細胞工程與環(huán)境

細胞工程摘要細胞工程即在細胞水平上應用細胞生物學和分子生物學等學科的理論和技術。構建環(huán)境工程菌、抗污染型植物以及基于抗體的環(huán)境治理等技術越來越廣泛地應用到環(huán)境治理當中。本文簡要介紹了細胞工程、細胞融合、細胞固定化的基本概念及其在環(huán)境治理中國內外的應用狀況，并提出展望。關鍵詞細胞工程；細胞融合；細胞固定化；ABSTRACTCELLENGINEERINGISAPPLICATIONOFCELLBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGYDISCIPLINESTHEORYANDTECHNOLOGYATTHECELLULARLEVELBUILDENVIRONMENTENGINEERINGBACTERIA,ANTIPOLLUTIONPLANTSANDENVIRONMENTALPROTECTION,BASEDONANTIBODYTECHNOLOGY,AREMOREANDMOREWIDELYUSEDINENVIRONMENTALGOVERNANCETHISPAPERBRIEFLYINTRODUCESTHECELLENGINEERING,CELLFUSION,THEBASICCONCEPTSOFTHEIMMOBILIZEDCELLSANDITSAPPLICATIONINENVIRONMENTALGOVERNANCE,BOTHINSIDEANDOUTSIDECHINAANDPUTFORWARDTHEPROSPECTKEYWORDSCELLENGINEERINGCELLFUSIONIMMOBILIZATION1構建環(huán)境工程菌11細胞融合在外界因素誘導劑或促融劑的作用下，兩個或兩個以上的異源種、屬間細胞或原生質體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞的現象稱為細胞融合CELLFUSION1。以細胞融合技術為首的多種細胞工程技術如細胞培養(yǎng)、細胞固定化等技術越來越廣泛地應用到環(huán)境治理當中。原生質體融合技術作為高頻重組的有效方法和遺傳學研究工具，打破了不同物種間屬間、門間進行基因重組的天然障礙，為把多個不同親本優(yōu)良性狀進行融合提供了一個有利手段，并擴大了重組幅度，成為一種新的微生物育種技術1。原生質體融合技術由于可以構建生物新品種，同時又不屬于“轉基因生物”，不產生基因污染和安全性問題，會在微生物降解污染物的應用方面越來越廣，越來越受到重視，尤其環(huán)境污染越來越嚴重的今天，更顯示出其他技術無法比擬的優(yōu)越性2。12固定化固定化細胞技術是指將微生物固定在載體上使其高度密集并保持生物活性功能，在適宜的條件下還可增殖以滿足應用之需的生物技術；它利用某些化學或物理手段將游離細胞定位于限定的區(qū)域，使其保持活性并可反復利用3。2004年，有人嘗試了用改進的PVA硫酸鹽包埋法進行固定化藻細胞，用該法制得的固定化小球機械強度高，透光性和傳質性能較好，能滿足藻細胞光合作用和微生物生長的要求，可用于營養(yǎng)物濃度較高的城市生活污水處理體系，是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ男滦凸潭ɑ⑸锓椒āＳ么斯潭ɑ椒ǖ玫降牡鞍缀诵∏蛟搴突钚晕勰喙补潭w系對含高濃度氮、磷的廢水有良好的處理效果，而且無需額外的預處理過程4。2010年，劉望才等進行了新型固定化方法生物處理含酚廢水的研究5。李賢玉等用CACL2作為固化劑，采用化學交聯法研究制備聚乙烯醇PVA固定化微生物凝膠，獲得了具有較高力學強度和通透性的PVA凝膠小球用于污水處理。所得到的凝膠小球的保留率及強度較高，通透性較好6。另外，有學者比較了固定化狀態(tài)和懸浮狀態(tài)的工程菌的降解效果，發(fā)現固定化工程菌的降解活性較后者明顯降低，其比降解速率大約僅為后者的20?？疾旃潭ɑこ叹L期運行的效果，發(fā)現其降解活性保存良好，工程菌穩(wěn)定性大大提高，未出現固定化細胞溶漲、破碎現象。固定化后，工程菌的比降解速率雖然比懸浮工程菌降低了，但固定化工程菌更適用于長期運行的廢水處理系統(tǒng)7。