(發(fā)酵分析)分子雜交

1、( (發(fā)酵分析發(fā)酵分析) )分子雜交分子雜交一、一、 分子雜交簡介分子雜交簡介二、核酸分子雜交技術(shù)二、核酸分子雜交技術(shù)三、蛋白雜交技術(shù)三、蛋白雜交技術(shù)四、生物芯片技術(shù)四、生物芯片技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)1 DNA1 DNA變性變性 DNA雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團(tuán)，因而發(fā)生性質(zhì)改變（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等） 。二、核酸分子雜交技術(shù)二、核酸分子雜交技術(shù)（一）基本概念（一）基本概念2 DNA2 DNA復(fù)性復(fù)性 DNA發(fā)生熱變性后，經(jīng)緩慢降溫，例如放置室溫逐漸冷卻，解開的互補(bǔ)鏈之間對應(yīng)的堿基對再形成氫鍵，恢復(fù)完整的雙螺

2、旋結(jié)構(gòu)，稱DNA熱變性的復(fù)性。3 3 核酸分子雜交核酸分子雜交 概念：概念：具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下，具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下，按堿基配對原則形成雙鏈的過程。按堿基配對原則形成雙鏈的過程。復(fù)性RNADNA4 4 探針探針4.1 探針的概念探針的概念 一小段用放射性同位素、生物素或熒光染料進(jìn)行標(biāo)記的已知序列的核酸片段，即為探針（probe）。探針可用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。4.2 探針的分類探針的分類根據(jù)標(biāo)記物不同根據(jù)標(biāo)記物不同可分為放射性探針和非放射性探針兩大類； 放射性標(biāo)記物（ -*N-dNTP ）32p(14d)

3、、35S(87d)、3H(12y)和125I(60d) 非放射性標(biāo)記物半抗原：生物素、地高辛熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。 4.3 探針的標(biāo)記方法探針的標(biāo)記方法 放射性標(biāo)記放射性標(biāo)記 缺口平移法缺口平移法 隨機(jī)引物延伸隨機(jī)引物延伸 5 末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法 3-末端填充標(biāo)記法末端填充標(biāo)記法 12隨機(jī)引物標(biāo)記法隨機(jī)引物標(biāo)記法 人工合成的人工合成的68個(gè)核苷酸長的各個(gè)核苷酸長的各種不同排列順序的混合物，它們可以隨機(jī)地種不同排列順序的混合物，它們可以隨機(jī)地互補(bǔ)到互補(bǔ)到DNA

4、探針的某一處，作為引物，在探針的某一處，作為引物，在Klenow片段作用下，合成與探針片段作用下，合成與探針DNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的DNA鏈，當(dāng)在反應(yīng)液中加入鏈，當(dāng)在反應(yīng)液中加入-32PdATP時(shí)，時(shí)，即可形成放射性同位素標(biāo)記的即可形成放射性同位素標(biāo)記的DNA探針，但探針，但探針探針DNA序列是長短不等的。序列是長短不等的。放射形同位素標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)放射形同位素標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn) 檢測特異性強(qiáng)；靈敏度高；對酶促反應(yīng)無任何影響，也不影響堿基配對的特異性和穩(wěn)定性；易造成放射性污染；半衰期短的同位素應(yīng)用受到限制，隨用隨標(biāo)記，立即使用，不能長時(shí)間存放。優(yōu)點(diǎn)：無環(huán)境污染，可較長時(shí)間貯存優(yōu)點(diǎn)：無環(huán)境污染，可較長時(shí)間貯存

5、方法：方法：1.酶標(biāo)記法酶標(biāo)記法 2.化學(xué)標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法要求：標(biāo)記物應(yīng)具有耐熱、對組織細(xì)胞無特異要求：標(biāo)記物應(yīng)具有耐熱、對組織細(xì)胞無特異親和性、分子量小，對探針雜交無影響或影響親和性、分子量小，對探針雜交無影響或影響甚小，不影響甚小，不影響DNA三維空間構(gòu)象的形成。三維空間構(gòu)象的形成。常用的標(biāo)記物：生物素（常用的標(biāo)記物：生物素（biotin）、地高辛）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（）、光生物素（photobiotin）、）、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素、2-乙酰氨基芴（乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）4.3 探針的標(biāo)記方法探針的標(biāo)記方法-非放射性標(biāo)記非放射性標(biāo)

