《蛋白表達(dá)概述》PPT課件

蛋白表達(dá)概述,MichaelChao,常用蛋白表達(dá)系統(tǒng)(host),原核細(xì)胞：大腸桿菌。真核細(xì)胞：酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),大腸桿菌是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。優(yōu)越性：對大腸桿菌的基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等背景知識和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理已有了深刻了解；商品化的載體和菌株種類非常齊全；表達(dá)效率高；易培養(yǎng)，成本低。,缺點(diǎn)：因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體；蛋白質(zhì)不能糖基化；其內(nèi)毒素很難除去。,酵母表達(dá)系統(tǒng),甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)，以PichiaPastoris應(yīng)用最多。優(yōu)越性：蛋白可糖基化，有相對正確的天然結(jié)構(gòu)，可很好的生產(chǎn)分泌型蛋白；表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，實(shí)現(xiàn)高效率表達(dá)；表達(dá)載體都為E.coli/PichiaPastoris的穿梭載體，可在獲得克隆后采用E.coli細(xì)胞大量擴(kuò)增。易培養(yǎng)，成本低,可高密度發(fā)酵。,缺點(diǎn)：糖基化與哺乳動(dòng)物有所差別；培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。,昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),利用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞體系中表達(dá)外源蛋白是目前較為流行的表達(dá)方式。優(yōu)越性：重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配；可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達(dá)大片段DNA的理想載體；可進(jìn)行分泌表達(dá)。,缺點(diǎn)：糖基化與哺乳動(dòng)物有所差別；表達(dá)量有限；作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可；培養(yǎng)成本高。,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用于表達(dá)高活性的人源重組蛋白。優(yōu)越性：糖基化與人源蛋白一致；能表達(dá)天然結(jié)構(gòu)的完整蛋白，活性很高；可進(jìn)行分泌表達(dá)。,缺點(diǎn)：表達(dá)量低；培養(yǎng)成本很高，操作繁瑣。,各種表達(dá)系統(tǒng)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平高，生產(chǎn)成本低，但它們的加工修飾體系與昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞不完全相同；哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達(dá)量低、操作繁瑣。各種表達(dá)系統(tǒng)由于翻譯后的加工不完全相同，因而產(chǎn)生的重組蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性有時(shí)會有差別。因此，選擇表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，必須充分考慮各種因素，如所需要表達(dá)的蛋白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，還需要考慮成本、產(chǎn)量及純化路線和安全性。對于我們來說，最常用和最需掌握的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),FactorsinE.coliproteinexpression,一個(gè)蛋白要成功的在E.coli系統(tǒng)表達(dá)，就是要根據(jù)表達(dá)目的在載體，菌株和培養(yǎng)條件三個(gè)主要因素之間找到一個(gè)理想的結(jié)合點(diǎn)。