傳統(tǒng)的未固定化處理的工程菌在活性污泥處理系統(tǒng)中流失嚴重，一些研究表明，采用基因工程菌的生物強化技術可以顯著提高系統(tǒng)的處理效率，擴大底物利用范圍，提高系統(tǒng)的抗沖擊負荷的能力8。采用固定化基因工程菌強化處理與傳統(tǒng)活性污泥處理串聯工藝，實現對高濃度高負荷污水的生物強化處理，避免出現大量工程菌流失的現象，同時在固定化顆粒的表面以及淺層均觀察到了大量工程菌菌體，固定化顆粒的表面還出現了生物膜和菌膠團9。13工程菌的實際應用131難降解有機污染物難降解有機污染物是指幾乎不能被微生物降解，或降解所需時間非常長，已不可能被利用來控制該有機物對環(huán)境的危害的那些有機化合物，如鹵代脂肪烴、鹵代酯、單環(huán)芳香化合物、酚和甲酚類、鄰苯二甲酸酯、多環(huán)芳香烴、氮代化合物、多氯聯苯、有機氯蟲劑、有機磷殺蟲劑、氨基甲酸酯殺蟲劑和除草劑等10，生物可利用性低，其工程菌的構建主要包括以下兩個方面11其一，工程菌代謝途徑的改造，單一的代謝途徑很難把POPS徹底降解，污染物降解到完全礦化一般需要不同層次的降解酶的共同作用，即共代謝降解作用。其二，工程菌構建的細胞融合技術，將能夠產生生物表面活性劑（可以降低多環(huán)芳烴在環(huán)境中的毛細管張力和提高其在水中的溶解性，使多環(huán)芳烴從固相轉移到水相）的細菌與高降解菌進行融合，從而增加了環(huán)境生物對POPS的利用率。該工程菌構建的應用具有重要的研究價值，很多學者在多個領域進行了研究和探索。（1）苯酚廢水采用雙親滅活原生質體融合技術選育的一株高效苯酚降解菌株，比出發(fā)菌株降解苯酚能力提高20，能降解苯酚的最高濃度達到1800MGL1。以海藻酸鈉為載體，將高效苯酚降解菌進行固定化，固定化細胞能降解苯酚的最高濃度提高為2200MGL1，比游離菌體的降酚能力約提高2212。（2）農藥殘留許多農田受到農藥殘留的污染往往是有機磷和有機氯類農藥的混合污染。將有機磷水解酶基因的質粒導人降解有機氯的工程菌中，構建了能夠同時降解有機磷和有機氯類農藥殘留生物降解的工程菌。通過在大腸桿菌表面表達有機磷水解酶，使酶與底物充分接觸提高了全細胞降解活性。同時，該工程菌通過融合綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光以便于該工程菌在線監(jiān)測中的應用13。酯酶B1是有機磷抗性庫蚊體內產生的一類水解酶,它能有效的水解有機磷、有機氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等四大類農藥。酯酶B1基因在原核細胞中有兩種表達形式，一種是非融合表達，另一種是融合表達，為進一步提高工程菌的酯酶活性，為其應用于生產實踐創(chuàng)造條件，筆者研究了酯酶B1基因在大腸桿菌中的融合高效表達，獲得轉解毒酶基因工程菌，并對其進行固定化研究，結果表明固定化工程菌株對有機磷農藥有高效降解能力。這將為清除有機磷農藥污染提供一些幫助14。有機磷農藥在農業(yè)生產中得到了廣泛使用，但是其高毒、高殘留等不利因素也給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來巨大威脅。冰核活性細菌的分離鑒定，從植物凍傷組織中分離到一株具有冰核活性的細菌；利用丁香假單胞菌的冰核蛋白N末端作為錨定單元構建了表面展示有機磷水解酶大腸桿菌基因工程菌，比文獻報道的大腸桿菌細胞表面展示的有機磷水解酶的最高酶活性高13倍；將融合基因連接到廣宿主表達載體PYMBP上，轉化到野生型惡臭假單胞菌進行培養(yǎng)，以獲得最大全細胞酶活性15。132重金屬發(fā)展生物降解性能好、環(huán)保和可持續(xù)的工程菌對重金屬的去除具有重大意義，土著菌的改造尤其是關鍵16，發(fā)展生物降解性能好、環(huán)保和可持續(xù)工程菌的關鍵見圖1。土著工程菌金屬平衡的基因在生物和非生物環(huán)境生存的能力金屬螯合劑和轉運基因環(huán)境可持續(xù)的生物修復能力提高降低風險的基因金屬吸收的調節(jié)基因生物可降解酶圖1發(fā)展生物降解性能好、環(huán)保和可持續(xù)工程菌的關鍵國外很多學者在這方面進行了深入的研究，有關工程菌修復重金屬的實例很多，見表1。