硅膠柱層析分離的實(shí)驗(yàn)原理、方法與技巧_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、硅膠柱層析分離的實(shí)驗(yàn)原理、方法與技巧一、硅膠柱層析原理硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得 到分離,一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附,極性較弱的物 質(zhì)不易被硅膠吸附,整個(gè)層析過(guò)程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸 過(guò)程。硅膠柱層析流動(dòng)相極性小的用乙酸乙酯:石油醚系統(tǒng);極性較大的用甲醇:氯仿系 統(tǒng);極性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系統(tǒng);拖尾可以加入少量氨 水或冰醋酸硅膠柱層析慣用方法1. 稱(chēng)量。200-300目硅膠,稱(chēng)30-70倍于上樣量;如果極難分, 也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右,所以要稱(chēng) 40g硅膠,用燒杯量100ml也可以。2. 攪成勻漿。加入干

2、硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油?乙酸乙酯/丙酮體系,就用石油醚拌;如果洗脫劑 是氯仿/醇體系,就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿,說(shuō)明溶劑中含水 量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不與水配伍走分配色譜的話, 必須預(yù)先用無(wú)水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無(wú)水氯化鈣干燥,以除去1%的醇。如果樣品對(duì)酸敏感,不能用氯仿體系過(guò)柱。3. 裝柱。將柱底用棉花塞緊,不必用海沙,加入約 1/3體積石油 醚(氯仿),裝上蓄液球,打開(kāi)柱下活塞,將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi) 隨著沉降,會(huì)有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi),用石油醚(氯仿)將其沖入 柱中。4. 壓實(shí)。沉降完成后,加入更多的石油醚,用雙聯(lián)球或氣泵加壓, 直至流速

3、恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無(wú)論走常壓柱或加壓柱, 都應(yīng)進(jìn)行這一步,可使分離度提高很多,且可以避免過(guò)柱時(shí)由于柱床 萎縮產(chǎn)生開(kāi)裂。5上樣。干法濕法都可以。海沙是沒(méi)必要的。上樣后,加入一些 洗脫劑,再將一團(tuán)脫脂棉塞至接近硅膠表面。 然后就可以放心地加入 大量洗脫劑,而不會(huì)沖壞硅膠表面。6. 過(guò)柱和收集。柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低 的洗脫強(qiáng)度并不好,推薦用梯度洗脫。收集的例子: 10mg上樣量, 1g硅膠H, 0.5ml收一餾分;1-2g上樣量,50g硅膠(200-300目), 20-50ml收一餾分。7. 檢測(cè)。要更多地使用專(zhuān)用噴顯劑,如果僅用紫外燈,會(huì)損失較 多產(chǎn)品,紫外的

4、靈敏度一般比噴顯劑底 1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。8. 送譜。收集的產(chǎn)品旋干,在送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少 或?yàn)橐后w,可過(guò)一小凝膠柱,作為送譜前的最后純化手段??沙?譜1.5ppm左右所謂的 硅膠”峰。、柱層析分離的實(shí)驗(yàn)方法和技巧常說(shuō)的過(guò)柱子應(yīng)該叫柱層析分離, 也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由于柱分的經(jīng)驗(yàn)成分太多,所以下面我就幾年來(lái)過(guò)柱的體會(huì)寫(xiě)些心得,希望能有所幫助。一:柱子可以分為:加壓,常壓,減壓壓力可以增加淋洗劑的流動(dòng)速度,減少產(chǎn)品收集的時(shí)間,但是會(huì) 減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時(shí)候,常壓柱是效率最高的, 但是時(shí)間也最長(zhǎng),比如天然化合物的分離,一個(gè)柱子幾

5、個(gè)月也是有 的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量,感覺(jué)能夠節(jié)省一半甚至更多,但 是由于大量的空氣通過(guò)硅膠會(huì)使溶劑揮發(fā) (有時(shí)在柱子外面有水汽凝 結(jié)),以及有些比較易分解的東西可能得不到,而且還必須同時(shí)使用 水泵抽氣(很大的噪音,而且時(shí)間長(zhǎng))。以前曾經(jīng)大量的過(guò)減壓柱, 對(duì)它有比較深厚的感情,但是自從嘗試了加壓后,就幾乎再也沒(méi)動(dòng)過(guò) 減壓的念頭了。加壓柱是一種比較好的方法,與常壓柱類(lèi)似,只不過(guò)外加壓力使 淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣,雙連球或者小氣泵(給 魚(yú)缸供氣的就行)。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不 可過(guò)大,不然溶劑走的太快就會(huì)減低分離效果。 個(gè)人覺(jué)得加壓柱在普 通的有機(jī)化合物

