不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳培訓課件.ppt

生化與分子生物學技術(shù),中山醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室,不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,一、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗操作及注意事項,實驗分組（每人做一管，每組配一份膠）認清試劑（試劑和吸管對號、量器的使用）封管分離膠配制與灌膠（濃度為6%，化學聚合，每組總體積為10ml，灌膠高度為78cm）封正丁醇3mm（手法、高度、觀察界面變化和判斷凝固、時間掌握25min）,注意事項：1、封管要嚴，防止漏液。2、固定玻璃管要豎直，防止夾碎。3、每組配一份膠，試劑與移液管對號，準確加量。4、配膠后立即灌膠（用滴管灌膠，用后立即清洗）5、正丁醇沿管壁緩緩加入,濃縮膠配制（濃度為3%，光聚合，每組總體積為8ml，灌膠高度為1.5cm,留1cm空隙加樣）倒掉正丁醇灌濃縮膠封正丁醇3mm（觀察界面，判斷凝固時間）安裝電泳槽（結(jié)構(gòu)、原理、電流及電極的方向、不漏水、除氣泡）,注意事項：1、倒掉正丁醇，用濾紙吸干再灌濃縮膠。2、配膠后立即灌膠（用滴管）3、灌膠后立即清洗滴管，防止膠凝固于管中。4、撕掉封口膜，用膠塞將玻璃管固定于電泳槽上（豎直，防漏）5、加電極緩沖液（注意液面）,加buffer樣品處理并加樣（20ul）電泳（6mA/管，距底1cm時停止）剝膠,固定（時間5min）,染色（時間2min）,漂洗脫色至背景透亮,二、電泳基本原理及相關(guān)知識,電泳的概念,帶電粒子（膠體顆粒、離子等）在電場的作用下在特定的介質(zhì)中向與其電荷性質(zhì)相反的電極方向定向泳動的現(xiàn)象。廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離和鑒定,電泳的基本原理,利用物質(zhì)的兩個差異來分離物質(zhì),電荷差異電荷性質(zhì)電荷數(shù)量,分子差異分子大小分子形狀,電泳分離蛋白質(zhì)的原理,蛋白質(zhì)兩性解離與等電點溶液pH與蛋白質(zhì)PI決定蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)與數(shù)量不同蛋白質(zhì)分子大小和分子形狀的差異,實驗室中常用到的電泳方法（以介質(zhì)分類）,紙電泳醋酸纖維膜電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳,原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethylethylenediamine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。,聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍適用的凝膠濃度/(%)蛋白質(zhì)10420-301-410415-201-5104-110510-1511055-1051052-5核酸(RNA)10415201041055-10105-21062-2.6,聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。,蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大小，就可以用電泳技術(shù)測定蛋白質(zhì)的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都不一樣，約為18A，這樣的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原來的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質(zhì)的分子量。,SDS-PAGE,三、聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)的原理,不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的三個不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的三個效應(yīng),凝膠孔徑緩沖液pH緩沖液離子成分,濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng),Gly-,Pro-,Cl-,Gly-,Pro-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Pro-,Pro-,Pro-,Gly-,Gly-,Gly-,pH為8.9的電泳緩沖液（Tris-Gly）,pH為6.7的濃縮膠,pH為8.3的分離膠,有效泳動率：MCl-MPro-MGly-,6%膠,3%膠,不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。,樣品濃縮效應(yīng)(1)凝膠孔徑不連續(xù)性：(2)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；在pH6.7的凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-)尾隨離子(trailingion)或慢離子：甘氨酸根(甘氨酸等電點：5.97)mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；(3)電位梯度的不連續(xù)性：分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng),四、實驗結(jié)果的分析,相關(guān)理論,表-1血清中各蛋白質(zhì)的相關(guān)特性,種類,分子量(萬）,PI,分布(%),清蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,