復方青黛飲含藥血清對體外HaCaT細胞增殖和凋亡的影響

1、復方青黛飲含藥血清對體外HaCaT細胞增殖和凋亡的影響來源：互聯(lián)網(wǎng) 更新時間：2009-8-26 10:41:18查看次數(shù)：269復方青黛飲含藥血清對體外HaCaT細胞增殖和凋亡的影響李文彬1，馮捷1，馬慧群1，閆小寧2，張彩晴3摘 要 目的 體外觀察復方青黛飲大鼠含藥血清對人永生化角質(zhì)形成細胞株HaCaT細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響，并探討其作用機制。方法 根據(jù)中藥血清藥理學方法，用SD大鼠制備實驗血清，采用MTT法、流式細胞術(shù)、免疫熒光Hoechst染色，觀察含藥血清對細胞生長抑制率、凋亡率、細胞周期分布及細胞形態(tài)學的影響。結(jié)果體外培養(yǎng)HaCaT細胞24h 和48 h后，復方青黛飲高、中

2、、低三個劑量不同濃度的含藥血清組，對HaCaT細胞的生長均有不同程度的抑制，與空白血清組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），其中高劑量組抑制作用最明顯。復方青黛飲含藥血清組細胞凋亡率和G0/G1比例明顯增加，與空白血清組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），在鏡下呈現(xiàn)凋亡的特征性形態(tài)改變。結(jié)論 復方青黛飲大鼠含藥血清對體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞株HaCaT細胞有生長抑制和誘導凋亡作用，并對細胞周期有一定的影響。關(guān)鍵詞 復方青黛飲；含藥血清；HaCaT細胞；增殖；凋亡中圖分類號 R 758.63    文獻標識碼 A   文章編

3、號 1001-7089（2009）08-0469-03Effects of Compound Indigo Naturalis Decoction Serum on Proliferation and Apoptosis  of HaCaT Cells In VitroLI Wen-bin1， FENG Jie1， MA Hui-qun1 , YAN Xiao-ning2， ZHANG Cai-qing3（1 Department of Dermatology, Second Affiliated Hospital of Medical School, Xian Jiaotong U

4、niversity, Xian 710004, China；2 Department of Dermatology, Shaanxi Traditional Chinese Medical Hospital, Xian 710004, China；3 The 323 PLA Hospital，Xi'an 710054, China）Corresponding author FENG Jie, e_mail:boergeAbstract：Objective To investigate the mechanism of compound indigo naturalis decoctio

5、n in treating psoriasis, we observed the effect of inactivated mouse serum containing compound indigo naturalis decoction on the proliferation, apoptosis, and cell cycle of HaCaT cell in vitro. Methods The experimental animal serum was taken from SD rats and was inactivated before the experiment on

6、the base of the serum pharmacology method. Then the serum at different concentration of compound indigo naturalis decoction serum was added to HaCaT cell. The control was set meanwhile.The cell growth was evaluated by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The cell cycle distribution and cell apo

7、ptosis were measured by flow cytometry. The cell morphology was observed by Hoechst staining under fluorescence microscope. Results After coculture for 24h, 48h, compared with the blank group, the cell proliferation of HaCaT was inhibited significantly in high dose, medium dose, low dose groups（P<

8、;0.05）. Compared with that of the blank group, the cell apoptotic rate and cell percentage in G0/G1 phase obviously increased in high dose, medium dose, low dose groups（P< 0.05）. At the mean time, the distinctive apoptotic morphology was observed. Conclusion We concluded that compound indigo natu

9、ralis decoction serum not only inhibited the proliferation of HaCaT cells, butalso significantly induce apoptosis. Affecting cell cycle might contribute to the mechanism.Key words： Compound Indigo NaturalisYin；Drug serum；HaCaT cells；Proliferation；Apoptosis銀屑病是一種常見易復發(fā)的慢性炎癥性皮膚病，對患者的身心和生活質(zhì)量均造成一定程度的影響。復

10、方青黛飲是本科經(jīng)多年臨床實踐總結(jié)的治療銀屑病的經(jīng)驗用方，對中醫(yī)辯證分型“血熱型”療效顯著。由于中藥成分復雜，其具體作用機制不明，本實驗以人永生化角質(zhì)形成細胞株HaCaT細胞為研究對象，對復方青黛飲治療銀屑病的作用機制進行探討。1 材料和方法 1.1 實驗材料 SD雄性大鼠40只，清潔級，體重200±20g (購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物學中心)，人永生化角質(zhì)形成細胞株HaCaT細胞（張彩晴博士惠贈），復方青黛飲（組分：由青黛、貫眾、紫草、蒲公英、馬齒莧、丹參、白芷、焦山楂、建曲、五味子等組成，生藥購自西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院藥房，水煎制成含生藥量為1.85g/mL的藥液，2

