腦缺血損傷及其體外細(xì)胞模型.ppt

cerebralischemiainjury 腦梗塞 疾病相關(guān)介紹 急性腦缺血級聯(lián)反應(yīng) 體外細(xì)胞模型 1 2 3 腦卒中 全球第三位死因 高發(fā)病率高死亡率高致殘率高復(fù)發(fā)率 缺血性卒中占卒中86 缺血性卒中中 又包括短暫腦缺血發(fā)作 tia 腦血栓 腦栓塞和腔隙性梗塞 后三者在臨床上有時不易區(qū)分 故統(tǒng)稱為腦梗塞 腦梗塞致殘率第一 致死率第二 每年死于腦梗塞的病人達(dá)150萬現(xiàn)有腦梗塞病人750萬到800萬人我國每年用于腦腦梗塞的直接經(jīng)濟(jì)支出已近300億元 每年全國新發(fā)病例250萬 每12秒有一個中國人發(fā)生腦梗塞每21秒有一個中國人死于腦梗塞 腦部血液供應(yīng) 腦部的血液供應(yīng)主要來自兩個系統(tǒng) 頸動脈系統(tǒng) 大腦前動脈 中動脈 前脈絡(luò)膜動脈 眼動脈椎 基底動脈系統(tǒng) 左右椎動脈 基底動脈頸動脈系統(tǒng) 供應(yīng)大腦半球前3 5部分椎 基底動脈系統(tǒng) 供應(yīng)大腦半球后2 5部分 腦梗塞 病因 供應(yīng)腦部的動脈系統(tǒng)發(fā)生粥樣硬化等血管病變 致管腔狹窄或閉塞 進(jìn)而血栓形成 造成腦局部血流中斷 發(fā)生腦組織缺血 缺氧 組織軟化 出現(xiàn)相應(yīng)局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征 臨床表現(xiàn) 頸動脈系統(tǒng)血栓 大腦中動脈主干缺血 開始上肢完全性軟癱 下肢有時尚能活動 大腦中動脈深支血栓 表現(xiàn)為持久的偏癱 大腦中動脈上組皮質(zhì)支血栓 有時對側(cè)力弱 面部及上肢的感覺障礙 大腦中動脈下組皮質(zhì)支硬塞 優(yōu)勢半球病變 感覺性失語 失讀癥 失算癥及命名性失語 可有對側(cè)偏盲 非優(yōu)勢半球病變 失認(rèn)癥 對自己形象歪曲或不能辨認(rèn) 否認(rèn)自己有神經(jīng)系統(tǒng)疾病 臨床表現(xiàn) 椎 基底動脈系統(tǒng)血栓 眩暈 頭痛 眼球震顫 復(fù)視 同向偏盲 皮層性失明 眼肌麻痹 吞咽困難 構(gòu)音障礙 交叉性麻痹及感覺減退 四肢癱瘓 共濟(jì)失調(diào) 可有不同程度的意識障礙 腦梗塞按栓子來源分類 心源性 占60 75 栓子主要來源是風(fēng)濕性心瓣膜病 心內(nèi)膜炎贅生物及附壁血栓脫落等 以及心肌梗死 心房粘液瘤 心臟手術(shù) 心臟導(dǎo)管 二尖瓣脫垂和鈣化 先天性房室間隔缺損等 非心源性 如動脈粥樣硬化斑塊脫落 肺靜脈血栓或凝塊 骨折或手術(shù)時脂肪栓和氣栓 血管內(nèi)治療時血凝塊或血栓脫落等 頸動脈纖維肌肉發(fā)育不良 女性多見 肺感染 敗血癥 腎病綜合征的高凝狀態(tài)等可引起腦栓塞 來源不明 約30 的腦栓塞 腦梗塞易發(fā)人群 腦梗塞臨床治療方法 預(yù)防復(fù)發(fā)防止并發(fā)癥康復(fù) 急性腦缺血級聯(lián)反應(yīng) 在正常生理狀態(tài)下 成人每100g腦組織血流量約為50ml min 當(dāng)腦血流量處于或低于20ml時 缺血所致的級聯(lián)反應(yīng)開始被激活 出現(xiàn)不可逆性組織壞死 即腦梗死 急性腦缺血級聯(lián)反應(yīng)包括 神經(jīng)細(xì)胞凋亡 炎癥bbb破壞 腦缺血級聯(lián)反應(yīng) 能量耗竭 能量耗竭 腦占體重2 3 但需要的血液供應(yīng)卻占心排出量的20 腦細(xì)胞不能將脂肪 蛋白質(zhì)或葡萄糖以外的碳水化合物作為能量來源 只能直接利用葡萄糖 腦缺血后 腦組織氧糖缺乏 發(fā)生能量障礙 腦血供停止6 8s 腦電活動即消失 30s神經(jīng)代謝細(xì)胞代謝開始受累 2min神經(jīng)細(xì)胞代謝停止 5min神經(jīng)細(xì)胞開始死亡 大腦皮質(zhì)開始出現(xiàn)永久性損害 缺血半暗帶 急性腦血管閉塞 其周圍區(qū)域即缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)組織僅出現(xiàn)代謝性損傷 