6、記 161. 生物素標(biāo)記核酸探針生物素標(biāo)記核酸探針Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。等。2. 地高辛（地高辛（Dig）標(biāo)記核酸探針）標(biāo)記核酸探針生物素標(biāo)記檢測：利用抗生物素蛋白（卵白素，親生物素標(biāo)記檢測：利用抗生物素蛋白（卵白素，親和素，和素，avidin）、鏈親和素可專一性結(jié)合生物素特）、鏈親和素可專一性結(jié)合生物素特性，將熒光染料、酶（過氧化物酶、堿性磷酸酶）性，將熒光染料、酶（過氧化物酶、堿性磷酸酶）與卵白素或鏈親和素偶聯(lián)，利用熒光染料或酶促反與卵白素或鏈親和素偶聯(lián)，利用熒光染料或酶促反應(yīng)產(chǎn)生的顏色來檢測。應(yīng)產(chǎn)生的顏色來檢測。卵白素

7、或卵白素或鏈親和素鏈親和素酶酶/熒光染料熒光染料顏色反應(yīng)或顏色反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)發(fā)光反應(yīng)地高辛標(biāo)記檢測：利用抗地高辛抗體可專一性結(jié)合，地高辛標(biāo)記檢測：利用抗地高辛抗體可專一性結(jié)合，地高辛的特性，其余方法同生物素檢測。地高辛的特性，其余方法同生物素檢測。生物素生物素（二）（二）Southern BlottingSouthern Blotting1 原理和步驟 將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通

8、過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。（a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組DNADNA酶切酶切硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的同探針同源雜交的基因基因DNA片段片段電泳電泳印記轉(zhuǎn)移印記轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)膜）（轉(zhuǎn)膜）2.Southern2.Southern實(shí)實(shí)驗(yàn)步驟示意圖驗(yàn)步驟示意圖4 Southern的應(yīng)用的應(yīng)用 檢測樣品中的檢測樣品中的DNA插入的拷貝數(shù)，插入的拷貝數(shù)，了解基因的狀態(tài)了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。增重排等。 Sourthern雜交分析轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)（三）（三）Nort

9、hern blottingNorthern blotting1 1發(fā)展發(fā)展 J.C.AlwineJ.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將等人發(fā)展而來，是將RNARNA分子從分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與法。由于這種方法與SourthernSourthern雜交技術(shù)十分類雜交技術(shù)十分類似，所以叫做似，所以叫做Northern blottingNorthern blotting。 2 Northern的應(yīng)用的應(yīng)用檢測樣品中是否有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測樣

10、品中是否有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及其含量。及其含量。SBEIIIWTSBEIII OX WTSBEIII OX 3 檢測基因的表達(dá)水平檢測基因的表達(dá)水平-Northern的應(yīng)用實(shí)例的應(yīng)用實(shí)例（四）原位雜交（四）原位雜交(in situ hybridization)w 將標(biāo)記的核酸探針與將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的細(xì)胞或組織中的核核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。w 特點(diǎn)特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對含不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互

11、關(guān)系及功能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)能狀態(tài)核酸原位雜交的基本步驟核酸原位雜交的基本步驟w A.細(xì)胞或組織的原位雜交細(xì)胞或組織的原位雜交 檢測特異檢測特異mRNA是否存在。是否存在。步驟步驟： 細(xì)胞或組織的固定后置于載玻片上細(xì)胞或組織的固定后置于載玻片上 組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì) 探針的選擇和標(biāo)記探針的選擇和標(biāo)記 雜交雜交 雜交結(jié)果檢測雜交結(jié)果檢測B.菌落或噬菌斑的原位雜交：構(gòu)建基因文庫時(shí)，菌落或噬菌斑的原位雜交：構(gòu)建基因文庫時(shí)，菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到NC膜上進(jìn)行雜交膜上進(jìn)行雜交一、一

12、、 分子雜交簡介分子雜交簡介二、核酸分子雜交技術(shù)二、核酸分子雜交技術(shù)三、三、蛋白雜交技術(shù)蛋白雜交技術(shù)四、生物芯片技術(shù)四、生物芯片技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)三三 Western 印跡法印跡法(Western bloting)w 檢測蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋檢測蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗體白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗體對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法w 主要步驟：主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：NC膜膜靶