以達(dá)到目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高;表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定;生物活性高;表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。,表達(dá)載體(Vector),原核表達(dá)載體眾多，常用的有pET(T7promoter)、pQE(T5promoter)、pGEX(GST融合表達(dá))等。各載體適應(yīng)的菌株也不盡相同pET(BL21(DE3)、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。對于我們來說，最常用和最需掌握的是pET表達(dá)系統(tǒng),Expressionplasmidfeatures,Inductionofexpression,pET載體E.coli表達(dá)蛋白流程,pETsystem,Fetures:popularLowbasalexpressionlevelsWidestvarietyoffusiontagsSpecializedvectorsandhostsCompetentcells,選擇合適的載體,載體大致可分為兩大類：轉(zhuǎn)錄載體和翻譯載體。轉(zhuǎn)錄載體用以表達(dá)本身帶有原核核糖體結(jié)合位點(diǎn)和AUG起始密碼子的目的基因。只有3種轉(zhuǎn)錄載體：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。翻譯載體包括來自T7噬菌體主要衣殼蛋白的高效核糖體結(jié)合位點(diǎn)，用于表達(dá)那些不帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的目的基因選擇合適的載體需要考慮的因素：目的蛋白的應(yīng)用目的蛋白已知特定信息克隆策略,目的蛋白的應(yīng)用,分析級表達(dá)量的蛋白用于活性分析，篩選及確定突變，篩選配體相互作用，制備抗原等。大量活性蛋白用于結(jié)構(gòu)研究，作為試劑或制備親和基質(zhì)?？赡苡卸喾N載體都能滿足表達(dá)用于篩查或抗原制備所需的分析級表達(dá)量的要求，但是，能用于大量純化的載體-宿主菌-培養(yǎng)條件的最佳組合條件往往是唯一的。如果要連續(xù)生產(chǎn)大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索載體-宿主菌-培養(yǎng)條件的組合以便找到最佳條件，是非常值得的。,目的蛋白的已知特性,任何有關(guān)目的蛋白的信息都有助于選擇合適的載體。例如，有些蛋白表現(xiàn)活性要求一端或兩端均無外源序列。大多數(shù)pET載體可以克隆非融合序列；但是，如果特定翻譯起始序列在E.coli中不能被有效使用，表達(dá)水平也會受到一定的影響。在這種情況下，通常是構(gòu)建一種帶有高效表達(dá)的氨基末端序列的融合蛋白，并在純化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。,克隆策略,不同的克隆策略、對限制性酶切位點(diǎn)及閱讀框的不同要求，會影響對載體的選擇。許多pET載體具有同樣的限制性酶切位點(diǎn)，那么可以僅準(zhǔn)備一次目的插入片段，將其插入到多個(gè)載體中。不同的要求可以考慮采用不同的PCR克隆策略。,蛋白溶解性和細(xì)胞定位,一旦確定了用途和克隆策略，下一步就是判斷目的蛋白在細(xì)胞中的定位和可溶性。許多后續(xù)應(yīng)用要求目的蛋白以有活性的可溶狀態(tài)表達(dá)。大多數(shù)情況下，可溶性并非有或無的現(xiàn)象。正確選用合適的載體和宿主菌組合會明顯提高目的蛋白可溶部分比例及活性。載體可以通過三種方式增加可溶性：1)與本身溶解性高的多肽序列融合表達(dá)(GST，Trx及NusA)；2)與催化二硫鍵形成的酶融合表達(dá)(例如Trx，DsbA，及DsbC)；3)與信號序列融合表達(dá)，輸出到細(xì)胞周質(zhì)。包涵體有利于純化：容易通過離心收獲濃度高而相對純凈的蛋白；包涵體保護(hù)蛋白免受蛋白酶水解；毒性蛋白以無活性的包涵體形式表達(dá)，不會影響宿主菌的生長。有意采用包涵體復(fù)性方法多用于制備抗原或用于不特別要求正確折疊的應(yīng)用情況。pET-17xb以N端融合蛋白形式表達(dá)全長220aaT7基因10蛋白，并形成包涵體。pET-31b(+)也是表達(dá)融合蛋白包涵體的代表，非常適合制備小蛋白和多肽。