功能損害 如能恢復(fù)血流灌注 其神經(jīng)功能有恢復(fù)可能 腦缺血級聯(lián)反應(yīng) 細(xì)胞內(nèi)鈣超載 細(xì)胞內(nèi)鈣超載 能量代謝障礙直接抑制細(xì)胞質(zhì)膜上na k atp酶活性 使大量k 內(nèi)流 神經(jīng)元去極化 電壓依賴性與配體門控性ca2 通道激活 大量ca2 內(nèi)流 腦缺血級聯(lián)反應(yīng) 興奮毒性 興奮毒性 谷氨酸 glu 是中樞神經(jīng)系統(tǒng) cns 主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì) 也是細(xì)胞通訊傳遞 生長 分化和可塑性的重要調(diào)質(zhì) 同時又是一個很強(qiáng)的神經(jīng)毒素 生理?xiàng)l件下 由于體內(nèi)高效能的谷氨酸攝取系統(tǒng)的存在 使細(xì)胞外glu維持在較低的水平 僅有少量作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)參與信號傳遞 但在腦缺血時 glu大量釋放和對谷氨酸受體 glurs 過度刺激 導(dǎo)致神經(jīng)元興奮 潰變 死亡 產(chǎn)生興奮性毒性 腦缺血級聯(lián)反應(yīng) 自由基過度形成 在正常腦組織中 活性氧自由基 reactiveoxygenspecies ros 是通過內(nèi)源性酶抗氧化防御系統(tǒng) 如超氧化物歧化酶 superoxidedismutase sod 谷胱甘肽過氧化物酶 glutathioneperoxidase gpx 過氧化氫酶 catalase cat 與非酶抗氧化防御系統(tǒng) 如谷胱甘肽 glutathione gsh 維生素c e等來維持平衡 自由基蓄積過多 攻擊機(jī)體 即為氧化應(yīng)激 自由基過度形成 自由基過度形成 nadph氧化酶首先發(fā)現(xiàn)于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 是由gp91phox p22phox p47phox p67phox p40phox和rac六種亞基組成的復(fù)合體 gp91phox是其主要的功能亞基即催化亞基 腦缺血后 nox2的活化通過一些激酶如蛋白激酶c proteinkinasec pkc 等 電子由nadph氧化酶轉(zhuǎn)移至o2 產(chǎn)生超氧陰離子 o2 2o2 nadph 2 o2 nadp h 腦缺血級聯(lián)反應(yīng) 炎癥andbbb破壞 炎癥and血腦屏障被破壞 腦缺血一再灌注時 氧自由基及其他信使激活炎性細(xì)胞因子 釋放趨化因子 上調(diào)黏附分子 在白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用下 白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞 從而阻塞微血管 導(dǎo)致微血管閉塞而引發(fā) 無復(fù)流現(xiàn)象 聚集的白細(xì)胞能夠釋放氧自由基 蛋白水解酶等直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞 破壞血 腦屏障 從而產(chǎn)生腦水腫 造成腦出血和神經(jīng)元的損傷 同時 激活的白細(xì)胞在微血管內(nèi)聚集 釋放大量的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子 使更多的中性粒細(xì)胞聚集到炎性反應(yīng)部位 從而加重炎性反應(yīng) 造成惡性循環(huán) 腦缺血級聯(lián)反應(yīng) 神經(jīng)細(xì)胞凋亡 腦缺血誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡兩步 腦缺血時 glu濃度升高所產(chǎn)生的早期興奮毒性主要通過ka受體和ampa受體 由nmda受體介導(dǎo)的神經(jīng)元遲發(fā)性損傷 可在數(shù)小時至數(shù)日發(fā)生 