6、的分離中是比較適用的。二:關(guān)于柱子的尺寸應(yīng)該是粗長(zhǎng)的最好。柱子長(zhǎng)了,相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了, 上樣后樣品的原點(diǎn)就小(反映在柱子上就是樣品層比較?。?,這樣相 對(duì)的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米,而樣品就有二厘米, 那么分離的難度可想而知, 恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。 而如 果樣品層只有 0.5 厘米,那么各組分就比較容易得到完全分離了。 當(dāng) 然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了, 不過(guò)這些成本相對(duì) 于產(chǎn)品來(lái)說(shuō)也許就不算什么了 (有些不環(huán)保的說(shuō), 不過(guò)溶劑回收重蒸 后也就減小了部分浪費(fèi)) ?,F(xiàn)在見(jiàn)到的柱子徑高比一般在 1 : 510,書(shū)中寫(xiě)硅膠量是樣品 量的3040倍,具體

7、的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的 比較開(kāi)(是指在所需組分 rf 在 0.20.4,雜質(zhì)相差 0.1 以上),就可 以少用硅膠,用小柱子(例如200毫克的樣品,用2cmK 20cm的柱 子);如果相差不到 0.1 ,就要加大柱子,我覺(jué)得可以增加柱子的直 徑,比如用 3cm 的,也可以減小淋洗劑的極性等等。三:關(guān)于無(wú)水無(wú)氧柱 適用于對(duì)氧,水敏感,易分解的產(chǎn)品,可以濕柱,也可以干柱。不過(guò)在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次, 因?yàn)槿軇┖凸枘z飽和 時(shí)放出的熱量有可能是產(chǎn)品分解, 畢竟要分離的是敏感的東東, 小心 不為過(guò)。也是因?yàn)榉蛛x的東西比較敏感, 所以接收瓶一定要用可密封 的,遵循 schl

8、enk 操作。至于是加壓、常壓、減壓,隨需而定。因 為是 schlenk 操作,所以點(diǎn)板是個(gè)問(wèn)題,如果樣品是顯色的,恭喜 了,不用點(diǎn)板,直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無(wú)色,只好準(zhǔn) 備幾十個(gè) schlenk 瓶,一瓶一瓶的點(diǎn),不過(guò)幾次之后就知道樣品在 哪,也就可以省些了。像我以前過(guò)一根無(wú)水無(wú)氧柱,需要六個(gè) schlenk ,現(xiàn)在只一個(gè)就能把所要的全收集到。無(wú)水無(wú)氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。 因?yàn)楣枘z中有 大量的羥基裸露在外, 很容易是樣品分解, 特別是金屬有機(jī)化合物和 含磷化合物。 而氧化鋁可以做成堿性、 中性和酸性的, 選擇余地比較 大,但是比硅膠要貴些。聽(tīng)說(shuō)有個(gè)方法,就是用石英

9、做柱子,然后用 HF254 做固定相,這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產(chǎn)品在哪里 了,沒(méi)有驗(yàn)證過(guò)。哪位做過(guò)可以提出來(lái)大家參詳參詳。四:關(guān)于濕法、干法上樣濕法省事, 一般用淋洗劑溶解樣品, 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙 酯等, 但溶劑越少越好, 不然溶劑就成了淋洗劑了。 很多樣品在上柱 前是粘乎乎的, 一般沒(méi)關(guān)系。 可是有的上樣后在硅膠上又會(huì)析出, 這 一般都是比較大量的樣品才會(huì)出現(xiàn),是因?yàn)楣枘z對(duì)樣品的吸附飽和, 而樣品本身又是比較好的固體才會(huì)發(fā)生, 這就應(yīng)該先重結(jié)晶, 得到大 部分的產(chǎn)品后再柱分, 如果不能重結(jié)晶, 那就不管它了, 直接過(guò)就是 了,樣品隨著淋洗劑流動(dòng)會(huì)溶解的。有些樣品溶解性差,

10、能溶解的溶劑又不能上柱 (比如 DMF,DMSO 等, 會(huì)隨著溶劑一起走,顯色是一個(gè)很長(zhǎng)的脫尾) ,這時(shí)就必須用干法上 柱了。樣品和硅膠的量有一種說(shuō)法是 1: 1,我覺(jué)得是越少越好,但 是要保證在旋干后, 不能看到明顯的固體顆粒 (那說(shuō)明有的樣品沒(méi)有吸附在硅膠上)。五:溶劑的選擇當(dāng)然是最便宜,最安全,最環(huán)保的了。所以大多選用石油醚,乙 酸乙酯。 文獻(xiàn)中有寫(xiě)用正己烷的, 太貴了, 除非特別需要不要用不然 銀子嘩嘩的, 流的比淋洗劑還快, 不過(guò)因?yàn)闃O性很小, 有時(shí)還是非它 不可。乙醚也可以用, 但是就是容易睡覺(jué), 注意保持清醒別讓溶劑流 干了,那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的,但是要知道,它和