11、000r/min離心，取上清，置-4冰箱保存)。1.2 主要實驗試劑 DMEM購自美國 Invitrogen公司，胎牛血清購自杭州四季青生物公司，MTT試劑盒購自美國 Sigma公司， Hoechst33258試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，AnnexinVFITC試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。1.3 實驗方法 1.3.1 復方青黛飲含藥血清的制備 選用正常SD大鼠30只，禁食12h后予2.0mL復方青黛飲煎液灌胃給藥，大鼠隨機分為高、中、低三個劑量組，每組10只，給藥劑量（折合生藥）為高劑量組60.18g/kg，中劑量組為30.9g/kg，低劑量組為15.45g/kg（分別相當于成人

12、臨床推薦劑量的20倍、10倍和5倍），均2次/d，連續(xù)3d，末次給藥1h后乙醚麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，靜置3h，3 000r/min離心10min；取血清，滅活后0.22m過濾除菌，-20冰箱保存?zhèn)溆谩?.3.2 空白血清的制備 正常SD大鼠10只，禁食12h后，用生理鹽水灌胃，灌胃方式和滅活血清獲得方法同上。1.3.3 細胞培養(yǎng) HaCaT細胞接種于含10%胎牛血清，100U/mL青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37、5%CO2孵箱培養(yǎng)。1.3.4 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)期生長的HaCaT細胞以1.0×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100L；24h后棄培養(yǎng)液，

13、加入高、中、低3種劑量含藥血清和正常血清，各組設(shè)5%，10%，20%，40%，80%不同血清濃度，每孔均為100L，設(shè)6個復孔；分別于培養(yǎng)24h和48h時，每孔加入10L MTT(5mg/mL)，孵育4h，棄上清，每孔加入DMSO 100L，沉淀充分溶解后，用酶標儀測定570nm波長下OD值，生長抑制率（1實驗組OD值/空白組OD值）×100%。1.3.5 細胞凋亡形態(tài)觀察 用細胞爬片法，將無菌蓋玻片放入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入1.0×104/mL細胞，待細胞爬片面積超過70%時，棄培養(yǎng)液，加入各組實驗血清，每組設(shè)3個復孔； 48h后，按Hoechst 33258試劑盒說明

14、書進行染色，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并拍照。1.3.6 流式細胞儀術(shù)對細胞的凋亡和細胞周期的檢測 細胞培養(yǎng)48h后，0.25%胰酶消化，離心收集細胞2.0×106/mL，按試劑盒說明書對細胞進行染色，并用流式細胞儀檢測。1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 12.0軟件。實驗結(jié)果用(x±s)表示，組間比較采用oneway ANOVA和LSD t檢驗，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 含藥血清對HaCaT細胞增殖的抑制作用 單因素方差分析顯示，除24h、5%血清濃度外，各劑量組對HaCaT細胞增殖抑制率比較，差異無統(tǒng)計學意義，余各血清濃度的各劑量組對

15、HaCaT細胞增殖抑制率之間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；經(jīng)LSDt檢驗，除24h、5%血清濃度的中、低劑量組外，各劑量組與空白血清組比較，中、低劑量組與高劑量組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05），其中高劑量組作用最明顯，24h最大抑制率為48.29%， 48h最大抑制率為59.34%（圖12）。含藥血清不同濃度組相比較，對HaCaT細胞增殖抑制作用結(jié)果顯示，5%，10%，20%各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）；LSD t檢驗提示隨著血清濃度的增加和時間的延長，抑制作用也隨之增強（P< 0.05）。20%，40%，80%不同血清濃度組之

16、間對細胞的增殖抑制率經(jīng)單因素方差分析，無統(tǒng)計學意義，提示含藥血清濃度達到20%后，其抑制作用不能隨血清濃度的增加而增強，因此在后續(xù)實驗中含藥血清濃度選擇為20%（圖12）。2.2 20%含藥血清各劑量組對HaCaT細胞周期和凋亡的影響 高、中、低劑量組和空白血清組相比較，HaCaT細胞的G0/G1期細胞比例增加（P< 0.05），S期細胞比例減少，G2/M期比例減少（P< 0.05），提示含藥血清可以抑制HaCaT細胞由G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，其中高劑量組的作用最為顯著（表1，圖3a，3b）。和空白血清組相比，高、中、低劑量組均可誘導HaCaT細胞發(fā)生凋亡（P<