,非融合表達(dá)，融合表達(dá)，分泌表達(dá),STag，T7TagGSTTag，HisTagTrxTag，NusTag,pET載體的融合標(biāo)簽,E.coli宿主菌,用于克隆的宿主菌,用于克隆的宿主菌通常是K12系列NovaBlue，JM109以及DH5a。這些菌株是recAendA型，轉(zhuǎn)化效率很高，且質(zhì)粒產(chǎn)量高，適合用于保存帶有克隆目的基因的pET載體。,用于表達(dá)的宿主菌,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到帶有染色體T7RNA聚合酶基因(T7gene1)的大腸桿菌中，即可開始生產(chǎn)蛋白了；所有B型菌株，B834，BL21，BLR，OrigamiB，Rosetta及Tuner都缺乏純化過程中降解蛋白的lon蛋白酶及ompT外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在這些菌株中的穩(wěn)定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株。BL21(DE3)是用得最多的表達(dá)菌；AD494(DE3)和BL21trxB(DE3)具有trxB突變，而Origami(DE3)，OrigamiB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)菌株帶有trxB和gor雙突變。擁有trxB和gor突變的菌株比單具trxB突變的菌株更有可能促進(jìn)二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高；多數(shù)氨基酸有不只一個(gè)密碼子，而不同的生物使用這61種密碼子的偏愛性不同。每種細(xì)胞里，tRNA種類和數(shù)量直接反映了其mRNA使用密碼子的種類和數(shù)量的偏愛性。當(dāng)外源目的基因mRNA在E.coli里過表達(dá)，由于密碼子偏愛性不同，會因?yàn)槿狈δ撤N或某幾種tRNA，直接導(dǎo)致翻譯終止或錯(cuò)誤。tRNA不足會造成翻譯停頓，早期翻譯停止，移碼突變，和氨基酸錯(cuò)摻等問題。Rosetta菌株是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。經(jīng)提高稀有tRNA水平，這些蛋白的表達(dá)會大幅度提高。,表達(dá)條件,培養(yǎng)基；抗生素；誘導(dǎo)劑；誘導(dǎo)溫度；誘導(dǎo)時(shí)機(jī)；誘導(dǎo)時(shí)間。,培養(yǎng)基,適于pET系統(tǒng)宿主菌生長及表達(dá)目的DNA的生長培養(yǎng)基種類很多，包括LB，TB，M9及M9ZB等,抗生素和誘導(dǎo)劑,氨芐青霉素作為一種選擇性抗生素的應(yīng)用需要相當(dāng)小心，因?yàn)?內(nèi)酰胺酶的表達(dá)可以達(dá)到相當(dāng)數(shù)量，并分泌到培養(yǎng)基中破壞所有的氨芐青霉素。另外由細(xì)菌代謝所造成的酸性環(huán)境也容易使氨芐青霉素水解。對于pBR322衍生質(zhì)粒，一般采用50g/ml氨芐濃度，當(dāng)培養(yǎng)基變混濁時(shí)（10E7細(xì)胞/ml）也就意味著氨芐的失效。200g/ml的氨芐濃度會使達(dá)到氨芐失效點(diǎn)的細(xì)胞濃度略有提高，但由于-內(nèi)酰胺酶的催化活性，即使加再多的氨芐也很難使細(xì)胞生長達(dá)到飽和時(shí)仍維持選擇壓力。,表達(dá)條件優(yōu)化,增加可溶性和折疊；稀有密碼子；毒性基因及質(zhì)粒穩(wěn)定性；其他因素。,增加可溶性和折疊,在許多應(yīng)用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在(蛋白可溶并不意味著蛋白正確折疊)。載體、宿主菌、蛋白序列和培養(yǎng)條件都會降低或升高蛋白可溶/不溶形式的比例。在通常情況下，降低蛋白合成速率，如降低誘導(dǎo)劑濃度，降低誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度及在基本培養(yǎng)基中生長都會使目的蛋白的可溶性增加。溫度：37生長常常會使一些蛋白累積形成包涵體，而30生長則可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白。在某些情況下，低溫(15-20)延長誘導(dǎo)時(shí)間（過夜）可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最大。裂解緩沖液的性質(zhì)會大大影響到目的蛋白可溶與不溶形式之間的比例。