實(shí)驗(yàn)二 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳.ppt

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 安徽師范大學(xué)生科院生化教研室 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)之二 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求 了解電泳技術(shù)的一般原理學(xué)習(xí)醋酸纖維素薄膜電泳操作技術(shù)測定人血清中各種蛋白質(zhì)的相對百分含量 二 實(shí)驗(yàn)原理 1 電泳是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象 在一定pH條件下 不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷 因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同 即它們的電泳遷移率不同 因此 可使它們分離2 影響電泳遷移率的因素 內(nèi)在因素 蛋白所帶凈電荷的量 蛋白的大小和形狀外界因素 電場強(qiáng)度 溶液的pH值 溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象3 醋酸纖維素溶于有機(jī)溶劑 如 丙酮 氯仿 氯乙烯 乙酸乙酯等 后 涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜 該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu) 厚度約為120 m 有很強(qiáng)的通透性 對分子移動阻力很小 該薄膜電泳具有微量 快速 簡便 分辨力高 對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn) 4 經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶 從正極端依次為清蛋白 1球蛋白 2球蛋白 球蛋白及 球蛋白 經(jīng)染色可計(jì)算出各蛋白質(zhì)的百分含量 三 實(shí)驗(yàn)器材 1 DYY 6C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀和DYY 型電泳槽 均為北京市六一儀器廠生產(chǎn)2 醋酸纖維薄膜 2cm 8cm 3 培養(yǎng)皿 一排桌子公用5套 包括平衡 染色各用一套 漂洗用3套 4 點(diǎn)樣器5 濾紙6 載玻片7 鑷子8 玻棒 四 實(shí)驗(yàn)試劑 巴比妥 巴比妥納緩沖液 pH8 6 0 07mol L 離子強(qiáng)度0 06 稱取1 66g巴比妥 AR 和12 76g巴比妥納 AR 置于三角燒瓶中 加蒸餾水約600ml 稍加熱溶解 冷卻后用蒸餾水定容至1000ml 置4 保存 備用 2 血清蛋白染色 1 染色液 0 5 氨基黑10B 稱取0 5g氨基黑10B 加蒸餾水40ml 甲醇 AR 50ml 冰乙酸 AR 10ml 混勻溶解后置具塞試劑瓶內(nèi)貯存 2 漂洗液 取95 乙醇 AR 45ml 冰乙酸 AR 5ml 和蒸餾水50ml 混勻置具塞試劑瓶中貯存 五 測試材料 未溶血的人或動物血清 電泳儀由電泳槽和穩(wěn)壓電源兩部分組成 兩者之間有專門的連線連接 穩(wěn)壓電源用于調(diào)節(jié)電壓和通電時(shí)間 當(dāng)電泳槽和穩(wěn)壓電源連接好后 將點(diǎn)好樣的醋酸纖維薄膜搭在濾紙橋上 蓋上蓋子 通電 調(diào)整好電壓 進(jìn)行電泳 注意電泳槽的電極方向 負(fù)極應(yīng)與醋酸纖維薄膜上的點(diǎn)樣原點(diǎn)在同一側(cè) 目前 該電泳儀已改進(jìn)為數(shù)顯式的DYY 6C型 浸泡 將2 8cm醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無光澤面 在無光澤面距短邊一端1 5cm處用鉛筆輕輕畫一條點(diǎn)樣線 將之置于盛有緩沖液的平皿中 浸泡30min方可用于點(diǎn)樣 點(diǎn)樣 用鑷子取出浸透的薄膜 夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液 然后平鋪在玻璃板上 無光澤面朝上 在另一載玻片上滴一滴血清 點(diǎn)樣器 用蓋玻片的一邊 在血清上蘸一下 可來回移動一次 再將點(diǎn)樣器輕印在加樣線上 使血清滲透到薄膜內(nèi) 形成均勻的直線 操作指南 六 操作步驟 1 醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中約30min后 每組取醋酸纖維素薄膜1張 取時(shí)用鑷子夾住薄膜一端 放在折疊的濾紙中 并用它吸干表面液體 2 電泳槽的準(zhǔn)備電泳槽有兩個互相隔離的槽 各自裝有緩沖液 接不同的電極 紅色為正極 黑色為負(fù)極 每個槽上都有一根可移動的橫桿 濾紙或紗布的一頭搭在橫桿上 另一頭浸入緩沖液中 形成了濾紙橋 兩桿之間的距離調(diào)節(jié)到略小于醋酸纖維薄膜的長度 點(diǎn)好樣的醋酸纖維薄膜就搭在濾紙橋上 3 點(diǎn)樣 點(diǎn)樣時(shí) 先將毛細(xì)血管插入血清中 封住上端 在載玻片的一端均勻涂過 使樣品連續(xù) 均勻 適量 把載玻片在薄膜毛面上輕而溫和地印一下 點(diǎn)樣區(qū)距陰極端1 5cm處 見圖 此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵 醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖 虛線處為點(diǎn)樣位置 4 電泳將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上 點(diǎn)樣面朝下 另一端平貼在陽極端支架上 見下圖 要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直 中間不能下垂 連接好電泳儀 在室溫下電泳 打開電源開關(guān) 調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0 3mA cm膜寬度 24片薄膜則為14 4mA 通電5min后 調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0 5mA cm膜寬度 24片薄膜則為24mA 電泳時(shí)間50min 電泳后 調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零 關(guān)閉電泳儀切斷電源 5 染色 電泳完畢后將薄膜取下 放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5min6 漂洗 將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次 直至背景藍(lán)色脫盡 條帶清晰為止 可得到色帶清晰的電泳圖譜 7 記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果漂洗完畢后將薄膜取出 放在濾紙上 將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺 形狀 大小及相對位置進(jìn)行描述 記錄在預(yù)習(xí)本上 并判斷分析其結(jié)果 8 整理好桌面上的儀器和試劑 并注意清潔自己的操作臺 請老師驗(yàn)收 實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場交給老師 七 注意事項(xiàng) 1 薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一 2 點(diǎn)樣時(shí) 應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去 吸水量以不干不濕為宜 3 點(diǎn)樣時(shí) 動作要輕 穩(wěn) 用力不能太大 以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果 4 點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上 點(diǎn)樣量要適量 不宜過多或過少 5 電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端 且點(diǎn)樣面向下 6 應(yīng)控制染色時(shí)間 時(shí)間長 薄膜底色不易脫去 時(shí)間太短 著色不易區(qū)分 或造成條