13、蛋白的免疫學(xué)檢測靶蛋白的免疫學(xué)檢測 靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng)靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng) 與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)，二抗）反應(yīng)與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)，二抗）反應(yīng) 顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)移與印跡轉(zhuǎn)移與印跡雙抗體檢測雙抗體檢測膜固定蛋白膜固定蛋白第一抗體第一抗體第二抗體第二抗體顯色底物顯色底物有色（發(fā)光）有色（發(fā)光）產(chǎn)物產(chǎn)物三種分子雜交技術(shù)的比較三種分子雜交技術(shù)的比較SouthernNorthernWestern一、一、 分子雜交簡介分子雜交簡介二、核酸分子雜交技術(shù)二、核酸分子雜交技術(shù)三、蛋白雜交技術(shù)三、蛋白雜交技術(shù)四、生物芯片技術(shù)四、生物芯片技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 分子雜交與印跡技術(shù)

14、分子雜交與印跡技術(shù)（一）生物芯片簡介（一）生物芯片簡介1 1 概念概念 采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。3 3 芯片種類芯片種類 按固定分子：按固定分子： 基因芯片基因芯片(Gene Chip)(Gene Chip) 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(Protein Chip)(Protein Chip) 細(xì)胞（組織）芯片（細(xì)胞（組織）芯片（Cell/tissue ChipCell/tissue Chip） 根據(jù)用途根據(jù)用途 信息

15、生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。4 4 芯片特點(diǎn)芯片特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：微型化微型化 ：平方厘米大小，實(shí)驗(yàn)所需試劑用量少：平方厘米大小，實(shí)驗(yàn)所需試劑用量少高通量：一次檢測數(shù)萬個(gè)分子高通量：一次檢測數(shù)萬個(gè)分子自動(dòng)化自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化 ： 傳統(tǒng)方法檢測眾多基因要經(jīng)歷多次實(shí)傳統(tǒng)方法檢測眾多基因要經(jīng)歷多次實(shí) 驗(yàn)，因而每次實(shí)驗(yàn)之間是存在系統(tǒng)誤差的。驗(yàn)，因而每次實(shí)驗(yàn)之間是存在系統(tǒng)誤差的。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 在同一溫度下雜交，不同探針雜交效率不在同一溫度下雜交，不同探針雜交效率不 同。同。5 生物芯片的應(yīng)用w基因表達(dá)水平的檢測基因表達(dá)水平的檢測 w

16、基因診斷基因診斷w藥物篩選藥物篩選w個(gè)體化醫(yī)療個(gè)體化醫(yī)療w測序測序w生物信息學(xué)研究生物信息學(xué)研究芯片制備芯片制備樣品制備樣品制備分子雜交分子雜交檢測分析檢測分析（二）芯片分析基本流程（二）芯片分析基本流程1生物芯片的制作生物芯片的制作玻璃片（最常用的材料）玻璃片（最常用的材料）聚丙烯酰胺板聚丙烯酰胺板金屬片金屬片硅片硅片1.1 1.1 載體的材料載體的材料1.2 1.2 芯片的制作方法芯片的制作方法基因芯片的制基因芯片的制作方式作方式原位合成原位合成直接點(diǎn)樣直接點(diǎn)樣提取DNA或RNA，PCR或RT-PCR擴(kuò)增，摻入熒光染料標(biāo)記。與Northern和Southern雜交的區(qū)別：樣品標(biāo)記而不是探針

17、標(biāo)記2 2 樣品的制備樣品的制備樣品與樣品與DNA芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時(shí)間短，雜交時(shí)間短，30分鐘內(nèi)完成分鐘內(nèi)完成可同時(shí)平行檢測許多基因序列可同時(shí)平行檢測許多基因序列影響雜交反應(yīng)的因素：影響雜交反應(yīng)的因素：鹽濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、鹽濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)3 3 雜交雜交過程類似于一般的雜交法。過程類似于一般的雜交法。1) hybridizeApply sample2) rinse4 4 檢測分析檢測分析w激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒片段發(fā)射熒光光w激光掃描儀或激