菌落總數(shù)、大腸菌群測(cè)定方法

1、菌落總數(shù)和大腸菌群測(cè)定（固體樣品） 藥 品： 1、平板計(jì)數(shù)瓊脂 2、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（ LST） 3、煌綠乳糖膽鹽肉湯（ BGLB） 4、氯化鈉 設(shè)備材料： 燒杯 、三角瓶、廣口瓶、培養(yǎng)皿、刻度吸管、倒氣管、玻璃 棒、試管、硅膠塞、洗耳球、棉花、布或報(bào)紙等。 一、準(zhǔn)備工作 （指導(dǎo)書(shū)是按一個(gè)樣品所需物品準(zhǔn)備的，實(shí)驗(yàn)室可按樣品量增加） 1、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基準(zhǔn)備 用于菌落總數(shù)測(cè)定 將三角瓶 放在電子稱上，去皮，按平板計(jì)數(shù)瓊脂使用說(shuō)明稱量，加 200ml 蒸餾水 攪拌，放電爐上煮沸加熱煮沸，充分溶解，蓋上硅膠塞， 用報(bào)紙或布包好，再用橡皮筋扎緊。 2、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨 （LST） 肉湯

2、用于大腸菌群測(cè)定 （a） 將燒杯放在電子稱上，去皮，按使用說(shuō)明稱量，加100ml蒸 餾水?dāng)嚢瑁烹姞t上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml （毫升）的吸管分裝到9支（18*180規(guī)格）試管中，每 支試管加10ml的月桂基溶液LST（合計(jì)90毫升）。 （ c） 9 支試管分別放入 倒氣管 （開(kāi)口向下），排氣，蓋上硅膠塞。 3、%的生理鹽水 用于樣品稀釋 將廣口瓶去皮，稱取氯化鈉加225ml蒸餾水，搖勻，用報(bào)紙或布包 好，再用橡皮筋扎緊； 同樣配制第二瓶。 4、準(zhǔn)備 2 個(gè)空試管，蓋上硅膠塞 用于樣品稀釋。 5、準(zhǔn)備 8 個(gè)培養(yǎng)皿，用布包扎好。 6、準(zhǔn)備至少3支5ml和1支10ml帶有刻度的吸管，用

3、布包扎好（頂部 可用棉球塞住，防止吸液時(shí)，液體不慎吸入洗耳球） 。 7、準(zhǔn)備操作的工具：剪刀 1 把、鑷子 1 個(gè)、勺子等打開(kāi)產(chǎn)品包裝所需 工具，用布包扎好。 二、使用滅菌鍋滅菌 1 、檢查滅菌鍋底部加熱管水位是否正常，水位要高過(guò)加熱絲。 2 、將上面準(zhǔn)備好的 7 步驟物品逐一放入鍋內(nèi)，注意：滴定管吸口 向下，有棉球的向上。 3 、蓋上滅菌鍋蓋子時(shí)，將排氣管插到排氣口內(nèi)，注意從對(duì)角線開(kāi) 始擰緊螺絲，將排氣閥打開(kāi)（安全閥始終關(guān)閉） ，通電后，待排氣閥放 氣 3 分鐘后（鍋內(nèi)冷空氣已經(jīng)排完） ，關(guān)閉排氣閥。 4 、查看滅菌鍋的壓力表，當(dāng)溫度升到 121，壓力升到（兆帕）時(shí)， 滅菌維持 1 5分鐘后

4、（溫度和壓力不能過(guò)高或者過(guò)低 ） ，斷電自然冷卻到 接近“ 0”度后，慢慢打開(kāi)排氣閥，再對(duì)角擰開(kāi)滅菌鍋。 三、無(wú)菌操作 進(jìn)無(wú)菌室前的準(zhǔn)備：放好工具（酒精燈，記號(hào)筆，消毒用75%酒精 棉球，洗耳球，電子稱），打開(kāi)紫外線殺菌燈，殺菌 30分鐘后關(guān)閉，再 等 10 分鐘后進(jìn)入無(wú)菌室。（無(wú)菌室緩沖間應(yīng)放有：白色衣服、帽子、鞋 子和口罩等）。 1 、待滅菌鍋?zhàn)匀焕鋮s后，取出 6 件滅菌好的物品，留下平板計(jì)數(shù) 瓊脂培養(yǎng)基（PCA）在滅菌鍋里待用（該液體涼后會(huì)凝固，應(yīng)保持溫度50C 左右）。 2、用 75%的酒精棉球消毒手和操作臺(tái)面。 3、點(diǎn)著酒精燈，準(zhǔn)備接種，接種過(guò)程在酒精燈周?chē)?0cm范圍進(jìn)行。 4、無(wú)