表1國外有關工程菌修復重金屬的實例16細菌基因表達重金屬修復引用真氧產堿桿菌RALSTONIAEUTROPHACH34金屬硫蛋白METALLOTHIONEINCD2實驗室小試VALLSETAL2000抗輻射球菌DEINOCOCCUSRADIODURANSSTRAINSHG抗性基因HG來自于核武器的放射性廢物BRIMETAL2000大腸桿菌、莫拉克斯氏菌屬ESCHERICHIACOILANDMORAXELLASP表達EC20CD和HG實驗室小試BAEETAL2001,2003大腸桿菌菌株ECOLISTRAIN有機汞制劑ORGANOMERCURIALLYASEHG印度地理位置獨特的地區(qū)MURTAZAETAL2002熒光假單胞菌PFLUORESCENS4F39NI轉運系統(tǒng)NI實驗室小試LOPEZETAL2002生根瘤菌屬MESORHIZOBIUMHUAKUII植物螯肽合成酶PHYTOCHELATINSYNTHASE,PCSCD2稻田實驗SRIPRANGETAL2003B3惡臭假單胞菌株PPUTIDASTRAIN鉻酸鹽還原酶CHROMATEREDUCTASECR細菌培養(yǎng)物及其懸浮液ACKERLEYETAL2004大腸桿菌菌株ECOLISTRAIN金屬調節(jié)蛋白METALLOREGULATORYPROTEINARASROVEREXPRESSINGELP153ARAS污染的飲用水和地表水KOSTALETAL2004大腸桿菌ECOLISE5000NI轉運系統(tǒng)和金屬硫蛋白NI水中NI2的累積DENGETAL2005大腸桿菌ECOLIJM109HG2轉運和金屬硫蛋白HG實驗室小試ZHAOETAL2005大腸桿菌菌株ECOLISTRAIN絲氨酸乙酰轉移酶的高表達NI和CO實驗室小試FREEMANETAL2005氧化亞鐵硫桿菌株ACIDITHIOBACILLUSFERROOXIDANSSTRAINHG離子轉運基因表達HG實驗室小試SASAKIETAL2005惡臭假單胞菌PPUTIDA06909金屬結合肽的表達EC20CD多重金屬污染地WUETAL2006假單胞菌屬PSEUDOMONASK62表達HG轉運和有機汞制劑HG污染地的水銀KIYONOANDPANHOU2006大腸桿菌菌株ECOLISTRAINPCS基因表達SPPCSCD2微生物吸附劑對CD的去除KANGETAL2007大腸桿菌ECOLIJM109CD轉運和金屬硫蛋白NAMELYM4CD水中CD的去除DENGETAL2007大腸桿菌菌株ECOLISTRAIN金屬硫蛋白MTAS來自于細菌培養(yǎng)物SINGHETAL2008大腸桿菌菌株ECOLISTRAINASS腺苷甲硫氨酸甲基轉移酶基因AS來自于細菌培養(yǎng)物YUANETAL2008熒光假單胞菌OS8大腸桿菌甲基纖維素1061MERR/CADC/ZNTR/PMER/PCADA/PZNTACD,ZN,HG,PBBONDARENKOETAL2008假單胞菌屬PSEUDOMONASK62MEREPROTEINENCODEDBYTRANSPOSONTN21BROADHGTRANSPORTERHG細胞膜外KIYONOETAL2009無色桿菌屬ACHROMOBACTERSPAO22HG還原酶基因表達HG污染地的生物修復NGETAL2009莢膜甲基球菌屬METHYLOCOCCUSCAPSILATUSBATHCRRGENESFORCRVIREDUCTASEACTIVITY還原酶活性CRVICELLASSOCIATEDCRREMOVALINLABORATORYCONDITIONSHASINETAL2010CAULOBACTERCRESCENTUSJS4022/P7236HRSAA6HISFUSIONPROTEINCDPATELETAL2010鞘氨醇單胞菌芽孢桿菌屬SPHINGOMONASDESICCABILISANDBACILLUSIDRIENSISSTRAINSOVEREXPRESSIONOFARSMGENEAS實驗室小試LIUETAL2011枯草桿菌BSUBTILISBR151PT0024LUMINESCENTCDSENSORSCD土壤污染LVASKETAL2011133飲用水的凈化生物膜深度處理飲用水源苯并芘方法，融合白腐真菌、土著細菌YZ、釀酒酵母三個親株真核原核細胞的原生質體，通過基因在同一個細胞內的重組整合，構建獲得基因工程菌用所述特效菌。