11、 硅膠的吸附是一個(gè)放熱過(guò)程, 所以夏天的時(shí)候經(jīng)常會(huì)在柱子里產(chǎn)生氣 泡,天氣冷的時(shí)候會(huì)好一些。 甲醇據(jù)說(shuō)能溶解部分的硅膠, 所以產(chǎn)品 如果想過(guò)元素分析的話要留神, 應(yīng)該經(jīng)過(guò)后繼處理, 比如說(shuō)重結(jié)晶等。 其他的溶劑用的相對(duì)較少,要依個(gè)人的不同需要選擇了。 由于某些原因,用到的淋洗劑多是大包裝的(便宜嘛) ,我們這里是 用 10 升或 25 升的塑料桶裝的,就要注意這些工業(yè)品的純度是較低 的。經(jīng)常能夠從送來(lái)的大桶底部看見(jiàn)有色的雜質(zhì), 其他的雜質(zhì)就可想 而知了,所以在比較嚴(yán)格的柱分時(shí)就要對(duì)溶劑重蒸。 當(dāng)然過(guò)原料時(shí)就 可以免去這一步了,反正下面還有提純的方法。另外溶劑在過(guò)柱子后最好也回收使用, 一方面環(huán)

12、保, 另一方面也 能節(jié)省部分經(jīng)費(fèi), 缺點(diǎn)是要消耗一定的人工。 這里要注意的是, 一般 在過(guò)柱同時(shí)進(jìn)行的是減壓旋蒸, 石油醚和乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度 的不同會(huì)導(dǎo)致極性的變化, 一般會(huì)使得極性變大, 在梯度淋洗時(shí)比較 合適,正好極性越來(lái)越大了。 在過(guò)完柱子后, 溶劑最后回收要采用常 壓,因?yàn)樵跍p壓旋蒸時(shí)會(huì)有部分低沸點(diǎn)的雜質(zhì)一起出來(lái), 常壓時(shí)就會(huì) 減少這種現(xiàn)象,如果雜質(zhì)和你下面要過(guò)的樣品有反應(yīng)那就慘了。六:關(guān)于操作問(wèn)題1、裝柱柱子下面的活塞一定不要涂潤(rùn)滑劑,會(huì)被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的, 可以采用四氟節(jié)門(mén)的。 干法和濕法裝柱覺(jué)得沒(méi)什么區(qū)別, 只要能把柱 子裝實(shí)就行。裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密(太密了淋洗

13、劑走的太 慢),一定要均勻 (不然樣品就會(huì)從一側(cè)斜著下來(lái)) 。書(shū)中寫(xiě)的都是不 能見(jiàn)到氣泡, 我覺(jué)得在大多數(shù)情況下有些小氣泡沒(méi)太大的影響, 一加 壓氣泡就全下來(lái)了。當(dāng)然如果你裝的柱子總是有氣泡就說(shuō)明需要多練 習(xí)了。但是柱子更忌諱的是開(kāi)裂, 甭管豎的還是橫的, 都會(huì)影響分離 效果,甚至作廢!2、加樣用少量的溶劑溶樣品加樣, 加完后將下面的活塞打開(kāi), 待溶劑層 下降至石英砂面時(shí), 再加少量的低極性溶劑, 然后再打開(kāi)活塞, 如此 兩三次,一般石英砂就基本是白色的了。 加入淋洗劑, 一開(kāi)始不要加 壓,等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離(24cm就夠了),再加 壓,這樣避免了溶劑(如二氯甲烷等)夾帶樣品快速

14、下行。3、淋洗劑的選擇 感覺(jué)上要使所需點(diǎn)在rf0.20.3左右的比較好。不要認(rèn)為在板上爬高 了分的比較開(kāi),過(guò)柱子就用那種極性,如果 rf 在 0.6,即使相差 0.2 也不容易在柱子上分開(kāi), 因?yàn)橹邮且粋€(gè)多次爬板的狀態(tài), 可以通過(guò) 公式的比較: 0.6/0.8 一次的分離度,肯定不如( 0.2/0.3)的三次方 或四次方大。4、樣品的收集用硅膠作固定相過(guò)柱子的原理是一個(gè)吸附與解吸的平衡。 所以如 果樣品與硅膠的吸附比較強(qiáng)的話, 就不容易流出。 這樣就會(huì)發(fā)生, 后 面的點(diǎn)先出,而前面的點(diǎn)后出。 這時(shí)可以采用氧化鋁作固定相。 另外, 收集的試管大小要以樣品量而定,特別是小量樣品,如果用大試管, 可能一根就收到了三個(gè)樣品, wuwu 。如果都用小試管那工作量又太 大。5、最后的處理柱分后的產(chǎn)品, 由于使用了大量的溶劑, 其中的雜質(zhì)也會(huì)累積到 產(chǎn)品中,所以如果想送分析, 最好用少量的溶劑洗滌一下, 因?yàn)榇蟛?分的雜質(zhì)是溶在溶劑里的,一洗基本就沒(méi)了,必要時(shí)進(jìn)行重結(jié)晶

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