簩⑸鲜鲋参锶~片洗凈并用濾紙吸干，準確稱取已知的葉圓片0.05g左右，加入少許CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，轉入離心管中（離心機使用），再用5ml 80%丙酮洗研缽，轉入離心管中，平衡，5000rpm離心10min, 記錄上清液體積，取1ml稀釋到4ml。測定：以1cm比色皿分別測定A663、A645。使A控制在0.1 0.8之間。結果與討論 1、認真記錄觀察到的結果（顏色變化？分幾層？為什么？），并加以討論。 思考題 1、為什么在皂化反應中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？結果與討論 1、畫出你的層析結果，并加以分析。 2、總光合色素和各光合色素的吸收光譜有何不同，為什么？思考題 1、光合色素的吸收光譜對我們理解光合作用有何意義？2、試論述高等植物光合色素的種類和生理功能結果與討論Chl content = (mg.g-1FW) 1、根據原理中計算出三類色素的濃度（mg / L）。2式 分別計算出各種植物葉片色素含量。思考題 1、一般正常的植物葉片，Chla / Chlb = 3 / 1