生物膜反應器深度處理飲用水源苯并芘的方法是基因工程菌劑引入裝有活性炭載體的柱狀反應器中，悶曝馴化掛膜使基因工程菌在活性炭載體上形成生物膜；之后將飲用水源水引入反應器中，調試處理之后進入穩(wěn)定處理運行階段17。2抗污染型植物土壤中重金屬的污染治理通常是將從金屬污染的土壤提取金屬并把它轉移和去除?？刮廴拘椭参锏拈_發(fā)與增強其金屬吸收、積累和耐毒性等性能的研究意義非凡。細胞工程對于發(fā)展理想的植物修復的植物，提高金屬積累能力至關重要18。構建抗污染型植物的細胞工程技術，主要包括原生質體培養(yǎng)、體細胞雜交和體細胞無性系變異19。原生質體培養(yǎng)和體細胞雜交是植物細胞工程的核心技術之一，為克服植物遠緣雜交不親和性，創(chuàng)造新的種質資源，實現植物遺傳轉化和進行細胞學的基礎研究提供了重要的技術支撐。體細胞無性系變異是指植物體細胞在植物組織培養(yǎng)過程中產生的變異。利用人工誘變創(chuàng)造體細胞無性系變異，已成為植物細胞工程育種的重要技術。人工誘變方法包括物理誘變C射線、X射線、中子、電子束、離子束、激光、紫外線、空間環(huán)境、化學誘變甲基磺酸乙酯、秋水仙素、疊氮化鈉、平陽霉素、5BU、EB等和生物誘變轉座子插入突變、跳躍基因等。構建抗污染型植物的細胞工程在實際植物細胞工程的應用見表2。表2在不同植物中利用轉基因的方法增強其對重金屬的吸收18金屬植物方法參考文獻BRASSICANAPUS歐洲油菜EXPRESSIONOFBACTERIALACCDEAMINASEGENEACC脫氨酶基因表達的細菌STEARNSETAL2005NIARABIDOPSIS擬南芥EXPRESSIONOFNICOTIANAMINESYNTHASECDNA煙草胺合成酶的表達的互補PIANELLIETAL2005BRASSICAJUNCEA芥菜OVEREXPRESSIONOFGAMMAGLUTAMYLCYSTEINESYNTHETASEANDGLUTATHIONESYNTHETASE谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶的高效表達BENNETTETAL2003REISINGERETAL2008ARABIDOPSIS擬南芥OVEREXPRESSIONOFARABIDOPSISPHYTOCHELATINSYNTHASEATPCS1擬南芥植物螯合肽合成酶的高效表達LEEETAL2003CDARABIDOPSIS擬南芥EXPRESSIONOFYEASTABCTRANSPORTERFAMILYMEMBER,YCF1轉運蛋白酵母的表達SONGETAL2003ARABIDOPSIS擬南芥EXPRESSIONOFYEASTABCTRANSPORTERFAMILYMEMBER,YCF1轉運蛋白酵母的表達SONGETAL2003BRASSICAJUNCEA芥菜OVEREXPRESSIONOFAYEASTCADMIUMFACTOR1YCF1一個鎘因子酵母的表達BHUIYANETAL2011APBBRASSICAJUNCEA芥菜OVEREXPRESSIONOFATPBINDINGCASSETTEABCTRANSPORTERGENEATATM3蛋白轉運基因的高效表達BHUIYANETAL2011BNICOTIANATABACUM煙草EXPRESSIONOFYEASTMETALLOTHIONEINCUP1GENE金屬硫蛋白CUP1基因酵母的表達THOMASETAL2003POPULUSALBA白楊樹EXPRESSIONOFPSMTA1GENEFROMPISUMSATIVUM豌豆BALESTRAZZIETAL2009CUARABIDOPSIS擬南芥EXPRESSIONOFYEASTCOPPERDEPENDENTTRANSCRIPTIONFACTORACE1銅依賴轉錄因子酵母XUETAL2009ARABIDOPSISOVEREXPRESSIONOFZNINDUCEDFACILITATOR1ZIF1鋅誘導HAYDONANDCOBBETT2007BRASSICAJUNCEA芥菜OVERPRODUCTIONOFTHEGGLUTAMYLCYSTEINESYNTHETASEANDGLUTATHIONESYNTHETASE谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽合成酶BENNETTETAL2003ZNNICOTIANATABACUM煙草OVEREXPRESSIONOFGLYOXALASEPATHWAYENZYMES醛酮變位酶通道酶SINGLAPAREEKETAL2006HGARABIDOPSIS擬南芥EXPRESSIONOFBACTERIALGAMMAGLUTAMYLCYSTEINESYNTHETASEGENEUNDERCONTROLOFASTRONGCONSTITUTIVEACTINREGULATORYSEQUENCEA2一個強大的肌動蛋白監(jiān)管序列控制下細菌合成酶基因LIETAL2005NICOTIANATABACUM煙草EXPRESSIONOFPPKGENESPECIEDBACTERIALPOLYPHOSPHATEPOLYP多磷酸鹽細菌NAGATAETAL2006NICOTIANATABACUM煙草EXPRESSIONOFAMODIFIEDBACTERIALHGREDUCTASE,MERAGENE修改后的汞細菌還原酶HEATONETAL2005ARABIDOPSIS擬南芥EXPRESSIONOFBACTERIALGAMMAGLUTAMYLCYSTEINESYNTHETASEGENEUNDERCONTROLOFASTRONGCONSTITUTIVEACTINREGULATORYSEQUENCEA2一個強大的肌動蛋白監(jiān)管序列控制下細菌合成酶基因LIETAL2005BRASSICAJUNCEA芥菜OVEREXPRESSIONOFATPSULFURYLASE硫酸化酶WANGELINEETAL2004ASBRASSICANAPUS歐洲油菜EXPRESSIONOFENTEROBACTERCLOACAE陰溝腸桿菌UW41AMINOCYCLOPROPANE1CARBOXYLATEACCDEAMINASE脫氨酶EC41994GENENIEETAL20023基于抗體的環(huán)境污染治理技術本文采用碳二亞胺縮合方法合成了軟海綿酸與不同蛋白載體偶聯物，分別用作免疫抗原和包被抗原，免疫BALB/C鼠，采用細胞融合技術，制備了抗腹瀉性貝毒主要成份軟海綿酸的1種多克隆抗體、2種單克隆抗體，研究了應用這些抗體發(fā)展建立軟海綿酸的間接競爭酶聯免疫檢測和膠體金標記免疫層析檢測技術20。建立了水中硝基苯胺測定的間接競爭酶聯免疫測定方法，精密度和準確度均符合殘留測定的要求。該方法可用于地下水、地表水、飲用水等不同水樣硝基苯胺的檢測。與HPLC方法比較，本方法的主要優(yōu)點在于不需要復雜的樣品前處理，水樣可直接用于檢測，不需要昂貴的儀器設備21。4展望采用紫外誘變與原生質體融合聯用的方法對好氧反硝化菌株進行育種22。首次利用PEG細胞融合技術構建融合子菌株，降解處理印染廢水23。都為細胞工程的發(fā)展提供了廣闊的前景。參考文獻1趙志強,鄭小林,張思杰等細胞融合技術J生物學通報,2005,401040412盧靜,黨志,郭楚玲PAHS降解菌的細胞融合及降解菲的性能研究J第六屆全國環(huán)境化學大會,20083楊意東,趙麗君高濃度有機廢水固定化生物處理技術的研究J給水排水,20004黃國蘭,王媛,孫紅文等固定化藻菌共生系統(tǒng)及其脫硫除磷作用研究Z國家科技成果,20045劉望才,金誼,高浩其等新型固定化方法生物處理含酚廢水的研究Z國家科技成果,20086李賢玉,葉林污水處理用聚乙烯醇凝膠的制備及結構與性能研究A2009年全國高分子學術論文報告會論文摘要集（下冊）C,20097謝珊,劉俊新,李琳等利用基因工程菌BL21處理有機磷混合農藥廢水的研究J環(huán)境工程學報,20088BOONN,TOPEM,VERSTRAETEW,ETALBIOAUGMENTATIONASATOOLTOPROTECTTHESTRUCTUREANDFUNCTIONOFANACTIVATEDSLUDGEMICROBIALCOMMUNITYAGAINSTA3CHLOROANILINESHOCKLOADJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,200