17、0.05）；中、低劑量組與高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），其中高劑量組的作用最為顯著（表1，圖3c，3d）。2.3 細胞形態(tài)學觀察 作用48 h后，20%含藥血清各劑量組在光鏡下均可觀察到細胞的生長受到不同程度的抑制，單位面積數(shù)目減少、細胞變圓、變小、漂浮。Hoechst 33258染色后，熒光顯微鏡下可見細胞核聚集、邊緣化、核碎裂等典型細胞凋亡形態(tài)(圖4)。表1 48h后20%含藥血清對HaCaT細胞周期和凋亡的影響 (x±s,%)Tab. 1 Effects of 20% drug serum after 48h on cell cycle and apo

18、ptosis of HaCaT cells (x±s,%)GroupnG0/G1SG2/MApotosis rateshigh dose357.60±3.17*30.82±1.01*11.58±0.25*49.36±5.78*medium dose348.52±1.99*#35.91±0.87*15.57±0.10*29.14±2.43*#Low dose339.71±2.02*#44.33±1.54*#15.96±0.43*11.43±1.14*#Blank319

19、.89±1.0358.52±1.3321.30±2.923.01±0.15*P<0.05; vs blank group; #P<0. 05 vs high dose group. *P<0.05 vs blank group圖1 24h后各組不同濃度含藥血清的抑制率Fig.1Inhibition rates of different concentration drug serum after 24h ours in each group，#P<0.05 vs high dose group圖2 48h后各組不同濃度含藥血清的抑

20、制率Fig.2 Inhibition rates of different concentration drug serum after 48h ours in each group 圖3 48h后20%含藥血清對HaCaT細胞周期和凋亡的影響Fig.3 Effects of 20% drug serum after 48h on cell cycle and apoptosis of HaCaT cells 圖4 免疫熒光Hoechst 33258染色 ×200Fig.4 Immunofluorescence Hoechst 33258 staining 

21、15;2003 討論研究表明銀屑病組織病理表現(xiàn)為表皮基底層的角質(zhì)形成細胞增殖加速，同時存在細胞凋亡的異常，臨床表現(xiàn)為表皮異常增殖與脫屑1。目前許多治療藥物，如維A酸類和卡泊三醇，金屬蛋白酶抑制因子均在一定程度上抑制了角質(zhì)形成細胞增殖，同時又誘導了凋亡而發(fā)揮治療作用2,3。復方青黛飲對“血熱型”銀屑病臨床療效滿意，本研究以HaCaT細胞為靶細胞，從細胞增殖、凋亡和細胞周期方面對該方治療銀屑病的機理做了初步探討。利用中藥含藥血清制備實驗動物模型是目前研究中藥復方藥理作用常用的一種實驗方法。本研究根據(jù)文獻4制備含藥血清，為了避免實驗動物自身血清中的免疫活性物質(zhì)的影響和細胞培養(yǎng)的血清要求，選擇制備了大

22、鼠含藥滅活血清和正常滅活血清5，并觀察了含藥血清對HaCaT細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。實驗結(jié)果表明高、中、低3個劑量組和對照組相比，對HaCaT細胞均有不同程度的生長抑制作用，藥物作用隨著劑量的增加和作用時間的延長而增強。根據(jù)MTT實驗結(jié)果，本研究選擇20%含藥血清觀察了不同劑量組對HaCaT細胞凋亡和細胞周期的影響，結(jié)果表明復方青黛飲含藥血清可以誘導HaCaT細胞發(fā)生凋亡，并可將細胞周期阻止于G0/G1期。在細胞周期中，G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化和S期向G2/M轉(zhuǎn)化是細胞增殖的兩個重要調(diào)控點，提示復方青黛飲可能通過抑制細胞DNA的合成來抑制細胞的增殖。到目前為止，大量研究表明6 7，許多具有多種免疫學活性的細胞因子如TNF-、IL-23、單核細胞趨化和激活因子（MCAF）等參與銀屑病病理相關(guān)的免疫過程，并進一步引起T淋巴細胞和中性粒細胞的活化及趨化，角質(zhì)形成細胞的過度增殖。從而導致銀屑病的發(fā)病。本研究顯示復方青黛飲可能通過抑制角質(zhì)形成細胞增殖和誘導凋亡來治療銀屑病，但是否以免疫活性物質(zhì)為介質(zhì)發(fā)揮作用，以及其誘導凋亡的具體作用途徑仍有待進一步研究。 參考文獻 1 WRONESMITH T, MITRA RS, THOMPSON