以細(xì)胞內(nèi)鈣超載為特征 腦缺血體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 神經(jīng)元模型膠質(zhì)細(xì)胞模型內(nèi)皮細(xì)胞模型 共培養(yǎng)模型 缺血模型 細(xì)胞模型 神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)bbb模型腦片模型 直接誘導(dǎo)法間接誘導(dǎo)法 細(xì)胞模型 神經(jīng)元模型原代神經(jīng)元培養(yǎng) 多采用15 18d孕齡的胎鼠或新生鼠 經(jīng)取材 機(jī)械分離 酶消化等步驟獲得細(xì)胞懸液 接種至包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿內(nèi) 用添加b27的neurobasal nb 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 并用阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長 可獲得純度較高的原代培養(yǎng)神經(jīng)元 培養(yǎng)5 7d后用于實(shí)驗(yàn) 由于海馬對缺氧較為敏感 因此常從海馬組織中分離原代神經(jīng)元用于研究 傳代細(xì)胞系 如小鼠來源的neuro 2a細(xì)胞和ng108 15細(xì)胞 大鼠來源的b104細(xì)胞 pc12細(xì)胞 人來源的sh sy5y細(xì)胞等 細(xì)胞模型 膠質(zhì)細(xì)胞模型原代膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的取材過程與神經(jīng)元原代培養(yǎng)類同 只是培養(yǎng)時換成利于膠質(zhì)細(xì)胞生長的dmem f12完全培養(yǎng)基 含10 胎牛血清 體外培養(yǎng)l0 12d后細(xì)胞融合并分層 上層主要為小膠質(zhì)細(xì)胞 下層主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞 然后 可采用多種方法進(jìn)一步純化 傳代的膠質(zhì)細(xì)胞系 小鼠膠質(zhì)細(xì)胞系 bv2細(xì)胞 n9細(xì)胞 c8 b4細(xì)胞 大鼠膠質(zhì)細(xì)胞系c6細(xì)胞以及人星形膠質(zhì)細(xì)胞u251 細(xì)胞模型 內(nèi)皮細(xì)胞模型原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 一般從成年動物大腦皮質(zhì)取材 剪刀破碎成1mm大小 膠原酶消化后 經(jīng)密度梯度離心或過篩方法獲得 然后接種至 型膠原包被的培養(yǎng)板內(nèi) 培養(yǎng)4 5d后融合形成緊密連接的單層細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞單層或由內(nèi)皮細(xì)胞層構(gòu)成的體外bbb模型 經(jīng)ogd誘導(dǎo)缺血后 內(nèi)皮細(xì)胞問緊密連接遭到破壞 通透性增加 跨內(nèi)皮電阻 transendothelialelectricalresistance teer 減小 與體內(nèi)狀態(tài)相似 細(xì)胞共培養(yǎng)模型 神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng) 利用膠質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層進(jìn)行分離式原代神經(jīng)元培養(yǎng)的方法 又稱細(xì)胞培養(yǎng)小室或transwel小室 分別將純化的膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元接種于插入式培養(yǎng)皿的微孔膜和6孔板內(nèi)的蓋玻片爬片上 混合培養(yǎng) 類似原代培養(yǎng)神經(jīng)元的獲取和培養(yǎng)過程 只是培養(yǎng)基中不添加阿糖胞苷 