改良線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的經(jīng)驗(yàn)總結(jié).doc

改良線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)【中圖分類號】R722.t2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】2095-6851（2017）01-0-01腦卒中是一種急性腦血管疾病，而缺血性腦卒中的發(fā)病率高于出血性腦卒中，占腦卒中的60%一70%。由于臨床研究限制，為弄清缺血性卒中的演變過程和干預(yù)措施療效觀察，探尋缺血性卒中的形成機(jī)制和防治策略，建立最接近人類腦梗死的理想動(dòng)物模型尤其重要。大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery， occlusion，MCAO）模型被普遍認(rèn)為是局灶性腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型1。在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭谱鞯难芯恐校么笫蠼CAO腦缺血的動(dòng)物模型最為合適。制備MCAO模型的方法有很多種，包括光化學(xué)法、三氯化鐵法、線栓法、自體血栓法、電流損傷法、自發(fā)性MCAO法等2。由于線栓法具有不開顱、效果肯定、易操作等優(yōu)點(diǎn)，是常用的模型制備方法3-4。但該方法仍存在技術(shù)要求高、模型差異性大、動(dòng)物死亡率高等缺陷。因此，如何建立穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性高的MCAO動(dòng)物模型成為目前函待解決的問題5。造模過程中筆者發(fā)現(xiàn)，一些微小的操作技巧也許就決定著實(shí)驗(yàn)最終的結(jié)果，謹(jǐn)以自身經(jīng)驗(yàn)告之，希望讓該科研課題的實(shí)驗(yàn)工作者有所收獲。下面將主要從術(shù)前準(zhǔn)備、術(shù)中操作及術(shù)后護(hù)理三方面進(jìn)行詳細(xì)講述。1.術(shù)前準(zhǔn)備1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠的選擇有學(xué)者認(rèn)為大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的成功與合理選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)6-8，首先是性別，實(shí)驗(yàn)應(yīng)選用雄性SD大鼠，有研究表明，雌激素水平的變化與缺血性腦血管病的發(fā)生和發(fā)展有一定的關(guān)系。雌激素可減輕腦缺血的損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用，包括增加腦血流量，阻滯興奮性神經(jīng)毒性損傷，舒張血管等作用9。其次是體重，大鼠體重的選擇十分重要，它決定著大鼠血管直徑的大小，在適應(yīng)性喂養(yǎng)約1周時(shí)間后，根據(jù)制作的線栓頭端的直徑大小，來大致估算大鼠血管直徑的范圍，最后選擇相應(yīng)體重的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若體重過輕，線栓直徑相對較大，易損傷血管；反之，則會(huì)因堵不住血管而出現(xiàn)持續(xù)性出血，造模失敗。我們實(shí)驗(yàn)選用的線栓頭端直徑約0.36mm，大鼠體重250-280g，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)食情況下，體重達(dá)280-290g的大鼠禁食不禁水12小時(shí)后，體重若維持在260-270g范圍內(nèi)，血管直徑狀況最適宜。1.2 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備在實(shí)驗(yàn)材料方面，除了藥物，動(dòng)脈夾、顯微鑷及結(jié)扎線的選擇直接決定著造模的操作時(shí)間和成效。首先，動(dòng)脈夾最好選用內(nèi)側(cè)有防滑齒的，防止脫落；動(dòng)脈夾不宜過大，影響操作。其次最好配備顯微鑷，可用于分離血管及血管外膜；最后在結(jié)扎線的選擇上，最好購買兩種結(jié)扎線，粗線用來結(jié)扎大血管如頸總，不易損傷血管，在解線時(shí)更方便，細(xì)線用來結(jié)扎頸外斷端及線栓口，這樣線栓更好轉(zhuǎn)彎，扎線的松緊更好掌握。2.