5、菌操作 A 、拿出第一瓶生理鹽水，用10毫升的吸管分別吸9ml生理鹽水 加入 2個(gè)空的試管中，再吸 1ml 的生理鹽水，放入 1 個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)（這是 生理鹽水空白試驗(yàn)用的）。（10ml吸管使用3次，不再使用） B 、準(zhǔn)備制樣， 用 75%的酒精棉球擦拭樣品包裝準(zhǔn)備開(kāi)口處， 拿出 第二瓶生理鹽水，放在電子稱上，去皮，稱取或量取 25g （mL樣品， 放入 225ml 生理鹽水中充分搖勻， 制成稀釋 10 倍的檢測(cè)樣品，即 10-1 溶液。（注意搖勻）（見(jiàn)書(shū)中最后 1 頁(yè)圖） C 、取出第一個(gè) 5ml 的吸管，吸取 5ml 的“檢測(cè)樣品 10-1溶液”， 分別放入2個(gè)培養(yǎng)皿和3個(gè)試管中，各放1ml,

6、再吸取1ml “檢測(cè)樣品 1 0-1溶液”放入 9ml 生理鹽水的試管中， 制成稀釋 100 倍的檢測(cè)樣品， 即 10-2 溶液。（注意搖勻） D 、取出第二個(gè) 5ml 的吸管,吸取 5ml 的“檢測(cè)樣品 10-2溶液”,分 別放入2個(gè)培養(yǎng)皿和3個(gè)試管中，各放1ml，再吸取1ml放入9ml生理 鹽水的試管中, 形成稀釋 1000倍的檢測(cè)樣品, 即 10-3溶液。 （注意搖勻） E 、取出第三個(gè) 5ml 的吸管，吸取 5ml 的“檢測(cè)樣品 10-3溶液”，分 別放入2個(gè)培養(yǎng)皿和3個(gè)試管中，各放1ml。（注意搖勻）（詳見(jiàn)書(shū)中最 后 1 頁(yè)圖）。 F、取出滅菌鍋內(nèi)的三角瓶（平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 （PC

7、A），用手感 覺(jué)瓶子熱度（以 45-50 度為宜，過(guò)熱或過(guò)低均不行） ，分別倒入 8 個(gè)培 養(yǎng)皿內(nèi) 15-20ml 平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，注意倒入時(shí)僅拿開(kāi)一點(diǎn)點(diǎn)蓋子，并在 酒精燈邊上操作，左右搖勻，待平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基凝固后，倒置培養(yǎng)皿。 其中有 1 個(gè)培養(yǎng)皿是用于做 平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 空白試驗(yàn)的。 四、培養(yǎng) 要求培養(yǎng)箱溫度在（ 361）度，培養(yǎng)時(shí)間在（ 48 2）小時(shí)，將 8 個(gè)培養(yǎng)皿（倒置）和 9 個(gè)試管均放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。 五、檢查結(jié)果、計(jì)算 （1）計(jì)算大腸菌群： 培養(yǎng)24h取出9個(gè)試管，觀察是否有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，渾濁即為產(chǎn)酸、 倒氣管懸空即為產(chǎn)氣，有幾個(gè)試管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，即準(zhǔn)備做幾個(gè)煌綠乳糖膽 鹽肉

8、湯試管，煌綠和月桂基硫酸鹽胰蛋白胨 （LST） 肉湯，做法同樣！即： 看藥品使用說(shuō)進(jìn)行配制， 稱量- 煮沸溶解 - 分裝- 加入倒氣管 - 排氣- 塞硅膠塞 - 滅菌備用。 1 類結(jié)果：均無(wú)產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，繼續(xù)培養(yǎng) 24h， 檢驗(yàn)值是： 30MPN/100g。 2 類結(jié)果： 煌綠試管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象， 查看各稀釋度產(chǎn)酸產(chǎn)氣個(gè)數(shù)， 對(duì)照書(shū)中“倒數(shù)第 2 頁(yè)”表格，找出結(jié)果后乘以 100，再保留 2位有效 數(shù)字（例如：X 102） （ 2）計(jì)算菌落總數(shù)： 取出 8 個(gè)培養(yǎng)皿，逐一觀察，不論菌落大小，連在一起的計(jì)算為 1 個(gè)，如果菌落比較多，可以分成 4個(gè)區(qū)來(lái)計(jì)數(shù)。 1 類結(jié)果：空白試驗(yàn)的 2 個(gè)培養(yǎng)皿，發(fā)現(xiàn)菌落，則