當(dāng)采用一般的裂解緩沖液如1HisBindBinding緩沖液（包括500mMNaCl）時(shí)，一些包含疏水或膜相關(guān)結(jié)構(gòu)域的蛋白可能被歸于不溶部分。在裂解緩沖液中加入毫摩爾的非離子型或雙性去污劑可以將由于與細(xì)菌脂或膜結(jié)合而不溶的蛋白組分轉(zhuǎn)變成可溶組分。包含高電荷結(jié)構(gòu)域的目的蛋白可能與其他一些細(xì)胞元件關(guān)聯(lián)（如可能與DNA結(jié)合）。在這種情況下目標(biāo)蛋白可能與細(xì)胞殘余在一起，理論上可以在裂解緩沖液中加入鹽或用Benzonase核酸酶消化核酸來解決這類問題。TrxTag、GSTTag和NusTag融合標(biāo)簽都是高度可溶的多肽，可增加目的蛋白的溶解性。許多蛋白需要形成二硫鍵才得以正確折疊并產(chǎn)生活性，Rosetta-gami菌株不僅是硫氧還蛋白還原酶(trxB)突變體，還是谷胱甘肽還原酶（gor）突變體，這進(jìn)一步增強(qiáng)了二硫鍵的形成。如果目的蛋白中含有一個(gè)或更多的關(guān)鍵二硫鍵，pET-32a-c(+)載體與Rosetta-gami菌株的組合可能是最佳的選擇。,稀有密碼子,多數(shù)氨基酸都有一個(gè)以上的密碼子，對E.coli密碼子應(yīng)用情況的分析表明一些密碼子很少使用。尤其是Arg密碼子AGA,AGG,CGG,CGA,Ile密碼子AUA,Leu密碼子CUA,Gly密碼子GGA和Pro密碼子CCC很少被用到。當(dāng)異源目的基因的mRNA在E.coli中過表達(dá)時(shí)，tRNA的數(shù)量直接反映了mRNA的密碼子偏倚性。由于一個(gè)或多個(gè)tRNA的稀有或缺少可能導(dǎo)致翻譯的停止。不充足的tRNA庫可能導(dǎo)致翻譯延遲、成熟前翻譯終止、翻譯移碼和氨基酸錯(cuò)配。盡管少量稀有密碼子的出現(xiàn)通常不會給目的蛋白的合成造成太大影響，不過如果一個(gè)基因中含有成串或多個(gè)E.coli稀有密碼子，外源蛋白的表達(dá)將非常低。目的基因中含過多的稀有密碼子被認(rèn)為是低表達(dá)水平和產(chǎn)生不完全產(chǎn)物的一個(gè)原因。Rosetta菌株被用來增加含有稀有Arg密碼子AGG和AGA，Ile密碼子AUA，Leu密碼子CUA,Pro密碼子CCC和Gly密碼子GGA目的蛋白的表達(dá)。tRNA由一個(gè)與pET載體相容的氯霉素抗性質(zhì)粒(以pACYC為骨架)帶有的自身啟動(dòng)子所表達(dá)。,毒性基因及質(zhì)粒穩(wěn)定性,pBR322質(zhì)粒及其衍生型（包括pET載體）在宿主菌中相當(dāng)穩(wěn)定，即使在沒有抗生素壓力的情況下培養(yǎng)數(shù)代，大部分宿主菌中仍保有這些質(zhì)粒。如果克隆入質(zhì)粒的外源基因產(chǎn)物對宿主菌具有毒性，就會遇到質(zhì)粒不穩(wěn)定的問題在pET系統(tǒng)中，可在菌株生長已受損害的情況下維持質(zhì)粒的存在和一定表達(dá)水平；缺乏質(zhì)粒的細(xì)胞可能由于質(zhì)?？截悢?shù)的降低或其他原因，其數(shù)量有所增加。在這種情況下，若沒有選擇壓力，不含質(zhì)粒的細(xì)胞將很快生長。如果要使大部分細(xì)胞都含有質(zhì)粒，培養(yǎng)基中一定不能沒有抗生素。帶有不穩(wěn)定質(zhì)粒的菌株在有氨芐抗生素選擇壓力的情況下生長，一旦足夠的-內(nèi)酰胺酶分泌破壞了氨芐青霉素之后，缺乏質(zhì)粒的細(xì)胞將不再被殺死，并開始快速生長。pLysS溶原菌對帶毒性基因的載體的耐受性有所提高：不穩(wěn)定的質(zhì)粒變得穩(wěn)定，可以達(dá)到最低的本底表達(dá)，防止毒性基因泄露。對于毒性極大的基因，帶有T7lac啟動(dòng)子的質(zhì)粒和pLysS宿主菌是最佳選擇。沒有了來自pLysS質(zhì)粒的T7溶菌酶，細(xì)胞穩(wěn)定期本底表達(dá)水平就會提高。如果外源基因有毒性，在液體培養(yǎng)基和瓊脂平板中加入0.51%葡萄糖以維持質(zhì)粒穩(wěn)定是非常必要的。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)，葡萄糖會作為第一碳源首先被利用，而后才是甘油等碳源。替代碳源的代謝導(dǎo)致lDE3溶原菌中環(huán)AMP(cAMP)水平提高，從而刺激lacUV5啟動(dòng)子指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，T7RNA聚合酶表達(dá)。,例1:載體對表達(dá)的影響,pET32,BL21(DE3),表達(dá)的蛋白:Trx-His6-EK-