術(shù)中操作2.1 麻醉選擇適宜體重的大鼠，術(shù)前禁食不禁水12h，取出大鼠，用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，計(jì)量按照3.5mL/kg，腹腔麻醉時(shí)注意角度及進(jìn)針深度，避免注射到皮下。麻醉后5-10分鐘，以指掐大鼠尾巴沒有掙扎為準(zhǔn)。2.2 分離血管將大鼠取仰臥位固定于鼠板上，頭端朝術(shù)者，持無齒鑷牽拉大鼠舌前部到一側(cè)口角處，剃除頸部毛發(fā)，碘伏、酒精多次消毒頸部。以正中線行縱向切口，切口不宜過于靠近下頜，長度約1.5cm，用彎鑷沿切口行鈍性剝離，剝離皮下筋膜、肌肉及甲狀腺，用拉鉤將皮膚及肌肉拉開，充分暴露。盡量將氣管兩側(cè)的組織分離干凈，暴露頸總，沿氣管右側(cè)（筆者實(shí)驗(yàn)為右側(cè)）進(jìn)行血管分離，并仔細(xì)將頸總動(dòng)脈上附著的筋膜全部分離，用彎鑷從血管下面向兩側(cè)分離，直到看到頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈的分叉，切記小心與頸總伴行的迷走神經(jīng)，由于個(gè)體差異，有些大鼠的迷走神經(jīng)會(huì)橫跨頸總后再向下行，要注意盡量少的刺激迷走神經(jīng)，利用筋膜將其分離開。2.3 結(jié)扎利用拉鉤充分暴露CCA、ICA、ECA，注意分清ICA和ECA，大鼠的頸外和頸內(nèi)的分布與人類有所差異，近似于上下分布，頸外在上偏內(nèi)，頸內(nèi)在下偏外。用手術(shù)線分別穿過CCA、ICA、ECA做備用，在CCA盡量靠近心臟的方向用粗線結(jié)扎，活結(jié)，充分剝離ECA，在ECA靠近頭端處打死結(jié)，靠近分叉處放置一細(xì)結(jié)扎線備用。用微動(dòng)脈夾盡量遠(yuǎn)離分叉口夾閉ICA，頸內(nèi)動(dòng)脈的結(jié)扎是暫時(shí)的。2.4 插線栓在ECA距分叉處4mm處，用顯微剪頭朝下剪一弧行小口，此時(shí)注意是否有血持續(xù)滲出，若有，表示結(jié)扎不牢，可嘗試?yán)o結(jié)扎線，切記此時(shí)不能松開動(dòng)脈夾，否則會(huì)造成大出血。接著夾持線栓由ECA上的切口向分叉方向插入，左手可提拉起ECA頭端地結(jié)扎線固定血管，鑷子夾太緊會(huì)使線栓頭變形。待魚線進(jìn)入CCA后放手，然后用備好的結(jié)扎線栓緊切口，注意不能越過OA，否則會(huì)持續(xù)出血，必要時(shí)可結(jié)扎OA，此時(shí)結(jié)扎的松緊度非常重要，過緊則線栓插入困難，過松則會(huì)出血、脫落，以松開動(dòng)脈夾后不出血為度。剪掉多余線頭，剪斷ECA，然后用兩個(gè)彎鑷一面夾住己經(jīng)進(jìn)入的魚線和血管，一面夾住外面的魚線，進(jìn)行遞送，在分叉處傾斜巧度角轉(zhuǎn)向進(jìn)入ICA，遇到動(dòng)脈夾阻擋后，松開動(dòng)脈夾，繼續(xù)向內(nèi)插入。插入約10mm左右，有時(shí)會(huì)感覺有阻力，是由線栓穿顱時(shí)遇到狹窄所致，此時(shí)硬行推入易損傷血管。應(yīng)將線栓緩緩?fù)酥燎锌谔帲{(diào)整方向再緩慢插入，技巧是一手用顯微鑷向上抬起ICA靠顱段，另一手持鑷子稍下壓使線栓盡量保持水平插入，約當(dāng)線栓標(biāo)記點(diǎn)靠近切口時(shí)，即插入16-18mm左右，感覺到輕微阻力時(shí)停止插入，不宜超過20mm，切記操作者動(dòng)作一定要輕柔，否則易導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血而死亡。應(yīng)注意線栓在血管里多次進(jìn)退可誘發(fā)血小板、白細(xì)胞勁附，損傷或刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞引起某些活性物質(zhì)釋放誘發(fā)血栓，造成動(dòng)物存活時(shí)間縮短10。2.5 缺血與再灌注線栓插入成功后，記錄缺血開始的時(shí)間，浸泡過生理鹽水的脫脂棉球覆蓋傷口。給大鼠保暖。缺血90 min后緩慢拔出魚線，拔線時(shí)速度過快或麻醉不好大鼠抽動(dòng)，會(huì)引起蛛網(wǎng)膜下腔出血甚至拉斷血管，導(dǎo)致大鼠死亡。在缺血的90min時(shí)間里，中途需要補(bǔ)充麻醉，根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，若造模耗時(shí)在30min以內(nèi)，在缺血1小時(shí)后可再次注射0.2-0.3ml水合氯醛，這里要注意不要注射過多，容易死亡。若大鼠有牙齒挫動(dòng)或手腳抽動(dòng)為蘇醒前指征，此時(shí)注射麻醉效果減弱，若大