但添加5 胎牛血清 神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞共同生長在一個培養(yǎng)層 banker共培養(yǎng) 插入式培養(yǎng)皿 細(xì)胞共培養(yǎng)模型 bbb模型 來源于成年鼠的bmec與來源于新生鼠的膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng) bmec在半透膜上進(jìn)行單層培養(yǎng) 膠質(zhì)細(xì)胞在半透膜下的培養(yǎng)孔中生長 通過檢測teer transendothelialelectricalresistance 跨內(nèi)皮電阻 和內(nèi)皮通透系數(shù) endothelialpermeabilitycoeficient pe 來監(jiān)測內(nèi)皮細(xì)胞功能 檢測閉鎖小帶蛋白1和閉合蛋白這2種參與內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的重要蛋白 可反映內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性 雖然該模型中內(nèi)皮細(xì)胞的teer和pe相對低于體內(nèi)狀態(tài) 但具有與體內(nèi)狀態(tài)一樣的細(xì)胞特性 細(xì)胞共培養(yǎng)模型 腦片模型 腦片多來源于出生后6 8d的大鼠 也可采用未成年或成年大鼠 最常用的是海馬組織 因?yàn)槠浣馄蕦W(xué)結(jié)構(gòu)明確而且對缺血性損傷最為敏感 相對于原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞 腦片可在體外培養(yǎng)數(shù)周時間 能保留體內(nèi)狀態(tài)下細(xì)胞間的相互作用和三維立體結(jié)構(gòu) 具有正常和完整的突觸通路 遞質(zhì)傳遞和電生理等功能 同時 腦片培養(yǎng)排除了體內(nèi)模型中bbb的干擾 可采用人工培養(yǎng)基或添加各種藥物 易于控制培養(yǎng)環(huán)境 腦片模型 腦片培養(yǎng)方法 a 旋轉(zhuǎn)管法b 半透明膜法 缺血模型 直接誘導(dǎo)法 ogd 化學(xué)藥物 ogd是使用低氧裝置 如三氣培養(yǎng)箱 結(jié)合無糖培養(yǎng)基或是向無糖培養(yǎng)基中持續(xù)通人不含氧的混合氣體 5 co2 95 n2 來模擬缺糖缺氧環(huán)境 經(jīng)ogd處理一段時間后 可轉(zhuǎn)移到正常氧濃度和含糖培養(yǎng)基條件下繼續(xù)培養(yǎng) 以模擬細(xì)胞或組織缺血再灌注損傷的病理生理學(xué)過程 疊氮化鈉 氰化鈉等氧化代謝抑制劑能通過與細(xì)胞色素氧化酶緊密結(jié)合來抑制氧化磷酸化過程和阻止線粒體產(chǎn)生atp 三氣培養(yǎng)箱 缺血模型 間接誘導(dǎo)法 興奮性毒性損傷模型 氧化應(yīng)激性損傷 一般采用谷氨酸或谷氨酸鹽和nmda等試劑 100 mol l的谷氨酸鹽作用于皮質(zhì)神經(jīng)元5min即可造成大量損傷 主要采用過氧化氫或叔丁基過氧化氫可模擬腦缺血和缺血再灌注產(chǎn)生的活性氧 超氧陰離子 過氧化氫 羥自由基等 所引起的氧化應(yīng)激損傷 但是 目前對于其使用濃度和作用時間尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn) 這些活性氧與培養(yǎng)物類型和培養(yǎng)條件有關(guān) 缺血模型 間接誘導(dǎo)法 一氧化氮 nitricoxide no 損傷 炎癥反應(yīng) no具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性雙重作用 硝普鈉 sodiumnitroprusside snp 可用作外源性no供體 對于體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞或腦組織 可給予脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